저자는 도움이 토론에 대한 각각 tdTomato와 사비의 발현을 허용 pTEC27과 pTEC15의 관대 한 선물을 사러 - 클로드과 L. 라마 크리슈를 제공하는 케이 Kissa에 감사드립니다. 프랑스 국립 연구 기관의 프로젝트 (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009과 DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) 및 유럽 공동체의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램의이 작품의 일부를 형성 (FP7-사람들-2011-ITN) 부여 계약에 따라 NO. PITN-GA-2011-289209 마리 퀴리 초기 교육 네트워크 FishForPharma합니다. 우리는 CM 듀폰에 자금을 지원하기위한 협회 그레고리 Lemarchal 및 Vaincre 라 Mucoviscidose (RF20130500835)을 감사하는 것이 좋겠다.

The authors have nothing to disclose.

제브라 피쉬는 최근 실시간 (36)의 넓은 필드와 공 촛점 이미징을 사용하여 세균 감염의 역학을 공부하는 우수한 척추 동물 모델 시스템으로 떠오르고있다. 함께 마이크로 주입 방법 (프로토콜 4)와 분산 마이코 박테리아 현탁액 (프로토콜 2.2)의 조합은 재현 전신 감염, 후속 모니터링 및 호스트 식세포와 세균의 상호 작용에 특별한 초점을 맞춘 감염의 진행의 시각화 할 수 있습니다. 엠의 독성 생체 내 농양은 야생형 골든 지브라 피쉬 (37)의 사용 덕분에 조사 될 수있다. M. 사이의 상호 작용을 연구하는 19 대 식세포를 시각화 : 농양 및 골수 세포를 호스트는 여러 형질 전환 지브라 피쉬 라인의 Tg (mCherry MPEG1) 등을 사용할 수있다. (38) 또는 Tg는 (lyz :을 DsRed) 39w : 예 등의 Tg (GFP MPX) 등의 추가 유전자 변형 기자 라인i 번째의 어느 적색의 호중구 녹색, 각각, 또한 감염에 반응하여 이들의 과립구 특정 역할을 해결하기 위해 사용될 수있다. M.의 농양, 특히 R 변이체, 따라서 재생 가능한 마이크로 인젝션을 방지 대규모 세균성 응집체를 형성하는 19 자연스러운 성향을 나타낸다. 또한, S 변이체보다 그 사실 R 변이체 형태 훨씬 큰 덩어리는 또한 두 동질 변형에 대한 병원성 표현형의 전위를 비교 배제한다. 제 2 항에 기재된 프로토콜은 균질 구하고 M. 분산 허용 배아에 미세 주입 농양 현탁액. 이 제제는 과도한 응집 특성을 표시하는 임의의 다른 미코 박테리아 종 또는 변이주에 적용될 수있다. 초음파 처리하는 단계는 최 미코 박테리아 세포벽 층을 변경할 수 있으므로주의가 E의 세균이 생존에 물리적 처리의 영향을 평가하기 위해 취해 져야한다새로운 변형을 ACH. 세균 부담의 결정은 일상적 프로토콜 6.1에 기술 된 바와 같이, 다양한 시점 후 감염에 선택적 한천 배지에 용해 배아를 도금 후 계산 CFU에 의존한다. 이 절차는 여러 제한 사항을 포함한다 : 동물을 안락사 때문에, 각각의 배아 (또는 배아의 그룹)이 단일 시점의 결정을 위해 사용될 수있다. 또한,이 방법에 의한 살해 중에 용해 및 / 또는 손실 된 박테리아 연속 희석액의 큰 비율로, 또는 응집에 의해 주로 부정확 남아있다. CFU를 계산하는 것은 힘든 작업입니다. 대안으로, 프로토콜 6.2 M.를 정량화 할 수있는 효율적인 방법을 기술 M. 위해 원래 개발 된 바와 같이, 화소 정량 감염 배아의 형광 이미지의 분석에 기초하여, 제한된 처리 단계, 농양 부담 marinum 40, 41. 입자의 분석에 기초하여,이 FPC 방법은, 상관 관계를 도시 wCFU의 countings 번째. 유사하게, 형광 현미경 및 정량화를 조합하여, 배아 당 선천성 면역 세포 수의 상대적인 변화는 적절한 트랜스 제닉 라인을 사용하여 이미지 분석에 의해 정량화 될 수있다. 제브라 피쉬 배아 악영향 M.에 응답하여 호스트의 생존에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다 감염 대 식세포 공핍 동안 면역 세포의 역할을 평가하기 위해 사용될 수있다 농양 감염. 특정 식세포 고갈 효율적의 Lipo-클로드 기반 프로 시저 (프로토콜 5.1) 또는 모르 폴리 노 - 기반 프로 시저 (프로토콜 5.2)를 사용하여 생성 될 수있다. 대 식세포의 존재가 확립 및 혈관계의 정정 배아 발달에 대한 유지 보수를 위해 매우 중요하기 때문에, 그럼에도 불구하고, 그것은의 Lipo-클로드로 네이트를 사용하여 HPF (24)에서 대 식세포를 생산 브레이션 권장된다. 제브라 피쉬 배아 M.를 연구 할 수있는 독특한 모델로 나타납니다 농양 감염과 extracell의 역할울라 면역 체계 파괴 전략으로 cording. 결정은 M.에 cording을 제어하는 경우 농양이 식별 될 수 있고, 그들은 혁신적인 치료법의 개발로 이어질 수있다. 혁신적인 높은 처리 기술 (42)와 함께 제브라 피쉬의 사용을 연결하면 신약 개발이 약제 내성 병원체에 대한 새로운 약물 학적 접근 방법에 필드를 엽니 다.

