여기에 제시된 프로토콜은 3D 문화에 최적화되어 있으며 3D 환경에서 암 세포 성장, 증식 및 사망과 관련된 프로세스에 대한 효율적이고 저렴한 조사를 허용합니다. 3D 배양을 사용하는 주요 장점은 체외에서 종양 미세 환경의 주요 측면을 재구성할 수 있는 독특한 가능성이라는 것입니다. 3D 스페로이드는 암 치료 연구에서 시험관 내 및 생체 내 조건 사이의 번역을 개선하는 데 점점 더 익숙해지고있는 암 약물 검진을위한 중요한 도구입니다.
일부 프로토콜에는 일정량의 연습과 기술이 필요합니다. 이는 특히 손 낙하 방법에 의한 스페로이드를 생산하고 면역조직화학용 스페로이드를 내장하는 데 특히 해당된다. 이러한 절차의 핵심 요소는 구체를 아가로즈 한 방울에 삽입하는 방법과 같이 서면으로 설명하기 어렵기 때문에 시각적 데모는 연구원이 이러한 절차를 수행하는 데 도움이 됩니다.
최적의 세포 밀도를 얻기 위해 15 밀리리터 튜브에서 준비된 세포 현탁액을 희석시. 희석된 셀 현탁액을 멸균 저장소로 옮기고 다중 채널 파이펫을 사용하여 이전에 준비된 플레이트에 200 마이크로리터를 분배합니다. 이산화탄소 5%와 습도 95%로 섭씨 37도에서 배양합니다.
2~3일마다 스페로이드의 가벼운 현미경 이미지를 수집합니다. 이미지를 수집한 후 각 웰에서 소비된 매체의 100마이크로리터를 제거하고 신선한 매체의 100마이크로리터로 교체합니다. 첫째, 얼음에 재구성 된 지하 막을 해동.
사용하기 전에 개별적으로 포장 된 접시와 저수지를 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, 최적의 세포 밀도를 얻기 위해 15 밀리리터 튜브에서 준비된 세포 현탁액을 희석한다. 희석된 세포 현탁액을 함유한 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
플라스틱 용기를 얼음으로 채우고 후드로 옮습니다. 차가운 접시와 저수지를 세포 배양 후드로 옮춥니다. 접시와 저수지를 얼음 위에 다시 놓습니다.
균질성 젤을 보장하기 위해 rBM을 부드럽게 다시 중단합니다. 차가운 세포 현탁액에 rBM의 최적 농도를 추가합니다. rBM 및 세포 현탁액이 제대로 혼합되었는지 확인하기 위해 튜브를 반전시하십시오.
그런 다음 이 혼합물을 멸균 저장소로 옮기고 멀티채널 파이펫을 사용하여 200마이크로리터를 냉정하고 극저부착된 96웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. rBM이 경화될 때 세포가 함께 클러스터되도록 15분 동안 750배 g의 플레이트원심분리기. 원심분리기 소프트 하강 또는 최소한의 제동 기능을 사용합니다.
첫째, 세포 배양 접시에 PBS의 6 밀리리터를 추가합니다. 적절한 희석을 얻기 위해 준비된 세포 현탁액을 희석시. 실용적인 희석은 밀리리터당 50, 000세포입니다.
세포 현탁액을 멸균 저장소에 붓고 멀티 채널 파이펫을 사용하여 세포 배양 접시의 뚜껑에 최대 30 방울의 현탁액을 조심스럽게 배치하여 드롭 당 2000 세포의 농도를 초래합니다. 빠르지만 조절된 움직임으로 뚜껑을 뒤집고 PBS가 함유된 세포 배양 접시 위에 놓습니다. 4~6일 동안 이산화탄소 5%, 습도 95%로 섭씨 37도에서 배양합니다.
스페로이드가 단백질 용액이나 임베딩에 사용되어야 하는 경우 뚜껑을 제거하고 기울인 다음 가열 된 매체의 1 밀리리터로 방울을 씻어 서 서 가져옵니다. 생성된 스페로이드 함유 배지를 1.5 밀리리터 튜브로 전송합니다. 스페로이드가 단백질 리자또는 포함을 진행하기 전에 튜브 의 바닥에 정착하게하십시오.
P200 파이펫 팁의 끝을 잘라 구조를 방해하지 않고 스페로이드를 보다 쉽게 캡처합니다. 각 조건에 대해 최소 12개를 당기지만 1.5 밀리리터 튜브에서 18에서 24 개의 스페로이드 사이를 이상적으로 당깁니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 스페로이드가 바닥에 정착하도록 합니다.
다음으로 멸균 세포 실험실에서 일반 실험실로 이동합니다. 스페로이드를 얼음-차가운 1개 X PBS 1밀리리터로 두 번 세척하여 각 세척 단계 사이에 PBS를 제거하기 전에 스페로이드가 정착하도록 하십시오. 그런 다음 스페로이드를 방해하거나 제거하지 않고 가능한 한 많은 PBS를 흡인합니다.
스페로이드 당 인산염 및 프로테아제 억제제와 가열 된 용해 버퍼 5 마이크로 리터를 추가합니다. 스페로이드를 30초 동안 소용돌이치게 한 다음 10초 동안 빠른 원심분리를 수행합니다. 소용돌이와 원심분리의 간격을 5-10분 동안 또는 스페로이드가 용해될 때까지 반복합니다.
