이 방법은 클로스트리듐 감염에서 타고난 면역 체계의 역할에 대 한 주요 질문에 대답할 수 있습니다., 대식 세포가 인식 하거나 phagocytose이 병원 체. 이 방법의 주요 장점은 많은 상이한 혐기성 박테리아에 적용될 수 있고, 감염 시간을 조작할 수 있으며, 경구 투여가 정상적인 인간 감염을 훨씬 더 가깝게 나타낸다는 것입니다. 배양 후, 배양의 1 밀리리터를 분광광계 큐벳으로 옮기고 OD600을 측정한다.
필요한 금액을 1.5밀리리터 튜브로 전송하여 최종 부피 1밀리리터에서 1-1.2의 최종 OD에 도달합니다. 1X PBS 1밀리리터, 원심분리기는 실온에서 3분간 5, 000배g으로 1회 세척합니다. 1X PBS의 1밀리리터로 재중단.
1 밀리리터 세균 현탁액에 준비된 형광염의 작동 용액 3개를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 샘플을 배양하십시오. 그 후, 스테인드 클로스트리디노이드 디피실을 1X PBS로 한 번 세척하여 잔류 염료를 제거하고 1X PBS의 1밀리리터로 재보설하여 1.0의 OD600을 달성한다.
먼저, 페트리 접시에 제브라피쉬 애벌레에 0.8% 낮은 녹는 아가로즈를 놓습니다. 애벌레를 측면 위치로 부드럽게 조정합니다. 페트리 접시를 얼음 위에 30~60초 간 놓아 저융 아가로즈가 굳어지도록 합니다.
아가로즈를 커버하기 위해 0.02%에서 0.04%의 트리카인을 함유한 30%의 다니오의 배지를 추가합니다. 사출 용액을 준비하려면 PBS 용액에 0.5%페놀 레드의 마이크로리터 1개를 염색된 클로스트리디로이드 디피실 디피실 의 9마이크로리터에 넣습니다. 마이크로 로더를 사용하여 주입 용액으로 보정 된 미세 주입 바늘을로드합니다.
로드된 바늘을 미세 조작기에 장착하고 스테레오 현미경으로 배치합니다. 600에서 900 헤코토퍼스칼 사이의 사출 압력을 조정합니다. 0.5 ~ 1.0 나노리터를 얻기 위해 주입 시간을 0.1 ~ 0.3초로 설정합니다.
약 45도 각도로 미세 조작기의 바늘을 설정하여 임베디드 유충을 향합니다. 비뇨 생식기 공막 에 가까운 위장관 위에 바늘 끝을 놓습니다. 아가로즈를 관통한 다음 바늘 끝으로 근육을 관통합니다.
그런 다음 장 루멘에 삽입하고 클로스트리디노이드 디피실의 0.5 ~ 1.0 나노 리터를 주입하십시오. 형광 현미경을 사용하여 주입된 애벌레를 모니터링하고 유연한 마이크로로더 팁을 사용하여 공초점 이미징을 위해 제대로 주입된 애벌레를 픽업합니다. 홈이 있는 1.5%의 아가로즈 플레이트에 0.8% 낮은 녹는 아가로즈를 제브라피시 애벌레에 놓아 덮습니다.
홈과 꼬리의 45도 각도에서 머리를 똑바로 향하여 애벌레를 홈의 벽에 부드럽게 조정합니다. 아가로즈를 통해 바늘을 부드럽게 작동한 다음 식도를 통해 얼룩말 물고기 애벌레의 입으로 부드럽게 작동합니다. 바늘의 끝이 전방 장 전구 안에 들어가면 주사 페달을 눌러 박테리아 배양의 0.5 ~ 1 나노 리터를 방출하십시오.
장의 루멘을 채웁니다. 식도 나 클로카에서 넘쳐 나오지 마십시오. 얼룩말의 입에서 바늘을 부드럽게 철회합니다.
gavage 다음, 먼저 아가로즈를 잘라서, 다음 애벌레를 들어 올려 유연한 마이크로 로더 팁으로 아가로즈에서 감염된 제브라피스 애벌레를 구출. 이 애벌레를 멸균 30% Danieau의 배지로 옮기고 두 번 헹구세요. 얼룩말 물고기 애벌레를 마취 한 후, 마취 유충을 커버하기 위해 1 % 낮은 녹는 아가로즈의 200 ~ 300 마이크로 리터를 추가합니다.