미코 농양은 인간의 임상 증후군의 넓은 스펙트럼을 일으키는 새로운 병원균이다. 이러한 피부 감염뿐만 아니라 심각한 만성 폐 감염, 주로 면역 및 낭포 성 섬유증 환자 1,2,3,4에서 발생을 포함한다. M.를 농양은 인간의 원내 및 인성 감염을 담당하는 주요 빠르게 성장하는 마이코 박테리아 종으로 간주된다. 또한, 몇 가지 최근의 보고서는 가능성을 강조하는 M. 농양은 혈액 - 뇌 장벽을 통과하여 중추 신경계 (CNS) 5,6- 중요한 병변을 유도 할 수있다. 빠른 재배자, M.를 임에도 불구하고 또한 농양 전시 육아 종성 구조 내에서 년 동안 묵비권과 폐 7 caseous 병변을 생성 할 수있는 능력을 포함하여 결핵균의 그와 관련된 여러 가지 병원성 기능. 더 놀라운 낮은 센입니다엠의 sitivity 항생제에 농양, 상당한 치료 실패율 8,9로 이어지는 치료하기가 매우 어렵습니다 이러한 감염을 렌더링. 이 종의 중요한 위협은 주로 주요 공중 보건 기관 (10)에 관심과 폐 이식 (11)에 대한 금기 사항이다 항생제에 고유의 저항이다. M. 농양 표시 다른 임상 결과로 이어질 부드러운 (S) 또는 거친 (R) 식민지 형태 형. S 균주 달리, R 박테리아 로프 또는 끈형 구조 (12, 13)로 이어지는 단으로 성장하는 경향이있다. 세포 또는 동물 중 모델을 기반으로 여러 독립적 인 연구는 연구의 하이퍼 독성 표현형은 14, 15를 morphotype 밝혔다. 역학 연구, M.의 가장 심각한 경우 가입일 농양, 폐 감염이 연구와 관련이있는 것으로 나타납니다하는 유일한 변형 16 개의 변종이감염된 호스트 3 년 동안 지속하는 것으로 나타났습니다. morphotype 차이는 표면 관련 glycopeptidolipids (GPL) 12 (S)에 존재 또는 (R)에서 손실에 의존한다. 그러나, 현재 이용 가능한 셀룰러 / 동물 모델의 본질적인 한계는 M.에 의한 연구를 사용 농양 감염, R 또는 S 변종의 병태 생리 학적 사건에 대한 우리의 지식은 불분명 남아있다. 정맥 또는 에어로졸 경로를 통해 면역 능력이 쥐의 감염은 지속적 감염 및 생체 내 약물 감수성 검사 (17)에 대해 연구하는 마우스의 사용을 방해, 일시적 식민지로 연결됩니다. 따라서, 호스트 응답의 조작 의무가 동물 모델을 개발하는 것은 큰 도전이다. 이러한 맥락에서, 감염의 포유 동물 모델 비는 비용, 속도 및 윤리적 양호성 O 등 여러 가지 이점을 제공한다 (18)를 포함 초파리 melanogaster의 최근 개발되어왔다마우스 모델을 VER. 감염의 제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio)) 모델은 또한 비 침습적 영상, M.의 진행과 연대하여, 시각적으로 탐구하고있다 살아있는 동물 19 농양 감염. 중요한 개념의 증거는 엠에 대한 생체 내 항생제 평가에 대한 적합성을 입증하기 위해 설립되었다 17, 20 농양. 제브라 널리 다양한 병원균과 숙주 면역 시스템 (21) 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 지난 수십 년 동안 사용되어왔다. 이 다른 척추 동물 모델의 증가 성공 동기 부여 및 다수의 바이러스와 세균 감염 19,22,23,24,25,26,27,28,29의 더 나은 이해를 위해 사용을 검증 주요 독특한 기회에 의존합니다. 대부분의 다른 동물 모델에 반해, 제브라 피쉬 배아는 비 침습적 형광 이미징 (30). 이는 헥타르 있도록 광학적으로 투명M. 공부를 LED에 농양은 세균의 형태 학적 가소성의 예를 나타내는 세포 외 cording의 설명과 남중, 전례없는 세부 제브라 피쉬 배아를 감염. Cording는 면역 체계의 파괴의 새로운 메커니즘 및 급성 엠의 발병을 촉진하는 핵심 메커니즘을 나타냅니다 농양 감염 (19). 이 보고서는 M.의 병태 생리 학적 특성을 해독하는 제브라 피쉬 배아를 사용하는 새로운 도구와 방법을 설명합니다 감염 농양과 간균과 선천성 면역 시스템 사이의 친밀한 상호 작용을 연구하는. 먼저, 그 자체 박테리아 접종원 배아 준비, 감염의 처리를 포함하는 마이크로 인젝션 상세한 프로토콜이 제시된다. 구체적 방법은 M.를 평가하도록 같은 호스트의 생존과 세균 부담 등의 다양한 매개 변수를 측정하여 농양 독성이되게됩니다. 특별한 초점은 방법에 기재되어 있습니다, 시공간 수준에서, 운명과 진행 감염과 엠에 호스트 면역 반응을 모니터링 비디오 현미경을 사용하여 농양. 또한, M. 동안의 기여와 대 식세포의 역할을 조사하기 위해 감염 농양, 방법 (genetically- 또는 화학적 기반 중 하나 방법을 사용) 대 식세포가 고갈 된 배아 설명되어 있습니다를 생성합니다. 마지막으로, 프로토콜은 고정 또는 생활 배아를 사용하여 대 식세포 나 호중구가 문서화와 특정 상호 작용을 시각화합니다. 이 보고서의 목적은 엠에 새로운 광명을 비춰하는 추가 연구를 자극하는 것입니다 농양 독성 메커니즘 및 제어되지 않은 급성 감염 프로세스의 확립에 cording 특히 역할.

