이 작품은 독립 수상에 NIH 통로 (GM 099,893을 부여) 교수 시작 기금 SRB에,뿐만 아니라 연구 프로젝트 그랜트 (GM 042219 부여)에 의해 부분적으로 투자되었다. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 해석, 또는 출판을 위해 작업을 제출하기로 결정에서 아무런 역할이 없었다.

버퍼 솔루션 1. 준비 <ol><li> 인산 완충 식염수 준비, 초순수로 1 배의 최종 농도로 10 배 PBS의 원액을 희석하여 (PBS pH를 7.4) (증류수 및 탈) 물. </li><li> 아세토 니트릴 2 ㎖, 메탄올 2 ㎖, 초순수 H 2 O 1 ㎖, 포름산 19 μL (0.1 mM의 최종 농도)을 조합하여 켄칭 용액을 준비한다. </li><li> LC-MS 초순수에 포름산 (0.2 % [v / V를] 최종 농도)을 첨가하여 용매를 준비한다. </li><li> 아세토 니트릴, 포름산 (0.2 % [v / V를] 최종 농도)을 첨가하여 LC-MS를 용제 B를 준비한다. 참고 : 모든 솔루션은 최고 순도의 시약을 사용할 수 (일반적으로 고성능 액체 크로마토 그래피 등급)로 작성한다. 솔루션은 각 실험 전에 신선 준비하고 사용하기 전에 얼음에 보관해야합니다. </li></ol> 정상 상태 S. 구균 성장 2. 설립 <ol><li> 행진 S.의 aureu냉동 글리세롤로부터 트립신 콩 한천 (TSA)에서 격리에 대한 관심의 변종. 16-24 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션. </li><li> 트립 틱 소이 브로스 (TSB) 각 균주의 단일 콜로니로 멸균 유리 배양 관의 다른 적합한 배지 4 mL로 접종한다. 경사 부화 (~ 70 ° 각도) 16-20 시간 동안 37 ° C에서 분 (RPM) 당 60 회전으로 회전. 주 : 세포 생리학에 영향을 미치는 단계 2.2에 기재된 것과 비롯한 표준 방법을 사용하여 하룻밤 배양시 산소 구배 쉽다. 따라서, 우리는 (참조 단계 2.4-3.2, 아래) 생물학적 정상 상태를 보장하기 위해 여러 백 희석 전략을 채택하고있다. </li><li> 600 나노 미터 (OD 600)의 단계 2.2에서 배양 물의 광학 밀도를 측정하는 분광 광도계를 사용한다. 광학 기준 (공백)로 멸균 배지를 사용한다. 멸균 TSB 배지 0.05 50 용액의 OD 600에 이들 세포를 희석 별도의 250 ML 드롱 (37 ° C로 미리 예열). </li><li> 인큐BATE 280 rpm에서 진탕 수조에서 37 ℃에서 배양. </li><li> 30 분마다 600 개 OD 측정을; 광학 밀도가 증가함에 따라, 그들이 분광 광도계 흡광도의 선형 범위 내에 유지되도록 TSB와 배양액을 희석 할 필요가있다. </li><li> 단계 2.5에서 배양 ~ 0.8-1.0의 OD (600)를 획득하면, 0.01 ~ 0.05의 OD 600에 37 ° C TSB 50 ㎖로 계대를 반복 2.4 2.5 단계. </li></ol> 3. 시료 채취 설치 <ol><li> 적절한 용기에 분쇄 된 드라이 아이스의 침대를 준비 (예를 들어, 유리 접시, 얼음 통, 또는 냉각기). </li><li> 배양액의 광 밀도 수확 원하는 지점에 접근, ≥5 분간 미처리 35mm 페트리 접시 드라이 아이스에 미리 냉각 용액을 1 mL의 담금질을 추가한다. 