PI 용액을 준비한 후 96웰 플레이트에서 각 웰에서 100 마이크로리터의 배지를 제거하여 스페로이드를 제거하지 않도록 하십시오. 각 우물에 100 마이크로리터의 가열 된 X PBS를 넣고 우물에서 100 마이크로 리터의 액체를 제거합니다. 남은 매체를 씻어 내려면 이 세탁 단계를 세 번 반복하십시오.
다음으로 각 웰에 PI 솔루션의 마이크로리터 100개를 추가합니다. 알루미늄 호일로 접시를 덮고 섭씨 37도에 이산화탄소 5%, 습도 95%를 10~15분간 배양합니다. 그 후, 이전에 설명한 바와 같이, 가열된 X PBS를 3회 가열하여 세척 과정을 반복하여 PI 용액을 세척하고 이미징 시 배경 신호를 감소시한다.
피플루오렌스 현미경을 사용하여 스페로이드를 이미지합니다. 이미징 소프트웨어 내에서 멀티 채널 메뉴를 엽니다. 관련 채널의 노출 시간을 설정하고 각 채널을 조정한 후 읽기 설정을 누릅니다.
Z 스택 메뉴를 열고 이미지 포커스를 조정하여 시작 및 끝을 정의합니다. 처음에는 스페로이드가 초점에서 벗어난 다음 이미지가 다시 흐려질 때까지 전체 스페로이드를 통해 초점 지점을 이동합니다. 그런 다음 단계 크기를 18~35마이크로미터 사이로 조정하고 시작을 누릅니다.
먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 첫날 연기 후드에 스페로이드를 수정합니다. 둘째 날, 아가로즈 젤을 전자레인지에 물로 채워진 비커에 넣고 가열하고 필요할 때까지 섭씨 60도로 설정된 벤치 탑 난방 판에 젤을 따뜻하게 유지합니다. 세척당 얼음 차가운 1 밀리리터 X PBS를 사용하여 연기 후드에 스페로이드를 두 번 씻으세요.
그런 다음 대부분의 PBS를 흡인합니다. 20 마이크로리터 파이펫 팁을 경사로 절단하여 더 큰 구멍이 있는 뾰족한 팁을 얻습니다. 그 후, 현미경 슬라이드에 아가로즈 젤 드롭을 합니다.
아가로즈가 고화되는 것을 방지하기 위해 따뜻한 난방 블록에 슬라이드를 놓습니다. 수정된 파이펫 팁을 사용하여 15~20마이크로리터의 부피로 가능한 한 많은 스페로이드를 잡습니다. 조심스럽게 아가로즈 젤 드롭의 중앙에 스페로이드를 주입, 현미경 슬라이드를 만지지 않도록.
실온또는 4도에서 5~10분간 배양하여 아가로즈 젤드롭이 굳어지게 합니다. 젤 드롭이 다소 고화되었지만 여전히 부드러워지면 메스를 사용하여 현미경 슬라이드에서 플라스틱 조직 카세트로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 티슈 카세트를 에탄올로 채워진 비커로 옮기고 실온에서 보관하십시오.
본 연구에서는, 3D 배양에서 암세포 생존가능성 및 사망에 대한 항암 치료 유도 변화의 분석을 위한 일련의 방법이 제시된다. 추가된 rBM의 농도는 스페로이드의 형태에 심오하게 영향을 미칠 수 있습니다. 최대 2.5%rBM을 첨가하면 SKBr-3 유방암 세포에서 스페로이드 형성이 가능하며, 더 높은 농도에서는 더 이상 효과가 없습니다.
대조적으로, BxPC-3 췌장암세포는 자발적으로 작은 소형 스페로이드를 형성한다. 이 세포 유형에서 rBM을 1.5% 이상으로 늘리면 스페로이드에서 돌출 및 질이 있는 더 복잡한 구조로 뚜렷한 형태학적 변화가 유도됩니다. 화학요법 효능의 스크리닝을 위한 스페로이드 배양의 사용의 예가 여기에 나와 있다.
광 현미경 이미지는 MDA-MB-231 유방암 세포에서 50% 감소된 생존가능성을 결정하기 위해 수행된 투여량 반응 실험 중에 2~3일마다 획득된다. 억제제의 농도가 증가함에 따라 죽은 세포의 공간 배치는 PI 염색을 사용하여 시각화될 수 있다. 본 바와 같이, 대조구 스페로이드는 제한된 괴사, 후기 세포 핵을 나타내며, 죽은 세포는 억제제의 농도가 증가함에 따라 스페로이드 전체에 분포된다.
여기에 표시된 스페로이드 기술은 3D 침입, 마이그레이션 또는 미세 포레틱 분석과 같은 많은 다른 분석법에 적용 될 수 있습니다. 또한 종양 미세 환경에서 세포 상호 작용에 대한 중요한 정보를 제공 할 수있는 섬유 아세포, 지방 세포 또는 면역 세포와 공동 배양에 적용됩니다. 이 기술의 발달은 유전자 발현, 침략 및 처리 원조를 포함하여 암 발달의 수많은 양상에서 종양 미세 환경의 역할을 해명하는 데 매우 중요했습니다.
