이 프로토콜은 예를 들어 상처 치유 및 암 전이와 같은 많은 생리적 및 병리학 적 과정에서 세포 힘이 하는 역할의 용해를 허용하기 때문에 중요합니다. 이 역학 기반 기술의 주요 장점은 세포-세포 접합을 동시에 방해하고 세포 생성 기계력, 주로 견인 및 세포 간 스트레스에 미치는 영향을 측정하는 능력입니다. 우리의 프로토콜은 암 전이, 동맥 경화증 및 고혈압과 같은 광범위한 병리학 적 과정에 적용됩니다.
당사의 방법은 장기 온칩 모델, 바이오 엔지니어링 조직 구조, 체외 약물 전달 시스템 및 조직 공동 배양 시스템과 함께 생화학 및 생화학 및 생화학 적 분석을 모두 수행하도록 통합될 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 매우 간단합니다. 그러나 이 프로토콜을 수행하는 사람들은 처음으로 인내심을 가지고 이 프로토콜의 단계를 서두르지 말 것을 권고합니다.
우리의 프로토콜에는 처음 사용자에게 명확하지 않을 수 있는 고유한 단계가 있습니다. 따라서 사용자가 작성된 단계별 절차를 따르고 시각적 데모를 지침으로 사용하는 것이 좋습니다. 우선, 아세트산 80마이크로리터와 50 마이크로리터의 아세트산과 50마이크로리터의 초순수수 200밀리리터를 혼합하여 블라인드 실레인 용액을 준비하십시오.
슬바인드-시레인 용액을 교반판에 넣고 1시간 이상 저어줍니다. 페트리 요리의 중앙 우물을 바인드 실레인 용액으로 45분간 처리합니다. 바인드 시레인 용액을 제거하고 페트리 접시를 초순수물로 2~3회 헹구세요.
페트리 접시 표면을 건조하고 나중에 사용하기 위해 실온에서 보관하십시오. 하이드로겔 용액을 준비하려면 12밀리리터의 초순수수 12.49밀리리터를 2.062밀리리터에 40%의 아크릴아미드와 375마이크로리터의 2%의 비사크라이미드를 15밀리리터 원심분리기 튜브에 섞는다. 하이드로겔 용액에 80마이크로리터의 형광 구슬을 추가합니다.
튜브를 부드럽게 흔들어 구슬과 젤 용액을 섞습니다. 원심분리기 튜브에 캡을 느슨하게 유지하고 진공 챔버에 놓습니다. 진공 챔버에서 적어도 45 분 동안 젤 용액을 탈가스.
하이드로겔을 중합하려면 먼저 10%의 아황산염 75마이크로리터를 추가한 다음 하이드로겔 용액에 8마이크로리터를 추가합니다. 페트리 접시의 중앙에 하이드로겔 용액24마이크로리터를 배치합니다. 하이드로겔을 18mm 커버 슬립으로 하이드로겔에 눌러 하이드로겔을 평평하게 하고 약 100 마이크로미터의 높이를 만듭니다.
젤 중합을 위해 적어도 30 ~ 40 분 기다립니다. 젤 탈수를 방지하기 위해 초순수 수에 중합 된 하이드로겔을 담급하십시오. 페트리 접시를 알루미늄 호일로 덮어 형광 구슬의 표백을 방지하고 섭씨 4도에 보관하십시오.
먼저, 50밀리리터 원심분리기 튜브에서 20 대 1의 비율로 PDMS 실리콘 베이스를 실리콘 경화제와 혼합한다. 튜브를 거꾸로 뒤집어 놓고 여러 번 격렬하게 흔들어 PDMS 용액을 적절히 혼합하십시오. 100mm 페트리 접시의 중심에 PDMS 용액의 5~6밀리리터를 190배 G.Pour에서 1분 동안 원심분리하여 PDMS 용액의 거품을 제거하고 PDMS 솔루션이 전체 페트리 접시 표면을 덮을 때까지 접시를 교반합니다.
PDMS 용액을 섭씨 50~60도에서 하룻밤 사이에 치료합니다. 다음으로, 구멍 펀처와 원형 16밀리미터 직경 PDMS 스텐실을 제거합니다. 1.25 밀리미터 직경의 생검 펀치를 사용하여 PDMS 스텐실에 작은 구멍을 만듭니다.
PDMS 스텐실을 70%에 탄올로 2~3분 동안 잠급하여 멸균하고, 과도한 에탄올을 흡수한 다음 5분 동안 UV 조명 아래에 놓습니다. 여분의 액체를 흡인시키고 하이드로겔에서 덮개 슬립을 제거합니다. PDMS 스텐실을 하이드로겔 표면에 놓고 핀셋을 사용하여 PDMS 스텐실과 하이드로겔 표면 사이의 수분 밀폐 씰을 보장하기 위해 PDMS 스텐실에 가벼운 압력을 가합니다.