참고 : &quot;원하는 수확 포인트는&quot;실험 목적에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 m를 조사했다etabolites 호기성 성장시에,이 상태의 주요 지표 아세테이트 배설 후 지수 성장기 (32, 33) 중 아세트산 다시 동화를 포함한다. 일반적으로,이 시점은 특정 성장 단계 (예를 들어, 지수 위상) 내에 있어야한다. 이 스테이지와 연관된 특정 OD 600의 값이 상이한 균주 및 성장 배지 사이에서 변할 수있다. </li><li> 고무 마개 (-20 ℃로 예비 냉각)을 스테인리스 필터 프릿을 배치하고 하우스 진공 또는 진공 펌프에 연결된 진공 플라스크 위에 배치. </li><li> 진공을 적용하고 상부에 혼합 된 셀룰로오스 에스테르 막 (0.22 ㎛의 공극 크기)을 배치했다. 주 : 상기 유리 재와 동등한 직경의 필터를 사용하고 적절하게 시료가 필터를 통과하기보다는 가장자리 위로 인출되도록이 필터를 중앙에 중요하다. 빙냉 멸균 H와 막의 습윤 2 O 도움멤브레인 포지셔닝. </li></ol> 4. 샘플 수확 <ol><li> OD 600 ~ 0.4-0.5에서 배양 플라스크에서 13 mL로 제거하는 혈청 피펫을 사용하여 필터에 시료를 적용. </li><li> 전체 샘플을 여과 한 후, 즉시 중간 관련된 대사 물질을 씻어 빙냉 PBS의 ≥5 ml로 필터를 세척 하였다. </li><li> 진공을 해제하고 프릿에서 필터를 제거하기 위해 무균 핀셋을 사용한다. 미리 냉각 된 용액으로 급랭 필터 (셀 측 아래) 전환. 액체가 신진 대사 활동을 체포, 세포의 급냉을 보장하기 위해 제거 된 즉시 (초, 즉) 신속 위의 단계를 수행하는 것이 중요하다 : 참고. </li><li> ≥20 분 동안 드라이 아이스에 종결 용액에 필터를 품어. </li><li> 페트리 접시 필터 (셀 측까지)를 반전 및 t 떨어져 세포를 헹구어 마이크로 피펫을 사용하여 무균 핀셋을 사용하여그는 종결 용액에 막. </li><li> 및 켄치 용액에 세포를 부유 한 후 다시 0.1 mm 실리카 비드 ~ 100 μL를 함유하는 멸균 2ml의 충격 내성 튜브에 세포 현탁액을 전송. 드라이 아이스 또는 -80 ° C에서이 보관하십시오. </li></ol> 5. 대사 추출 <ol><li> 젖은 얼음에 녹여 샘플 사이클 사이의 드라이 아이스 냉각 2 분주기와, 6000 rpm으로 30 초 네 버스트와 균질의 세포 파괴. </li><li> 최대 속도로 미리 냉장 · 냉동의 microcentrifuge에서 15 분 동안 용 해물을 명확하게 (즉, ≤4 ℃에서 18,213 XG). </li><li> 깨끗한 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 마이크로 피펫을 사용하여, 6 단계에서 잔류 펩티드 함량의 정량 마이크로 원심 튜브에 시료의 작은 부분을 전송; -80 ° C에서 나머지를 저장합니다. 주 : 예비 샘플의 부피는 단계 6.1에서 사용 된 BCA 분석에 따라 달라진다. 이샘플은 즉시 분석을 위해 젖은 얼음에 저장 또는 -80 ° C에서 냉동해야합니다. </li></ol> 6. Bicinchoninic 산 (BCA) 분석법 <ol><li> 각 샘플에 대한 잔류 펩타이드 농도를 결정하는 단계 5.4의 샘플을 이용하여, 키트 제조업체의 지침대로 BCA 분석을 수행한다. </li></ol> 7. LC-MS <ol><li> LC-MS, 용매 B 75 μL 75 μL S. 