<table><tbody><tr><td>BBL MGIT PANTA</td><td>BD Biosciences</td><td>245114</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin&amp;nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>04-100-811-E</td><td></td></tr><tr><td>Catalase from Bovine Liver&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H10 Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>262710</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td><td>BD Biosciences</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Oleic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Delta Microscopie</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319244</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4780</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Gibco Life Technologie</td><td>30391-023</td><td></td></tr><tr><td>Low melting agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salts&amp;nbsp;</td><td>Aquarium Systems Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries&amp;nbsp;</td><td>Sutter instrument Inc</td><td>BF100-78-10</td><td>1 mm O.D. X 0.78 mm I.D.</td></tr><tr><td>Micropipette puller device&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument Inc</td><td></td><td>Flamming/Brown Micropipette Puller p-87</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Tritech Research&amp;nbsp;</td><td></td><td>Digital microINJECTOR, MINJ-D</td></tr><tr><td>Tweezers</td><td>Sciences Tools inc</td><td></td><td>Dumont # M5S&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microloader Tips</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

deciphering and imaging pathogenesis and cording of mycobacterium abscessus in zebrafish embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

다양한 해부학 적 부위 (32)를 주입 할 수 있지만, 꼬리 정맥 주사는 종종 생존 실험 세균 부담 결정, 식세포 작용 활성 또는 코드를 포함하여 형성 후속 분석을위한 전신 감염을 생성하는 데 사용된다. 꼬리 근육 주사 주입 (그림 3A)의 사이트에있는 대 식세포의 모집을 평가하는 데 사용됩니다. 조사 엠의 R과 S 변종의 독성을 비교하려면 농양, 형광 박테리아 현탁액은 30 HPF 배아 (그림 3A) (19)의 꼬리 정맥에 주입된다. S 변이체는 대조적으로, R의 morphotype 중추 신경계 (CNS) (도 3c) 내에 세균성 농양의 급속한 발전에 의해 특징 지브라 피쉬 배아 (도 3B)에서 더욱 강력하고 치명적인 감염을 유발한다. R과 S 변종 모두 전신 주사는 중추 신경계 감염과 차이가 발생할병리학 및 독성 표현형은 형광 현미경 관찰 (그림 3C)에 의해, 생선 (그림 3D) 당 CFU를 열거 나 획득 된 영상의 FPC (그림 3E)을 결정하여 하나 정량화 할 수있다. 