이 프로토콜의 전반적인 목표는 기능성 메카노 트랜스유도 채널을 가진 살아있는 머리 세포에 있는 텍사스 Red로 표기된 정규 dextran 형광의 uptake를 공부하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 3킬로달톤 텍사스 레드 엑스트라른이 살아있는 모발 세포에서 메카노트랜스유도채널 기능을 평가하는 데 사용될 수 있다는 것이다. 달팽이관을 수확하려면, 산후 6마우스의 두개골을 Leibovitz의 L-15 배지가 들어 있는 60mm 배양 접시에 넣고 외과 가위를 사용하여 앞쪽 끝에서 두개골의 후불 끝까지 그리고 외부 청각 운하를 가로질러 피상적 인 절단을합니다.
코를 향해 피부를 접어 두개골을 노출하고 두개골의 전면과 눈선을 가로 질러 뒤에서 절개를합니다. 두개골을 두 반으로 분리하고 작은 주걱을 사용하여 뇌를 제거하십시오. 측두골뼈를 관찰할 수 있을 때, 작은 가위를 사용하여 이 뼈 주위를 절단하여 조직을 소비합니다.
신선한 L-15 배지를 함유한 35mm 접시에 현세적인 뼈를 담그고 넓은 필드 접안렌즈와 외부 교대 전류 할로겐 광원이 장착된 스테레오 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 집게를 사용하여 주변 달팽이관 조직, 반 원형 운하 및 전정 기관을 제거하십시오. 달팽이관이 해부되고 신선한 L-15 미디어가있는 새로운 접시에 놓이면 외과 용 집게를 사용하여 둥근 창에 펑크 상처 1 개와 정색 달팽이관 부위의 천자 1 개를 만듭니다.
모든 달팽이관이 수확되면, 신선한 L-15 배지의 200 마이크로 리터를 포함하는 9 웰 유리 우울증 플레이트의 우물에 조직을 배치합니다. 격리된 조직의 dextran 라벨링의 경우 각 샘플의 배지를 200 마이크로리터의 신선한 L-15 배지로 잘 교체하여 형광컨의 밀리리터당 2밀리그램으로 보충됩니다. 실온에서 2시간, 분당 25회 회전을 빛으로부터 보호하는 25도의 기울어진 각도로 3차원 셰이커로 배양합니다.
인큐베이션이 끝나면 HBSS로 1회, 세척당 2분간 중형으로 1회 세척합니다. 두 번째 세척 후 실온에서 30분 동안 4%의 파라포름알데히드로 표본을 수정한 다음 HBSS에서 빠르고 부드러운 세척 2개를 넣습니다. 두 번째 세척 후, 미세 팁 집게를 사용하여 달팽이관 뼈, 나선형 인대 및 지각 막을 제거하고 HBSS에서 코르티의 고립 된 장기를 세척하십시오.
모발 세포의 조직이 이 단계에서 쉽게 손상될 수 있기 때문에 투명한 지각막을 제거할 때 각별한 주의를 기울이십시오. F-actin에 라벨을 붙이려면 PBS에서 0.5%트리톤 X-100으로 샘플을 투과화하여 빛으로부터 보호되는 실온에서 30분 동안 형광라벨이 부착된 팔로이드를 100~200희석으로 보충한다. 인큐베이션이 끝나면 PBS에서 단일 세척을 시연한 대로 세척당 신선한 HBSS로 2~3회 세척합니다.
적절한 장착 매체를 사용하여 코르티 조직의 장기를 유리 현미경에 장착하여 모발 스테레오실리아 측면을 위로 밀어 내고 63X 오일 침지 목표를 사용하여 형광 공초점 현미경에 샘플을 이미지화합니다. 텍사스 레드와 형광3킬로달톤 의 형광과 2 시간 배양 후, 야생 유형 산후 날 6 마우스에서 코르티의 기관은 내부와 외부 머리 세포 모두의 견고하고 특정 라벨을 보여줍니다. 모발 세포 스테레오실리아 및 세포 체의 화상 진찰은 그들의 세포 바디에 있는 3 킬로달톤 dextran 텍사스 Red를 통합한 그 세포만이 또한 그들의 입체의 형광 표시를 보여주었다는 것을 밝힙니다.
중요한 것은, 메카노트랜스유도 채널이 있는 짧은 스테레오실리아 행의 끝에서 농축과 함께 입체를 따라 균일한 형광 신호가 관찰된다. 모발 세포의 세포 본체와 인접한 지지 세포의 소포와 같은 구조는 또한 dextran 텍사스 레드도 내분비증에 의해 채택 될 수 있음을 시사 관찰된다. 더 큰 10 킬로달톤 덱스트랜스는 또한 모발 세포의 세포 체및 지지 세포의 세포 체에서 소포와 같은 패턴을 생성했습니다.
특히, 칼슘 첼라토르 또는 메카노트랜스덕션 채널 차단제의 존재는 모발 세포에서 3킬로달톤 엑스트라 텍사스 레드의 스테레오실리아 라벨링과 섭취를 방지합니다. 소포와 같은 패턴은 여전히 메카노트랜스덕션 채널 봉쇄가 있는 상황에서 관찰되고 있지만, 이러한 섭취 패턴은 기능적인 MET 채널과무관임을 나타냅니다. 코르티 조직의 장기를 주의 깊게 해부하고 이미징 조직을 장착하기 전에 모발 세포의 적절한 방향을 확인하는 것이 매우 중요합니다.
살아있는 및 기능성 모발 세포의 dextran 라벨링 후, 고정 된 조직의 면역 염색은 관심있는 단백질의 특정 세포 유형을 식별하기 위해 수행 될 수있다.
