이 프로토콜은 우리가 연구를 위해 질병, 분자 결함 및 면역 학적 결함이있는 환자로부터 림프구 T 세포를 분리 할 수있는 능력을 허용합니다. 이 방법을 사용하면 생존 가능한 세포, RNA, DNA 및 단백질을 이러한 환자로부터 정제하기위한 질병 이상을 가진 세포를 분리 할 수 있으며 분자 결함을 특성화하여 병인에 중요한 경로 이상을 이해할 수 있습니다. 이 방법은 정상 상태의 혈액 세포뿐만 아니라 면역 이상이있는 질병으로부터 혈액 세포를 연구하기 위해 추가로 분획 될 수있는 말초 혈액의 분리에 유용합니다.
이 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 의대생 연구원 인 Alanna가 될 것입니다. 항응고제가 들어있는 5 밀리리터 튜브에서 말초 혈액 샘플을 얻은 후, 10 ~ 15 밀리리터의 혈액을 피험자 번호로 표시된 50 밀리리터 분리 튜브로 옮기고 샘플을 적어도 두 배로 희석하지만 HBSS로 튜브 당 35 밀리리터 이하로 희석하십시오. 튜브 당 약 13 밀리리터의 밀도 매체로 조심스럽게 천천히 혈액을 밑에 깔고 피펫이 거의 비어있을 때 피펫팅을 멈추어 거품을 방지하십시오.
피펫을 천천히 제거하여 혈액과 밀도가 높은 매질층이 혼합되지 않도록 하고 채워진 분리관을 층을 방해하지 않고 원심분리기로 조심스럽게 옮깁니다. 원심분리에 의해 세포를 분리한 후, 상층을 함유하는 플라즈마의 마지막 10 밀리리터를 제외한 모든 것을 제거한 후, 조심스럽게 그리고 천천히 버피 코트를 수집하였다. 두 개의 분리 튜브 사이에서 버피 코트를 단일 라벨이 붙은 멸균 50 밀리리터 튜브에 풀링하고 신선한 HBSS로 PBMC를 튜브 당 총 50 밀리리터로 적어도 두 배 희석하십시오.
모든 버피 코트가 수집되었을 때, 원심분리에 의해 세포를 펠릿화하고 각 튜브로부터 가능한 한 많은 상청액을 제거한다. 튜브 바닥을 탭하여 펠렛을 느슨하게하고 튜브 당 원래 10 밀리리터 혈액 샘플 부피 당 1 ~ 두 밀리리터의 ACK 용해 버퍼에 펠렛을 재현탁하십시오. 정확히 5 분 후, HBSS의 동일하거나 더 큰 부피로 각 튜브에서 용해를 중단하고 각 부피를 50 밀리리터로 조정하십시오.
원심분리 후, 상층액을 버리고, 동일한 공여체로부터 세포를 풀링하고, 또 다른 원심분리를 위해 신선한 HBSS로 최대 50 밀리리터의 부피를 가져온다. 그런 다음 세포를 계수를 위해 섭씨 37도 RP 10F 배지 10밀리리터에 재현탁시킨다. CD4+CD45RO+T 세포 정제를 위해, 세포를 스핀다운하고 PBMC를 선택 완충액 농도의 밀리리터당 7번째 세포에 5배 10배로 희석한다.
세포를 5 밀리리터의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브로 옮기고 부드러운 혼합으로 샘플 한 밀리리터 당 50 마이크로 리터의 항체 칵테일을 첨가하십시오. 실온에서 5 분 후, 30 초 동안 고속으로 자성 입자를 와류시킨 다음 샘플 한 밀리리터 당 50 마이크로 리터의 자성 입자를 부드럽게 혼합하여 튜브에 첨가합니다. 신선한 선택 버퍼와 부드러운 혼합으로 부피를 2.5 밀리리터로 가져 와서 튜브를 자석에 2.5 분 동안 놓습니다.
인큐베이션이 끝나면 자석을 집어 들고 튜브를 하나의 연속 운동으로 반전시켜 농축 된 세포 현탁액을 새로운 멸균 튜브로 데컨팅하십시오. 세포 회수율을 높이려면 고정화된 비드를 방해하지 않고 튜브에 2.5밀리리터의 선택 버퍼를 넣고 자석 상에서 2.5분간 추가로 배양한 다음 세척 튜브에 세척한 다음 혈구분석기를 사용하여 생존 가능한 세포의 수를 계수하고 유세포 분석기로 세포 순도를 확인합니다. 세포를 활성화시키려면, CD4+CD45RO+T 세포를 섭씨 37도 RP 10F 배지 농도의 밀리리터당 6배 10배 세포로 조정하고 적절한 크기의 배양 접시에 세포를 시드한다.
세포를 가습 된 섭씨 37도, 5 % 이산화탄소 배양기에서 하룻밤 동안 쉬게하십시오. 다음날 아침, 원심분리에 의해 휴지된 세포를 수집하고, 펠렛을 섭씨 37도 RP 10F 배지 농도의 밀리리터당 여섯 번째 세포에 5회 10 내지 5회 재현탁시켰다. 현탁액을 세 개의 멸균 스크류 캡 튜브 각각에서 여섯 번째 세포 분취량을 10 내지 5 내지 10배로 분할하고, PMA로 튜브 2 및 튜브 3에서 세포를 A23187과 부드럽게 혼합하여 자극한다.
첫 번째 튜브에 동일한 부피의 디메틸 설폭사이드를 추가하여 차량 제어 역할을 수행하고 캡이 느슨한 튜브를 적절한 활성화 기간 동안 인큐베이터에 배치하십시오. 배양이 끝나면 원심분리로 세포를 수집하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상층액을 버립니다. 그런 다음 상업적으로 이용 가능한 RNA 분리 키트의 지시에 따라 세포를 용해시키고 제조자의 지시에 따라 RNA를 분리하십시오.
이 음성 선택 프로토콜에 의해 얻어진 CD4+CD45RO+T 세포의 생존력 및 순도는 지속적으로 높다. SS PBMCs로부터 백혈구 환원 시스템 챔버로부터 수득된 CD4+CD45RO+T 세포의 수율은 정상 공여자 PBMCs로부터의 약 16%에 비해 전형적으로 약 75%이다. SS 기억 T-세포 및 SS PBMCs는 정상 공여자 T 세포 및 PBMC로부터의 세포와 비교하여 저조하게 발현된 사이토카인 및 다른 면역 반응 유전자이다.
또한, 정상 공여자 T 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 많은 유전자는 휴식 및 자극 후 둘 다에서 SS T 세포에서 고도로 발현된다. 좋은 멸균 기술과 일관된 루틴은이 기술의 성공을 위해 정말로 중요합니다. 또한 Ficoll을 레이어링하는 동안 미세 제어 기능이 있는 자동 피펫을 사용하고 Ficoll을 내려놓는 속도에 주의를 기울이는 것도 정말 중요합니다.
이 방법을 사용하여 분리된 세포는 생존 가능하며 독성 연구, 신호 전달 경로의 특성화를 위한 분자 생화학적 연구, 유세포 분석 및 유전자 발현 연구에 사용될 수 있다. 이 방법은 질병을 앓고있는 환자, 염증성 질환 및 직접 연구를 위해 암과 같은 다른 질병으로부터 세포를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이들 질환의 예는 건선 및 아토피성 피부염을 포함한다.