중요한 것은, CFU 및 FPC의 결정은 상관 관계 3, 5 dpi로 S 균주보다 R 균주에 대한 더 큰 세균 하중을 지적하고 있습니다. 전반적으로, 이러한 결과는 강하게 감염 프로세스의 연대기를 연구하는 감염의 적절하고 비 침습적 모델로 제브라 피쉬를 지원합니다. 아마도 가장 멋진 기능 중 하나는 R 변종에 감염된 태아의 중추 신경계 (그림 4)에서 뱀 코드를 시각화 허용 비디오 현미경으로 밝혀졌다. 배아의 광학 투명도 덕분에, R-코드 형성의 동역학은 EXT를 복제 R 변이체의 높은 성향을 나타내는, 비 침습 방식으로 모니터링 될 수있는 이미징racellularly. 세포 / 조직 파괴와 결합이 억제되지 않는 복제 속도가 빠르게 농양의 개발 및 궁극적으로 죽음에 이르게 유생. 대 식세포는 마이코 박테리아 감염 중에 특히 육아종 형성 (35)를 구동함으로써 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. 두 개의 상보적인 전략 M.을 연구하는데 사용될 수있다 대 식세포가 고갈 된 배아에서 농양 성장 / 독성 : 리포 - clodronate- 및 모르 폴리 노 기반 절차 (그림 5A). 비디오 현미경 (그림 5B)에 의해 계시 된 R 변형와 대 식세포가 고갈 된 배아의 감염 선도, 세균 하중과 코드 생산의 대규모 증가로 연결에 매우 빠른 죽음 (100 % 죽은 배아 3 dpi 해상도에서도 5C) . 이것은 분명히 식세포는 M.을 제어하는 데 필요한 것을 나타낸다 농양 감염. 또한 대 식세포의 역할을 알아보고자감염 동안, 적색 형광 식세포 (MPEG1 : mCherry)를 형질 형질 특정 배아 19 사용될 수있다. 엠 사출 꼬리 근육 또는 꼬리 정맥에 고추 냉이를 표현 농양 감염의 사이트에있는 골수 세포, 주로 대 식세포의 현저한 채용을 유도한다. 이 채용 개별 박테리아의 효율적인 식세포 작용 (그림 6A-6B)에 연결됩니다. 대 식세포의 존재에도 불구하고, 공 초점 현미경은 대 식세포 (그림 6C)를 phagocytize 수없는 큰 세균 코드의 모양을 보여준다. 종합적으로, 이러한 결과는 마이코 박테리아 식균 작용을 방지 cording의 역할에 따라 면역 회피의 새로운 메커니즘을 강조. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53130/53130fig3.jpg" /> 그림 3. M. 제브라 피쉬 배아에서 농양 감염. </st룽&gt; (A) (위 패널) 형광 M. 주입함으로써 수행 정맥 감염 30 HPF 배아의 꼬리 정맥에 (흰색으로 표시) 농양 (화살표 1) 비뇨 생식기 개통, 후방,. (하단 패널) 형광 마이코 박테리아를 주입하여 수행 근육의 감염이 48 HPF 배아에서 체절 (2 화살표)을 통해 꼬리 근육 (흰색으로 표시). (30) HPF 배아 정맥 tdTomato- M. 감염 (BE) 농양 (R과 S 변종). (B) 배아의 생존 곡선은 ≈ 300 CFU R 중 하나에 감염 또는 S는 변형 또는 PBS는 (N = 20) 컨트롤을 주입. 3 개의 독립적 인 실험에서 대표 결과가 표시됩니다. (C) R 또는 여러 번 tdTomato (흰색)을 표현하는 S 변종 중 하나의 시공간 시각화하는 형광 라이브 영상에 의해 수행 후 감염을 가리 킵니다. 각 균주의 경우, 전체 감염된 태아의 대표적인 형광 및 전송 오버레이 소입니다<html> WN. 같은 배아는 3, 5 dpi로 몇 군데 있었다. (DE) CFU가 계산 (D) 또는 FPC 측정 (E)에 의해 결정 R 또는 S 중 변형 (≈ 200 CFU)를 감염 배아 내 세균로드합니다. (D) 해물에서 CFU 다양한 시점에서 개별 배아의 후 감염은 BBL MGIT PANTA 보충 미들 7H10 OADC에 도금에 의해 결정. 3 개의 독립적 인 실험에서 배아 당 SD (가로 막대) CFU ± 로그인 의미로 결과가 표현된다 (N = 5). 다양한 시간이 ImageJ에를 사용하여 입자 분석을 기반으로 감염 후 포인트에서 개인 생활 배아에서 (E) FPC 측정. 3 개의 독립적 인 실험에서 배아 당 SD (가로 막대) FPC ± 로그인 의미로 결과가 표현된다 (N = 5). 