가능한 한 유리 슬라이드에 대해 애벌레의 감염된 부위를 가깝게 놓습니다. 아가로즈가 얼음 위에 30~60초 동안 굳어지게 합니다. 아가로즈를 30%의 다니오의 매체로 잠급하여 0.02%에서 0.04%의 트리카인을 함유하고 있습니다.
공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 애벌레를 이미지화합니다. 감염된 제브라피쉬 유충을 안락사한 후, 제브라피시 유충을 머리 가까이에 있는 제브라피쉬 애벌레의 등갈 트렁크에 바늘을 삽입하여 제브라피시를 고정시하십시오. 랜싯으로 아가미 뒤의 머리를 제거합니다.
등대 트렁크 의 중간에 두 번째 바늘을 삽입합니다. 제3 바늘을 제브라피쉬의 복부에 삽입하고 내장을 신체 구멍에서 끌어냅니다. 10~15개의 내장을 멸균 1X PBS 200 마이크로리터를 포함하는 1.5밀리리터 튜브로 옮기는 미세 주입 바늘을 사용한다.
조직을 방해하고 균질화를 준비하기 위해 위장으로 내장을 균질화하십시오. 유봉이 튜브 의 바닥에 도달하여 모든 내장을 완전히 방해하도록하십시오. 균질에, 클로스트리디오이드 디피틸을 첨가하여 D-cycloserine및 세폭시틴을 함유하고, 타우로콜린산유무드, 혐기성 챔버에서 배양한다.
이 연구에서는 호중구와 대식세포가 감염 부위에 도달합니다. 활성화된 대식세포 phagocytizing 2개의 박테리아의 예는 표기된 클로스트리디오이드 difficile의 phagocytosis 및 소화에 의한 청산을 보여줍니다. 5일 후 비옥식 후 대식세포 및 호중구 리포터 라인의 장 루멘에 형광 라벨이 부착된 클로스트리디노이드 디피실을 전달하는 마이크로가게이지는 클로스트리디노이드 디피실 감염의 자연적인 경로를 모방한다.
그러나, 호중구와 대식세포는 microgavage 후에 12 시간까지 위장관에 명백한 이주를 보여주지 않았습니다. 그 동안, 라벨 클로스트리디로이드 difficile의 형광은 약 5 시간 후에 사라졌다 microgavage 후에. 감염 후 24시간 장 내 시료가 해부되었고 세균성장을 보였다.
대조군에서 박테리아가 자라지 않았습니다. 나중에, 인큐베이션된 견본은 TCA를 포함하는 매체에서만 성장했습니다, 창자에 있는 총 클로스트리디노이드 difficile가 포자를 형성했다는 것을 건의합니다. 16S rDNA PCR은 성장한 박테리아를 클로스트리디로이드 디피실로 확인하여 예측 가능한 크기의 특정 PCR 앰플리콘을 약 800개의 기본 쌍을 생성합니다.
CHROMID 플레이트에 자란 박테리아 배양은 전형적인 검은 식민지로 나타났으며, 이는 얼룩말 피시 장의 박테리아가 클로스트리디노이드 디피실임을 더욱 나타냈다. 혐기성 박테리아와 함께 작업하는 것은 물론 박테리아의 생물학에 영향을 미치기 때문에 호기성 단계가 짧게 유지될 것을 요구합니다. 제브라피시의 타고난 면역 세포를 조작할 수 있습니다.
예를 들면, 그(것)들은 감염에 타고난 면역 세포 반응의 기계장치를 해독할 수 있습니다. 우리의 방법은 제브라피쉬가 인간의 창자에서 혐기성 병원체를 연구하는 도구가 될 수 있음을 지적했습니다. 다중 내성 병원균으로 작업하려면 적절한 안전 조치를 취해야 합니다.