아우 레 우스의 추출물, 단계 1.4에서 제조 섞는다. </li><li> 소용돌이는 5 분 동안 13,000 XG에서 혼합 스핀합니다. </li><li> 액체 크로마토 그래피 (LC) 바이알로 상등액 100 μL를 배치하고 캡. 공기 방울이 샘플에 갇혀 있지 않은지 확인합니다. </li><li> LC-MS의 자동 시료 주입기에 액정 유리 병을로드하고 소프트웨어의 실행 목록을 편집 &quot;오프라인 작업리스트 편집기.&quot; <ol><li> &quot;샘플 이름&quot;을 작성합니다 (예를 들어, 야생형-1), &quot;샘플 위치&quot;(예를 들어, P1-A1), &quot;방법&quot;(예를 들어, 개미CID-부정적인 방법) 및 &quot;데이터 파일&quot;(예를 들어, 야생형-1) 열입니다. 버튼 &quot;저장 작업리스트&quot;버튼을 클릭합니다. 은 &quot;질량 분석 데이터 수집 워크 스테이션&quot;소프트웨어 및 입력 이전에 저장된 작업 목록을 엽니 다. 연속 LC-MS 측정을 시작하려면 &quot;시작 작업 목록 실행&quot;버튼을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 액정 시스템과 TOF 분석기를, 컬럼에 샘플을 분리 비행 (TOF) 분광계의 시간에 열을 연결, 커플. 다음 이동상 구배를 사용하여 0~2 분간, 85 % 용매 B 단계; 3-5 분, 80 % 용매 B; 6-7 분, 75 % 용매 B; 8-9 분, 70 % 용매 B; 10-11.1 분 50 % 용매 B; 11.1-14 분, 20 % 용매 B; 14.1-24 분 및 5 % 용매 B; 85 % 용매 B로 10 분간 재 평형 기간 및 0.4 mL의 최소-1의 유속으로 끝난다. </li><li> 등용 매 펌프를 사용하여, 동시에 대량 축 교정하도록 실행와 레퍼런스 질량 용액을 주입. 참고 :이 단계표준 TOF 분석기 설명서를 기반으로합니다. <ol><li> 아세트산 D4 및 헥사 키스 (1H, 1H, 3H-테트라 플루오) 레퍼런스 질량 용액으로서 포스 파진의 실시간 보정을 수행 혼합물을 사용한다. 2.5 mL의 최소의 유량과 등용 펌프 -1 주입 대를 사용한다. </li></ol></li></ol> 이온 카운트 8. 일괄 수정 <ol><li> (1 복제, 예를 들어, 야생형) 일괄 보정 기준 시료로 제공하는 임의의 샘플을 나타낸다. </li><li> 기준 샘플 내의 모든 대사에 대한 이온 개수의 합을 계산한다. 모든 샘플이 계산을 반복합니다. </li><li> 비율을 생성하기 위해 참조 샘플의 총 이온 카운트하여 각 샘플의 총 이온 수를 나눈다. </li><li> 각 대사 물에 대한 일괄 이온 보정 계수를 획득하기 위해 상기 샘플 / 기준 비율에 의해 시료 내의 각 대사 물질에 대한 이온의 수를 나눈다. </li></ol> 9. 펩타이드 정규화 <ol><li> 디각 대사 물에 대해 정규화 된 값을 생성하는 단계 6에서 BCA 분석으로 결정된 펩티드 농도 8 단계에서 얻어진 각 시료에 대하여 일괄 보정 이온 카운트 값 ivide. 주의 : 단계 9.1에서 얻어진 각 대사 물질의 정규화 일괄 배치 이온 보정 계수를 직접 변형을 비교 및 통계 분석 (-test 예, 맨 - 휘트니 U)을 실시 할 수있다. 대안 적으로, 공지의 대사는 변경하거나 치료 또는 유전 적 배경에 의해 분해 대사 물질 인한 변화를 검출하기 위해 정규화로서 사용될 수있다한다. 추출 완충액 L - 발린 또는 gluraric 산 기지 량의 포함은 시료 처리 (34) 중에 손실을 보정하기 위해 사용될 수있다. </li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