모든 이미지는 디지털 컬러 카메라 장착 표면 형광 현미경으로 얻었다.<html> T = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53130/53130fig4.jpg" /> 엠의 R 변형과 정맥 감염 R 변종의 생체 cording에서 그림 4. 30 HPF의 배아 농양과 다양한 시간에 몇 군데는 코드 형성의 진행을 시각화하는 후 감염을 가리 킵니다. 빨간 화살표는 시공​​간 코드의 진화를 수행하기 위해 고정 된 기준점으로 사용된다. 성장하는 꾸불 꾸불 한 코드를 포함하는 꼬리 부분의 DIC 이미지 (컬러 카메라 장착 현미경) 박스형된다. 스케일 바 :. 100 μm의 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53130/53130fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 0 / 53130fig5.jpg &quot;/&gt; 그림 식세포의 5 고갈이 증가 코드의 확산으로 이어집니다. (A) 배아는 리포 - 클로드 기반 절차 또는 모르 폴리 노 기반 절차를 사용하여 고갈된다. 배아 (상단 패널) 클로드 - 캡슐화 된 리포좀 (리포 - 클로드는) 24 HPF의 Tg (mCherry MPEG1)에 정맥 주입된다. 순환 내에서 리포 - 클로드 빠르게 이후의 사멸을 받아야 식세포에 의해 침몰된다. 모르 폴리 노의 준비 (왼쪽 아래 패널) 주입 노크 다운에 PU.1 유전자의 발현을 수정 된 Tg는 (MPEG1 : mCherry)에 제브라 피쉬 계란. (-). (오른쪽 아래 패널) 배아에서 대 식세포의 정확한 고갈 (BC) 30 HPF 식세포 함유 (+) 또는 대 식세포가 고갈 된 형광 현미경으로 확인한다 (리포 - 클로드 치료 다음) 배아 M.에 감염되어 tdTomato 표현 농양 R은 (백색 표시). (B) </stron2 dpi 해상도에서 G&gt; 라이브 영상은 대 식세포가 고갈 된 배아 및 Hyper-cording 내 감염의 악화를 보여줍니다. ≈300 CFU M.에 감염된 대 식세포 함유 또는 대 식세포가 고갈 된 배아의 (C) 생존 곡선 농양 R (N = 20). 3 개의 독립적 인 실험에서 대표적인 결과가 표시됩니다. 모든 이미지는 컬러 카메라에 연결된 현미경으로 인수했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53130/53130fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53130/53130fig6.jpg" /> M.와 로컬 또는 전신적 감염 배아에서 대 식세포의 그림 6. 행동 농양 (A) 48 HPF의 Tg (MPEG1 : mCherry). 제브라 피쉬 배아는 와사비 발현 M.와 근육 감염 농양 R. 라이브 imagi시각화하는 공 초점 현미경을 사용하여 NG는 (분 후 감​​염, MPI)에 개별 마이코 박테리아를 phagocytizing 대 식세포를 채용. (40X APO 물 0.8 NA 목표와 공 초점 현미경) 주사 부위에 대 식세포 (빨간색)의 강렬한 모집을 보여주는 최대 강도 투사. 스케일 바 : 20 μm의 (BC) 48 HPF의 Tg (MPEG1 : mCherry). 배아 정맥 M. 감염 사비 고정 4 HPI (B) 및도 3 dpi의 (C)에 초점 현미경 (40X)에 의해 촬상 된 발현 농양 R. (B) 대 식세포 (적색), 또는 기타 골수 세포, 아마 호중구 (화살표)의 최대 세기 투영 포함 (63X APO 오일 1.33 NA 목표와 공 초점 현미경) 주사 부위에 가까운 고립 된 마이코 박테리아 (녹색). 스케일 바 : 10 μm의 (C) 최대 강도 투사 코드 (녹색) (63X APO 오일 1.33 NA 목표와 공 초점 현미경을) phagocytize 할 수없는 하나의 대 식세포 (빨간색)를 표시합니다..스케일 바 :. 5 μm의 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53130/53130fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

