DNA 메틸화는 가장 연구된 후성 유전학 적 서명 중 하나입니다. 많은 암은 비정상적인 유전자 발현 및 기타 유전체 이상과 관련된 DNA 메틸화 수준의 변화를 특징으로합니다. 긴 산재 된 핵 원소는 일반적으로 메틸화의 높은 수준을 가지고 반복형 전이 게놈 서열이다.
그러나, 그(것)들은 수시로 그들의 활성화 귀착되고 염색체 불안정으로 이끌어 내는 암에 있는 과질하게 됩니다. 이 연구에서는, 우리는 암 EV가 MECs에 있는 LINE-1 메틸화에 영향을 미칠 수 있는지 확인하기 위하여 골육종 유래 외세포 소포를 가진 중간엽 줄기 세포를 처리했습니다. 포유류 세포 배양 배지의 일체성분인 태아소 혈청에는 많은 수의 소 유래 전기자동차가 포함되어 있다.
이러한 Evs는 관심있는 세포에서 Evs의 분석을 방해할 것이므로 EV 격리를위한 세포가 증가할 때 EV 고갈 된 FBS를 사용하는 것이 중요합니다. 초원심분리기 튜브에 FBS를 가져 와서 초원심 분리기 양동이에 넣습니다. 버킷을 스윙 로터에 로드하기 전에 버킷을 10 밀리그램 이내로 조정합니다.
초원심분리기에 로터를 놓고 섭씨 4도에서 19시간 동안 100G, 000G로 실행합니다. 실행 후, 조심스럽게 상체의 밝은 색깔의 상층층을 수집하고 50 밀리리터 튜브로 전송합니다. FBS의 전기가 포함되어 있으므로 어두운 갈색 펠릿을 방해하거나 파이프하지 마십시오.
0.22 미크론 필터를 통해 새로운 50 밀리리터 튜브에 상수체를 전달합니다. 이 필터 멸균, EV 고갈된 FBS는 이제 EV 절연을 위한 세포를 성장시킬 때 세포 배양 매체에 추가할 수 있습니다. EV 고갈된 매체에서 자란 골육종 세포로부터 조건된 미디어를 수집합니다.
세포와 세포 이물질을 제거하려면 조건부 미디어를 섭씨 4도에서 20분 동안 2500G로 원심분리합니다. 상체를 초원심분리기로 옮기고 이전과 같이 균형을 잡을 수 있습니다. 100, 000 G에서 4도에서 2시간 동안 튜브를 원심분리합니다.
상체를 조심스럽게 폐기하여 바닥에 약 1 밀리리터를 남깁니다. EV 펠릿을 세척하고 다시 중단하기 위해 튜브와 파이프에 약 20 밀리리터의 PBS를 넣고 부드럽게 파이프를 넣습니다. 튜브의 균형을 맞추고 동일한 설정으로 또 다른 초원심 분리를 수행합니다.
상체를 조심스럽게 제거하고 부드러운 파이펫팅으로 PBS의 200 마이크로 리터에서 EV 펠릿을 다시 중단합니다. 바인딩이 낮은 튜브에 전기 를 저장합니다. 정제 된 전기는 서양 블로팅, 나노 입자 추적 분석 및 전송 전자 현미경 검사를 특징으로합니다.
플레이트 15, 000 MSC 는 24 웰 플레이트에서 잘 합니다. 24시간 후, 오래된 미디어를 제거하고, PBS로 세포를 세척하고, EV 고갈된 매체로 변경한다. 예약된 시간 지점에서 OS-EV로 셀을 처리합니다.
EV 치료를 중지한 후 적절한 방법을 사용하여 세포로부터 DNA를 추출한다. 메틸화 분석을 위해, 우리는 사용자 정의 만든 메틸화 별 프로브 증폭 방법을 사용했다. 이전에 와 같이 Pavicic 및 다른 사용자가 사용자 정의 된 LINE-1 프로브를 설계합니다.
메틸화 프로브의 경우 프로모터 영역 내에서 HhaI 제한 부위를 포함하는 세 가지 서열을 선택합니다. 제어 프로브의 경우 LINE-1 시퀀스의 나머지 부분에서 HhaI 제한 사이트가 부족한 7개의 시퀀스를 선택합니다. TE 버퍼에서 DNA 샘플 70나노그램을 5마이크로리터로 희석시킵니다.
샘플을 섭씨 98도에서 10분간 가열한 다음 섭씨 25도로 식힙니다. 각 샘플에 프로브 혼성화 믹스의 3개의 마이크로리터를 추가하고 열순환기를 실행하여 프로브가 DNA에 혼성화될 수 있도록 합니다. 실온에서 각 샘플에 30 마이크로리터의 혼성화 후 믹스를 추가합니다.
