림프절 저온 절에서 종양 세포 접착의 정량화

전이에 대 한 가장 빈번한 사이트는 원래 림프절. Somatids는 시험관내에서 종양 세포의 림프절 단면도 사이 접착제 친화성을 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 기술의 한 가지 장점은 신선한 림프절 섹션이 정제 된 단백질을 사용하여 재현 할 수없는 원래 조직의 자연적인 복잡성을 제공한다는 것입니다.

이 방법은 림프절과 같은 전이성 표적 기관에서 종양 세포의 접착력을 방해하는 유전자 또는 치료법을 식별하는 분자 종양학 연구에 유용할 수 있습니다. 희생 후 30분 이내에 림프절을 수확하려면 성인 Wistar 쥐를 실온의 깨끗한 해부 보드에 등쪽 용역에 놓고 모피를 70%의 이소프로필 알코올로 분사하십시오. 살균 된 기구를 사용하여 복부 피부를 들어 올리고 내측 피부 절개를하여 복부 내장을 노출시합니다.

흉부와 복부 림프절이 눈에 띄게 될 때까지 내장을 추출합니다. 무딘 팁 가위를 사용하여 기본 우수한 장간 동맥을 손상시키지 않고 림프절을 조심스럽게 절제하고 림프절을 멸균 PBS 5 mL을 포함하는 15 mL 튜브에 배치하십시오. 모든 림프절을 수확하면 극저온당 림프절 1개를 각 금형 의 바닥에 엎드뜨리고 조직을 덮을 수 있는 최적의 절삭 온도 매체를 추가합니다.

스냅 동결 후, 냉동고를 사용하여 섭씨 22도에서 5 ~8 마이크로 미터 두께의 섹션을 획득하고 유리 현미경 슬라이드에 섹션을 수집합니다. 동일한 림프절의 연속 슬라이스에서 좋은 품질의 냉동 절개는 슬라이스 사이의 차이를 최소화하고 일관된 세포 접착속도를 촉진하는 데 중요합니다. 종양 세포 라벨링의 경우, 적절하게 준비된 세포 배양으로부터 관심 있는 세포를 수확하고 mL 농도 및 혈청 이없는 배지당 6세포에 1 x 10으로 세포를 다시 중단한다.

새로운 15mL 원판 튜브로 1mL의 세포를 옮기고 세포 침전을 피하기 위해 5분 동안 부드러운 동요로 10분 동안 mL DiI(C18)당 2마이크로그램으로 세포를 라벨을 부착합니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 세포를 펠렛하고 어떤 과잉 염료를 제거하기 위해 신선한 혈청없는 배지의 10 mL로 두 번 표지 된 세포를 세척. 두 번째 세척 후, 혈청 프리 배지의 mL 당 6 세포당 1 x 10에서 세포를 다시 중단하여 0.1%의 소 세럼 알부민 농도로 보충한다.

수확된 림프절 조직 섹션에 표지된 종양 세포의 진행, 부드럽게 PBS에서 섹션을 두 번 세척하고, 실온에서 15 분 동안 신선한 PBS에서 재 수화. 인큐베이션이 끝나면 면봉을 사용하여 슬라이드를 건조시키기 전에 섭씨 37도에서 30 분 동안 2.5 %의 소 세럼 알부민으로 비특이적 결합을 차단하십시오. 소수성 펜을 사용하여 각 섹션 주위에 장벽을 그리고 각 둘러싸인 림프절에 표지된 세포의 100 마이크로리터를 추가합니다.

가습 챔버에서 섭씨 37도에서 1~2시간 후에 PBS에 완만한 세척이 4개의 비준수 세포를 제거하고 실온에서 15분 동안 PBS에서 3.7%의 포름알데히드로 나머지 부착형 형광 세포를 수정합니다. 접착제 인덱스의 정량화를 위해 형광 현미경에 10x 목표를 사용하여 밝고 빨간색 형광 분야에서 각 섹션의 개별 TIFF 이미지를 얻습니다. 그런 다음 피지에서 이미지를 열기 전에 이미지를 체계적으로 이름과 저장합니다.

축척을 설정한 후 다각형 도구를 사용하여 정량화할 관심 영역을 선택합니다. 림프절 영역을 정량화하려면 선택합니다. 데이터는 평방 밀리미터로 표시됩니다.

다음으로 플러그인, 분석, 셀 카운터를 선택하고 사진을 클릭하여 정량화합니다. 초기화를 클릭하고 카운터 유형을 선택합니다. 그런 다음 사진의 셀을 클릭합니다.

림프절 접착 지수는 림프절 커버 영역당 부착 종양 세포의 수로 표현될 것이다. 다음 사진을 초기화하려면 다음 사진을 열고 설명한 대로 정량화를 반복합니다. 관찰된 바와 같이, 신봉세포의 형태는 모양으로 둥글게 되고, 세포는 관심있는 림프절을 통해 이질적으로 분산된다.

림프절 접착 지수는 해당 NDRG4 양성 세포를 측정한 것과 비교하여 NDRG4 음성 유방암 세포주에서 2~3배 더 높다. 이 절차는 수정된 종양 세포를 위한 유착의 이차 특혜 사이트를 평가하기 위하여, 두뇌 또는 폐 같이 그밖 전이성 표적 조직에 있는 유착 비율을 돕기 위하여 적응될 수 있습니다. 신선하고 냉동 된 조직은 모두 생물 위험으로 간주되어야하며 적절한 생체 안전 예방 조치를 사용하여 처리해야합니다.