영상 병인과의 Cording를 해독하고<em&gt; 미코 농양</em&gt; Zebrafish의 배아에서

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

10.1K 조회수.  Université Montpellier. Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos. 

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Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

연구

발생학

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

세포내 세균성 병원균과 Zebrafish 태아의 감염

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

면역학 및 감염병학

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Zebrafish 애벌레의 분해해 칸디다 증의 비침습 이미징

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화<em&gt; 표피 포도 구균</em&gt;와<em&gt; Mycobacterium의 박테</em&gt; 감염 신약 개발의 모델로

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation (DIAMOND) Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are increasingly utilized as a model organism for cardiomyopathies and regeneration. Current methods evaluating cardiac function fail to reliably detect segmental mechanics and are not readily feasible in zebrafish. Here we present a semiautomated, open-source method for the quantitative assessment of four-dimensional (4D) segmental cardiac function: displacement analysis of myocardial mechanical deformation (DIAMOND). Transgenic embryonic zebrafish were imaged in vivo using a light-sheet fluorescence microscopy system with 4D cardiac motion synchronization. Acquired 3D digital hearts were reconstructed at end-systole and end-diastole, and the ventricle was manually segmented into binary datasets. Then, the heart was reoriented and isotropically resampled along the true short axis, and the ventricle was evenly divided into eight portions (I&#8211;VIII) along the short axis. Due to the different resampling planes and matrices at end-systole and end-diastole, a transformation matrix was applied for image registration to restore the original spatial relationship between the resampled systolic and diastolic image matrices. After image registration, the displacement vector of each segment from end-systole to end-diastole was calculated based on the displacement of mass centroids in three dimensions (3D). DIAMOND shows that basal myocardial segments adjacent to the atrioventricular canal undergo the highest mechanical deformation and are the most susceptible to doxorubicin-induced cardiac injury. Overall, DIAMOND provides novel insights into segmental cardiac mechanics in zebrafish embryos beyond traditional ejection fraction (EF) under both physiological and pathological conditions.

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation DIAMOND Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

The goal of this protocol is to detail a novel method for the assessment of segmental cardiac function in embryonic zebrafish under both physiological and pathological conditions.