모든 작은 분자 대사는 중앙 대사 경로에서 공통의 기원을 통해 서로 연결되어있다. 기하 급수적으로 성장하는 동안 박테리아 세포는 특정 조건 하에서 생리 상태의 스냅 샷을 제공하는 생물학적 대사 안정 상태에있다. 코디 ILV와 GTP에 응답하여 영양 자족을 모니터링합니다. ILV 및 GTP 풀 강하 같이, 코디 활성 가능성 점진적 영양분 고갈 (30)의 증가에 적응하는 그것의 표적 유전자의 발현을 조절, 감소된다. 코디 결핍 균주 ILV 및 GTP 환경에서 소모하는 것처럼 행동하지만만을 코디 숙달 균주 성장 거동에 대하여 매우 경미한 차이 (도 1)를 나타낸다. 따라서, 이들 균주의 대사 물질의 정상 상태 풀의 비교는 영양분이 부족한 경우 신진 대사가 재구성되는 정도를 공개 할 수있는 독특한 기회를 우리에게 제공한다. 그것은 주목해야한다 OU코디 활성 (ILV하고 GTP가 지수 상에 가장 풍부하다) 최대화 될 때 R 실험 대사 존재비를 조사. 그러나 다른 질문은 성장의 다른 단계에서 해결 될 수 있습니다. 예를 들어, 지수 적 단계에서 트리 카르 복실 산 (TCA) 사이클 활성은 매우 낮다; 이후 지수 단계에서, TCA 사이클이 활성화된다 (36). 대사 산물 중 농도를 포함하여 표현형의 수는,이 작동에 의존한다. 또한 AGR 균체 감지 시스템은 정지상 37 지수 성장과 전이 동안 활성이된다. 이후 지수 또는 정지상에 시료를 수집하여 해당 주제를 다루는 연구에 더 관련 될 수있다. 관계없이 샘플이 수확 될 때, 정상 상태가 교란 될 때 발생하는 대사 회전율을 최소화하기 위해, 수집 세척 및 (S 내에 IE) 가능한 빨리 추출 완충액으로 샘플을 전달하는 것이 중요. 여기에 설명 된 크로마토 그래피 방법은 극성과 비극성 아미노산 및 중앙 탄소 화합물의 대사 분석에 특히 적합하다. 그러나 추가 클래스 고유의 방법은 크로마토 그래피이 방법으로 해결되지 관심의 특정 화합물을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 첨가제는 이소류신과 류신 (38)의 해상도를 사용하는 것으로보고 된 바와 같이 아세트산과 포름산을 대체하여 크로마토 그래피 이동상 pH를 변경. 추출 절차를 수정 유사 여기에 사용되는 추출 방법에 민감 불안정한 대사의 복구 및 정량화를 활성화 할 수 있습니다. 예를 들어, 이황화 결합을 형성하는 경향이 시스테인 등의 화합물은 잠재적 엘만 (Ellman) 시약 39 유도화 다음 회수 할 수있다. 질소 가스 살포 추출 버퍼들은 NAD + 및 NADH를 보존 할비는, 셀룰러 산화 환원 상태 (40)의 평가를 허용한다. 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트는 기본 또는 버퍼링 솔루션을 분해 할 수; 추출 용액을 산성화하여 이들 분자 (41)의 복구를 개선 할 수있다. 