조직 과 세포기관의 형태학에 있는 변경을 정량화하는 기능은 유전 돌연변이의 충격 뿐만 아니라 유전자 기능을 이해하는 것을 위해 중요합니다. 우리의 프로토콜은 선충, C.elegans에서 시냅스, 근육 및 미토콘드리아의 형태를 주관적으로 평가하는 데 사용할 수있는 소프트웨어를 얼마나 자유롭게 사용할 수 있는지 설명합니다. 많은 이전 연구는 형태 학적 변화를 비교하기위한 질적 방법에 의존했다.
그러나 미묘한 표현성 차이를 포착하지 못하고 변경 내용을 과소 평가할 수 있으며 주관적으로 평가되기 때문에 문제가 될 수 있습니다. 우리의 정량적 방법은 형태학적 변화를 평가하기 위한 보다 강력하고 편향된 수단을 제공합니다. 이 방법은 유전자 기능 및 질병 관련 돌연변이의 결과를 정의하기 위하여 그밖 세포 구조물 또는 모형 유기체에 있는 형태학적 변경을 공부하기 위하여 쉽게 이용될 수 있었습니다.
먼저 이미징슬라이드를 준비합니다. 녹인 아가로즈 한 방울을 현미경 슬라이드에 놓고 즉시 다른 현미경 슬라이드로 물방울을 눌러 아가로즈를 부드럽게 평평하게 합니다. 아가로즈를 1분 동안 건조하게 한 다음 두 슬라이드를 조심스럽게 분리하고 고형패드를 슬라이드 중 하나에 둡니다.
현미경 단계에 슬라이드를 놓고 아가로즈 패드의 중앙에 마취제의 5 ~ 10 밀리리터 드롭을 추가합니다. 열 살균 된 선택을 사용하여 용액이 건조되기 전에 스톡 플레이트에서 마취 액으로 10 ~15 마리의 동물을 신속하게 이송하십시오. 그런 다음 아가로즈 패드 바로 위에 위치하여 커버슬립을 바르고 부드럽게 떨어 뜨립니다.
488 나노미터 및 552 나노미터 광학 펌핑 반도체 다이오드 레이저와 결합된 라인 스캐닝 공초점 현미경으로 시냅스 영역을 이미지 캡처 소프트웨어가 장착되어 있습니다. 웜을 찾은 후 40배율로 전환하고 침수 매체를 적용합니다. 552 나노미터 레이저, 태그RFP 형광로에 대한 1 %의 전력, 488 나노미터, GFP 형광에 대한 2 %의 전력으로 형광을 흥미진진하게 시냅스 영역을 시각적으로.
하이브리드 광검출기를 사용하여 이미지를 캡처하고 형광의 과다 노출을 방지하기 위해 이득을 설정합니다. Z 스택 이미지를 수집하여 목표에 따라 최적의 Z 단계 크기를 사용하여 전체 시냅스를 덮습니다. 시냅스 영역을 분석하려면 이미지를 CellProfiler 3.1.5 소프트웨어에 로드하는 것으로 시작됩니다.
NameAndType 모듈을 설정하고 UIS-115 트랜스진으로부터 발현된 확산 태그RFP를 사용하여 시냅스 영역을 손 정의로 결정한다. 파이프라인에 MeasureObjectSizeShape 및 MeasureObjectIntensity 모듈을 추가하여 손으로 정의된 시냅스의 크기와 형광을 측정합니다. 그런 다음 계산매 모듈을 추가하고 JSIS37으로부터 얻은 통합 강도 단위를 UIS-115로부터 획득한 것으로 분할하여 상대적 통합 형광 강도를 계산합니다.
완료되면 모든 측정 및 계산을 내보낼 수 있습니다. 근육 세포 영역 피지 소프트웨어에서 이미지를 열고 신중 하 게 단일 경사 근육 세포 주위 추적 폴리 곤 선택을 사용 하 여 측정 합니다. 트레이싱을 개선하기 위해 앵커 점을 드래그하여 끝에 다각형의 선을 조정합니다.
소프트웨어 상단의 분석 탭으로 이동하여 측정값을 클릭하여 선택한 영역을 계산합니다. 분해되거나 누락된 영역이 있는 근육 세포의 경우 다각형 선택 도구를 사용하여 누락된 영역을 추적하고 측정을 다시 클릭합니다. 간격이 여러 개 있는 경우 각 간격을 별도로 추적합니다.