하이드로겔 표면을 0.1 의 어금니 HEPES 버퍼 용액으로 1-000의 농도로 용해시키고 8분 동안 36와트의 힘으로 하이드로겔을 UV 램프 아래에 놓습니다. 과도한 설포-삼파파 및 HEPES 용액을 흡습하고 0.1 개의 어금니 HEPES로 하이드로겔을 두 번 헹구고 초순수수로 2개의 헹구를 추가로 넣습니다. 과도한 초순수수를 흡인하고 200마이크로리터 파이펫을 사용하여 콜라겐-1밀리리터당 0.1밀리그램의 하이드로겔을 코팅합니다.
식기를 덮어 형광구를 광표백으로부터 보호하고 하이드로겔을 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 보관하십시오. 지금, 플라스크에 1X 트립신의 3 밀리리터를 추가하고 조직 배양 플라스크에서 세포를 분리하기 위해 3 ~ 5 분 동안 37섭씨37도에서 인큐베이터에 배치합니다. 트립시니화 후, 플라스크에 세포 배양 매체의 3 밀리리터를 추가하고, 혼합을 소용돌이시키고, 혼합물을 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮춥니다.
원심분리기 세포 용액은 1, 710회 G.에서 3분 동안 슈퍼나탈을 흡인시키고 밀리리터당 4개의 세포에 50배 10의 농도로 매체의 세포를 다시 중단한다. 냉장고에서 하이드로겔 요리를 꺼내라. 하이드로겔에서 콜라겐-1을 제거하고 PBS로 한 번 헹구는 다.
PDMS 스텐실의 상단에 세 번째 세포에 75 회 10을 추가하고 세포가 37 섭씨 및 5 %의 이산화탄소에서 인큐베이터에서 적어도 한 시간 동안 하이드로겔 표면에 부착 할 수 있도록합니다. PDMS 스텐실을 제거하고 부착된 셀을 제거하기 위해 10X 트립신에서 10X 트립신으로 PDMS 스텐실을 잠급합니다. 페트리 접시에 적어도 2밀리리터의 미디어를 추가하고 70%에탄올로 분무한 다음 UV 라이트 아래에 5분간 배치하여 스텐실을 소독합니다.
페트리 접시를 인큐베이터에 적어도 36시간 동안 또는 컨물류 단층이 관찰될 때까지 놓습니다. 실콘 치료 30분 전과 샬콘 치료 후 2시간의 위상 대비 영상을 비교했다. 세포 유도 비드 변위는 HUVEC 단층제를 제어하는 것과 비교할 때 저용량 샬콘 및 고용량 샬콘 조건에서 모두 감소하는 것으로 관찰되었다.
chalcone 치료 전에, RMS 견인 주위 했다 51 모든 조건에 대 한 파스칼. chalcone 치료 후, RMS 견인에 작은 증가 했다 59 저용량 chalcone 처리 단층에서 파스칼 과 RMS 견인에 거의 두 배 감소 18 고용량 chalcone 처리 단층에서 파스칼 대조군에 비해. Chalcone 치료는 낮은 복용량으로 평균 정상적인 정상 세포 간 스트레스 크기를 증가, 하지만 크게 제어에 비해 높은 복용량으로 평균 정상적인 정상 세포 간 스트레스 크기를 감소.
또한 샬콘 치료는 대조군과 비교했을 때 저체콘 농도와 높은 체콘 농도모두에서 최대 세포 간 응력을 감소시켰습니다. chalcone 처리의 충격은 T-시험 및 단 하나 요인 ANOVA 시험 둘 다에 근거를 둔 통계적으로 유의합니다. PDMS 스텐실을 젤 위에 두는 동안, 젤이 충분히 건조하여 PDMS 스텐실과 젤 사이의 방수 씰을 보장하십시오.
이 프로토콜은 또한 살아있는 화상 진찰을 가진 세포 세포 접합, 세포 셀 접합, 세포 매트릭스 접착 분자, 또는 세포 외 분자의 생체 역학 적 기여를 탐구하기 위하여 적용될 수 있습니다. 이 체외 프로토콜을 통해 연구자들은 이제 동물 모델없이 조직 수리, 상처 치유 또는 암 전이 중 생화학적 특성뿐만 아니라 생물 역학의 호스트를 성공적으로 조사 할 수 있습니다. 우리는 이러한 약물의 흡입이 유해한 것으로보고로 chalcone 및 DMSO를 처리하는 동안 매우 조심하도록 우리의 시청자를 조언한다.
