우리의 프로토콜은 CRISPR 기술을 통해 제조 하는 동안 CAR-T 세포의 유전자 변형을 설명 하 고 더 효과적이 고 덜 독성 제품을 생성. 이 기술의 장점은 CAR-T 세포 생산 및 유전 조작모두 좋은 효율을 가진 한 세포에서 발생할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 로잘리 스테너, MD 박사 과정 학생, 미셸 콕스, 기술자 및 대학원생, 그리고 내 실험실에서 박사 후 동료 인 로나 사케무라 (Reona Sakemura)가 될 것입니다.
수확된 말초 혈액 단핵 세포로부터 T 세포를 격리한 후, 먼저 T 세포 배지를 제조한 다음 0.45 마이크로미터 멸균 진공 필터를 통해 필터링한 다음 0.22 마이크로미터 멸균 진공 필터로 이를 살균하여 배양하기 시작합니다. T 세포 자극 또는 일 제로의 날에, 자극 하기 전에, 세척 CD3/CD28 구슬의 필요한 볼륨멸균 에 구슬의 필요한 볼륨을 배치 하 여 1.5 밀리 리터 미세 원심 분리 기 튜브 및 TCM의 1 밀리 리터에서 다시 중단. 튜브를 자석과 1분 동안 접촉합니다.
그런 다음 TCM을 흡인하고 신선한 TCM의 1 밀리리터로 다시 중단하여 구슬을 다시 씻고 총 3개의 세척을 반복합니다. 그리고 마지막으로, TCM의 1 밀리리터에서 구슬을 다시 중단합니다. T 세포를 계산한 후 구슬을 세포에 3 대 1구슬의 비율로 T 세포로 옮기다.
그런 다음 세포를 밀리리터 당 100만 개의 세포로 희석하고 섭씨 37도, 24시간 동안 5%CO2로 배양합니다. 렌티바이러스 벡터에서 CART19 구조를 획득한 후, 렌티바이러스 플라스미드, 포장 벡터, 봉투 벡터, 프리컴터링 시약, 트랜스페션 시약 및 실온에서 30분 동안 트랜스포팅 배지를 먼저 배양하여 렌티바이러스 생산을 수행한다. 세포 배양 후드, 개인 보호 장비 및 폐기 전에 표백제로 사용된 물질의 소독을 포함하여 BSL2+예방 조치를 사용하여 렌티바이러스 작업을 수행하십시오.
인큐베이션 후, 70~90%에 도달한 293T세포에 이러한 트랜스페션 시약을 추가하고 37°C와 5%CO2에서 전과 세포를 배양한다. 24 및 48 시간 에서 트랜스포밍, 수확, 원심분리기, 필터 및 농축 바이러스 함유 상류체에 의한 초원심분리에 의한 및 농축 및 향후 사용을 위해 영하 80도에서 동결한다. 첫날, 세포의 장미를 분해하기 위해 0 일째에 밀리리터 당 백만 세포에서 자극 된 T 세포를 부드럽게 재중단합니다.
적절한 BSL2+예방 조치하에서, 3.0의 감염의 복합성에서 시뮬레이션된 T 세포에 신선하거나 냉동 수확된 바이러스를 추가하십시오. 트랜스듀스된 T 세포를 섭씨 37도, CO2 5%로 계속 배양합니다. 3일과 5일에는 CAR-T 세포를 계산하고 밀리리터당 100만 개의 CAR-T 세포 농도를 유지하기 위해 배양에 신선한 사전 데워진 TCM을 첨가합니다.
시뮬레이션 후 6일 후, 세포를 먼저 수확하고 다시 중단하여 변환된 T 세포에서 구슬을 제거합니다. 50 밀리리터 원뿔 관에 세포를 전송하고 1 분 동안 자석에 튜브를 배치합니다. CAR-T 세포 함유 슈퍼나탈을 수집하고 구슬을 버린 후, 배양 플라스크에서 밀리리터당 100만 개의 세포 농도로 세포를 배양에 다시 배치한다.
유동 세포측정을 위해 세포 샘플을 사용하여 CAR의 표면 발현을 평가합니다. 나머지 를 배양하여 확장을 재개한 다음 원고에 설명된 대로 8일째에 세포를 수확하고 냉동 보존합니다. 과립 세포 대식세포 식민지 자극 인자를 방해하려면 원고에 설명 된 바와 같이 가이드 RNA를 활용하십시오.
실온에서 30분 동안 배양한다. 인큐베이션 후, 70~90%에 도달한 293개의 T세포에 추가하고, 렌티바이러스를 생성하기 위해 섭씨 37도, 5%CO2에서 감염된 세포를 배양한다. 24 시간 및 48 시간에서 50 밀리리터 초원심 분리 관에서 초원심 분리에 의해 바이러스 함유 상체를 수확하고 농축하고 향후 사용을 위해 영하 80도에서 동결하십시오.
그런 다음 첫날에 T 세포를 부드럽게 다시 중단하여 장미를 분해합니다. BSL2+승인 실험실에서 CAR-T 세포를 생성하기 위해 CAR19 렌즈바이러스 및 GMCSF 표적 CRISPR 렌즈바이러스를 시뮬레이션된 T 세포에 추가합니다. 3일째와 5일째에 푸오마이신 저항을 운반하는 렌티크리스프르 편집T 세포를 성공적으로 변형하여 밀리리터당 1마이크로그램의 푸오마이신 농도로 푸오마이신 디하이드로클로라이드로 세포를 치료한다.
조류 시퀀싱은 생CD3 양성 세포에 게이트된 CAR-T 세포 표면 염색의 약 71%의 흐름 플롯을 가진 GM-CSF 녹아웃 CART19 세포의 GM-CSF 감소를 확인하는 데 사용되었으며, 이와 유사한 방식으로 바이오트로에서 CAR 표면 수용체를 발현하는 것으로 나타났다. 한편, 멜트세포-세포측정에 의한 GM-CSF의 세포내 염색은 또한 살아있는 CD3 양성 세포에 게이트되어 야생형 CART19 세포에 비해 녹아웃 세포에서 GM-CSF의 발현감소를 입증하여 녹아웃의 기능적 성공을 확인한다. 그들은 유전자 변형 CAR-T 세포의 개발에 가장 중요 하기 때문에 특정 주의이 절차의 변환 단계 동안 취해야 한다.
설명된 방법론은 잠재적으로 CRISPR/CAS9를 통해 CAR-T 세포를 수정하기 위하여 유전자의 다양한에 적용될 수 있고 보다 효과적인 제품을 생성하는 것을 돕습니다. CRISPR/CAS9 기술은 CAR-T 세포의 게놈을 직접 표적으로 삼아 현재임상 결점에 대한 솔루션을 설계하는 전략을 제공합니다.