전체 셀의 영역에 대한 갭 영역의 비율을 계산합니다. 비율이 높은 것은 근육 퇴행성의 더 높은 범위를 나타냅니다. 누락된 영역이 없는 경우 비율은 0으로 계산됩니다.
탄력성을 열고 새 프로젝트 만들기 에서 픽셀 분류를 선택합니다. 그런 다음 프로젝트의 이름을 변경하고 저장합니다. 입력 데이터 탭으로 이동하여 새 추가를 클릭한 다음 별도의 이미지를 추가합니다.
팝업 창을 TIF 파일로 폴더로 직접 설정하고 원하는 이미지를 선택합니다. 기능 선택 탭에서 피처 선택 을 클릭하여 녹색 틱 된 상자에 표시된 모든 픽셀 피처를 선택합니다. 이 단계의 픽셀 선택은 다음 단계에서 다른 픽셀 클래스를 구별하는 데 사용됩니다.
트레이닝 패널을 사용하여 개별 GFP 표현 미오신 필라멘트와 원치 않는 배경을 구분합니다. 레이블 추가를 클릭하고 필라멘트 사이의 원치 않는 배경과 공간을 스크롤링하여 분류자 교육을 시작합니다. 두 번째 레이블을 추가하고 필라멘트로 이름을 바꿉니다.
라이브 업데이트를 클릭하여 분류가 올바르게 수행되었는지 확인합니다. 필요한 경우, 훈련을 미세 조정하기 위해 더 많은 크롤링을 추가합니다. 교육 분류기가 수행되면 예측 내보내기 패널로 이동하여 확률을 소스로 내보내기 이미지 설정 선택으로 클릭합니다.
컷아웃 하위 영역 x와 y가 틱되어 c가 선택되지 않았는지 확인합니다. 0과 하나를 c의 시작 및 중지 값으로 선택하고 데이터 형식을 서명되지 않은 8비트로 변환합니다. 다시 정규화한 다음 출력 파일 비디오를 png로 변경하여 원하는 대로 파일 및 디렉터리의 이름을 바꿉니다.
내보내기 설정 창을 닫고 방금 분할된 이미지를 내보냅니다. 그런 다음 피지 소프트웨어에서 png 파일을 엽니 다. 기본 설정을 사용하여 이미지의 임계값을 조정하고 골격화 플러그인을 적용하여 별도의 결과 테이블을 만듭니다.
이 프로토콜은 시냅스 개발에서 알파 튜룰린 아세틸 트랜스퍼라제 MEC-17의 기능을 탐구하는 데 사용되었습니다. 후방/측면 마이크로튜블러 또는 PLM 시냅스의 이미지의 정량적 분석은 MEC-17의 과발현이 정상적인 뉴런 기능을 방해한다는 것을 나타낸다. MEC-17을 과발현하는 야생형 대조군 동물에 비해 시냅스 영역과 시냅스 무결성이 현저히 감소했습니다.
이러한 기술은 또한 CMT2 관련 유전자에 있는 돌연변이를 운반하는 Charcot-Marie-Tooth 모형 2 또는 CMT2의 C.elegans 모형을 분석하기 위하여 이용되었습니다. 신체 벽 근육 형태에 대한 시각적 평가는 야생 형 대조군에 비해 시험 동물의 결함에 2.5 ~ 3.5 배 증가를 나타났다. fzo-1 및 unc-116에 돌연변이를 가진 동물은 근육 감소, 세포 파편의 축적 및 근육 섬유 변성의 손실을 경험했습니다.
dyn-1에 있는 돌연변이를 가진 동물이 근육 형태에 있는 현저하게 더 적은 결점을 경험하는 동안. fzo-1 및 unc-116 돌연변이체는 야생형 동물에 비해 총 단일 세포 면적에 대한 갭 비율과 극적으로 짧은 평균 섬유 길이의 비율이 5~ 6배 증가하는 것을 나타냈다. 샘플 간의 비교를 위해서는 이미지 수집을 위한 최적의 조건을 결정하고 이러한 조건이 일관되게 사용되는지 확인하는 것이 중요합니다.
이 기술은 연구원이 양적 접근과 다른 유전 배경에 걸쳐 형태학적 변화를 비교할 수 있게 합니다. 이렇게 하면 주관성이 줄어들므로 생성된 데이터의 표현성을 향상시키는 데 도움이 됩니다.