10 마이크로리터를 두 번째 튜브로 옮기. 두 튜브 세트를 온도 순환기에 놓고 적어도 1 분 동안 섭씨 48도에 인큐베이션하십시오. 샘플은 섭씨 48도에 있지만 첫 번째 튜브 세트에 10 마이크로리터의 결찰 믹스와 두 번째 튜브 세트에 결찰 소화 믹스 10 마이크로리터를 추가합니다.
다음 열실균 프로그램을 실행합니다. 그런 다음 튜브를 회전시키고 동시에 온도 순환기를 섭씨 72도로 설정합니다. 각 튜브에 폴리머라제 믹스 5마이크로리터를 추가하고 튜브를 열순환기에 넣습니다.
PCR 프로그램을 실행합니다. PCR 프로그램이 실행되는 동안 크기 표준의 2.5 마이크로리터를 포함하는 1 밀리리터 포머미드의 솔루션을 준비합니다. 광학 96 웰 플레이트의 각 행에 이 솔루션의 파이프 10 마이크로리터.
PCR 후, 소화되지 않은 시료와 소화된 샘플을 각각 1~100~200개로 희석하여 초순수수에 희석시켰다. 희석 PCR 제품의 마이크로리터 2개를 96웰 플레이트에 추가합니다. 기포를 제거하기 위해 15~20초 동안 플레이트를 200G에서 원심분리합니다.
모세관 전기 포근에 의해 샘플의 단편 분석을 수행합니다. 모세관 전기포레시스를 열어 전자페로그램 분석 소프트웨어가 생성됩니다. 샘플을 선택하고 메뉴에서 패널을 MLPA로 설정합니다.
패널을 클릭하고 제어 D를 눌러 모든 샘플에 이 설정을 적용합니다. 비슷한 방식으로 분석 방법을 모든 샘플에 대해 마이크로위성 기본값으로 설정합니다. 모든 샘플을 선택하고 그린 플레이 버튼을 클릭하여 분석을 실행한 다음 모든 샘플을 선택하고 그래프 버튼을 클릭하여 프로브 피크를 시각화합니다.
피크 영역을 확대하여 개별 피크의 더 높은 해상도를 확인합니다. LINE-1 프로브 믹스의 프로브에 해당하는 10개의 피크가 모두 레이블이 지정되어 있는지 확인합니다. 유전자형 탭에서 결과를 CSV 형식으로 내보냅니다.
데이터 분석 소프트웨어에서 CSV 파일을 열고 데이터를 열로 정렬합니다. 크기에 따라 세 개의 메틸화 사이트 피크에 레이블을 지정합니다. 나머지 7개의 피크는 제어 프로브에 해당합니다.
여기서 우리는 대략 117베이스 쌍의 크기가 있는 LINE-1 2M 프로브 봉우리를 사용하고 있습니다. 각 샘플에 대해 7개의 컨트롤 피크의 합계 피크 영역을 계산합니다. 각 LINE-1 프로브의 피크 영역을 이 합계로 나눕니다.
각 샘플에 대해, 소화되지 않은 샘플의 값을 메타투여량 비율을 얻기 위해 소화된 시료의 값을 나눕니다. 서양 블로팅 분석은 TSG101, HSP70 및 CD63에 대해 관찰된 신호와 함께 OS-EV의 존재를 확인했습니다. 칼넥신 신호의 부재는 EV 샘플이 순수했음을 나타냈다.
순도의 추가 표시는 OS-EV 샘플에 존재하는 다양한 크기의 온전한 소포와 함께 TEM으로 관찰되었다. OS-EV 입자 농도 및 크기 분포는 NTA에 의해 측정되었다. 전기자동차의 80%는 50~200나노미터의 크기 범위에 있었다.
여기서 우리는 EV 치료의 다른 시점에서 MSC로부터 LINE-1의 메틸화 투여 비율을 볼 수 있습니다. 회색 선은 시간 점 0에서 기준메틸화 수준을 나타냅니다. 시점에서 3, EV의 투여 후 평균 메틸화 투여 비율이 감소하여 고메틸화를 나타낸다.
이 과다 메세팅 효과는 7시에 덜 두드러집니다. 여기에서 우리는 메틸화 분석을 위한 간단하고, 매우 민감하고, 견고한 기술을 보여주었습니다. 그것은 관련된 bisulfite 변환없이 DNA의 낮은 양을 필요로 하고 또한 파라핀 임베디드 견본에서 분리된 DNA에 적합합니다.
실험 및 분석 부품의 전체 방법은 약 2 일이 걸립니다. 게놈에서 LINE-1의 높은 복사 수로 인해 LINE-1의 기준형 메틸화는 정상 샘플에서 높습니다. 따라서, 이 방법으로 관찰된 바와 같이, 샘플의 메틸화 수준의 차이는 미묘할 수 있다.