심근 기계 변형의 변위 분석 (DIAMOND) 배아 제브라피시에 있는 심장 기능의 분할 이질성을 제시합니다

Zebrafish are increasingly utilized as a model organism for cardiomyopathies and regeneration. Current methods evaluating cardiac function fail to ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major pathogens in BAI. Current experimental BAI mammalian animal models such as mouse models are costly and time-consuming, and therefore not suitable for high throughput analysis. Thus, novel animal models as complementary systems for investigating BAI in vivo are desired. In the present study, we aimed to develop a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of bacterial infection in the presence of biomaterials based on fluorescence microscopy. In addition, the provoked macrophage response was studied. To this end, we used fluorescent protein-expressing S. aureus and transgenic zebrafish embryos expressing fluorescent proteins in their macrophages and developed a procedure to inject bacteria alone or together with microspheres into the muscle tissue of embryos. To monitor bacterial infection progression in live embryos over time, we devised a simple but reliable method of microscopic scoring of fluorescent bacteria. The results from microscopic scoring showed that all embryos with more than 20 colony-forming units (CFU) of bacteria yielded a positive fluorescent signal of bacteria. To study the potential effects of biomaterials on infection, we determined the CFU numbers of S. aureus with and without 10 &#181;m polystyrene microspheres (PS10) as model biomaterials in the embryos. Moreover, we used the ObjectJ project file &#34;Zebrafish-Immunotest&#34; operating in ImageJ to quantify the fluorescence intensity of S. aureus infection with and without PS10 over time. Results from both methods showed higher numbers of S. aureus in infected embryos with microspheres than in embryos without microspheres, indicating an increased infection susceptibility in the presence of the biomaterial. Thus, the present study shows the potential of the zebrafish embryo model to study BAI with the methods developed here.

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

The present study describes a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated infection over time based on fluorescence microscopy. This model is a promising system complementing mammalian animal models such as mouse models for studying biomaterial-associated infections in vivo.

Zebrafish 태아 모델 Vivo 시각화 및 Intravital 소재 분석 관련 된 황색 포도상구균 에 감염

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

생체공학

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

진 균 marinum 감염 성인 Zebrafish에 모델링 결핵

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune system during early development. The Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum) infection model has been well-established in studying host immune response against mycobacterial infection. It has been suggested that different macrophage cell death types will lead to the diverse outcomes of mycobacterial infection. Here we describe a protocol using intravital microscopy to observe macrophage cell death in zebrafish embryos following M. marinum infection. Zebrafish transgenic lines that specifically label macrophages and neutrophils are infected via intramuscular microinjection of fluorescently labeled M. marinum in either the midbrain or the trunk. Infected zebrafish embryos are subsequently mounted on low melting agarose and observed by confocal microscopy in X-Y-Z-T dimensions. Because long-term live imaging requires using low laser power to avoid photobleaching and phototoxicity, a strongly expressing transgenic is highly recommended. This protocol facilitates the visualization of the dynamic processes in vivo, including immune cell migration, host pathogen interaction, and cell death.

This protocol describes a technique for visualizing macrophage behavior and death in embryonic zebrafish during Mycobacterium marinum infection. Steps for the preparation of bacteria, infection of the embryos, and intravital microscopy are included. This technique may be applied to the observation of cellular behavior and death in similar scenarios involving infection or sterile inflammation.

제브라피시 배아에서 사체내 현미경 검사를 통해 진균 감염 시 대식세포 리액세포 사멸 시 시각화

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

<meta charset="utf8"></head><body>제브라피시 시신경 발달에서 미세아교세포의 거동 규명

Live Imaging and Characterization of Microglia Dynamics in the Zebrafish Embryo

Microglia are highly dynamic cells and their migration and colonization of the brain parenchyma is a crucial step for proper brain development and function. Externally developing zebrafish embryos possess optical transparency, which along with well-characterized transgenic reporter lines that fluorescently label microglia, make zebrafish an ideal vertebrate model for such studies. In this paper, we take advantage of the unique features of the zebrafish model to visualize the dynamics of microglia cells in vivo and under physiological conditions. We use confocal microscopy to record a timelapse of microglia cells in the optic tectum of the zebrafish embryo and then, extract tracking data using the IMARIS 10.0 software to obtain the cells' migration path, mean speed, and distribution in the optic tectum at different developmental stages. This protocol can be a useful tool to elucidate the physiological significance of microglia behavior in various contexts, contributing to a deeper characterization of these highly motile cells.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 제브라피시를 사용하여 뇌 발달 중 미세아교세포 이동 탐구

We demonstrate a method that takes advantage of fast scanning confocal microscopy to perform live imaging of microglia cells in the developing zebrafish optic tectum, allowing for the analysis of the dynamics of these cells in vivo.

영상 병인과의 Cording를 해독하고

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