기하 급수적으로 성장하는 박테리아 배양에서 하나 이상의 영양분이 고갈 성장 후 지수 및 정지상으로의 전환을 이끈다. 이러한 성장 단계는 별개의 대사 상태 (42)에 의해 특징입니다. Chemostat 기반 배양 유전자 발현 및 생리 학적 연구가 거의 연속적인 생물학적 정상 상태 이상을 발생시킨다. 그러나,이 방법은, 특수한 설비를 필요로 기술적으로 요구하고, 그리고 영양소 제한 기류 하에서 세포의 안정적 인구 유지 부과하는 것이 필요로한다. 후자의 요구로 인해, 가변 또는 재 이외의 요소에 전사 생리적 교란을 야기gulator 분석된다. 부피 비율 (이어질 수 산소 수준에 약간의 변화 : 우리의 플라스크에 기반 결과가 정상 상태에서가 아니라 두 단계 사이의 전환의 기하 급수적으로 증가 세포의 대표 수 있도록하기 위해, 우리는 일관성있는 플라스크에 더블 백 희석 전략을 채택 변경된 대사 36, 42). 그들은 ~ 0.5의 OD 600에 도달 할 때 밤새 배양의 초기 희석 한 후,이 세포는 OD 600 ~ 0.05 백 희석 OD 600 ~ 1.0까지 성장 및 수확. 이러한 방법은 또한 안정한 RNA를 포함 밤새 성장 중에 축적 세포질 분자 희석. 실제로 RNAIII 상기 AGR 균체 감지 시스템의 조작자가 이러한 하나의 RNA이고 코디 25, 43, 44과 같은 표적 유전자의 일부의 발현을 조절한다. 누적 RNAIII 코디-출발 마스크 수endent 규제 코디 (샤르마 및 Brinsmade 미공개 결과)에 의해 억제 또는 자극의 강도 과소 선도. 이 분석의 한 가지 제한은 세포 내 대사 물질의 존재비 순간 엿볼 제공하는 것이다; 어떠한 결론이 특정 경로를 통해 자속의 변화에 ​​관한 결과에서 도출 될 수 없다. 예를 들어, 널 codY- 균주 생합성 효소의 탈 억제에도 불구하고 변경되지 않은 검사 두 계통 간의 리신, 메티오닌의 존재비 (도 2 및도 3). 코디 -null 균주 사실 라이신과 메티오닌을 생성 할 수 있지만, 신속하게 다른 화합물로 전환 될 수있다; 따라서, 이러한 분자는 누적되지 않습니다. 13 C-15 사용 N을 표지 탄소 또는 질소 소스는 우리가 주요 대사 접합 (45) &lt;을 통해 탄소와 질소 골격을 수행 할 수 있도록 할SUP&gt; 46. 우리는 상술 한 황색 포도상 구균의 대사 산물 풀의 변화를 명료하게하기위한 방법으로서, B. 서브 틸리 스 29 결핵균 (47), 및 엔테로 faecium에 48을 사용하고 있지만이 방법은 다른 포함한 기타 그람 양성 및 그람 음성균에 적용될 수있다 인간 병원체는 쉽게 실험실에서 재배. 실제로, 대사 체 및 transcriptomic 정보를 통합하는 것은 감염을 치료하는 새로운 전략으로 이어질 수 신진 대사 및 독성 사이 예기치 않은 연결을 공개 할 수 있습니다.

세균성 병원체는 호스트 환경에서 많은 도전에 맞설해야합니다. 면역 세포에 의한 직접 공격뿐만 아니라, 호스트는 세균의 생존과 복제, 생성 영양 면역 1, 2 필수 영양소를 담즙산이. 이러한 적대적 환경에서 살아 남기 위해, 세균성 병원균은 병원성 인자를 배포합니다. 이러한 요소 중 일부는 박테리아가 면역 반응을 회피 할 수 있도록; 다른 인자는 조직 유래 성분 3, 4, 5를 소비하여 누락 된 영양소를 보충 할 수 있도록 세균 등 히알루, thermonuclease, 리파제 등의 소화 효소를 분비를 포함한다. 실제로, 병원성 세균, 6 인자 (7)의 생산 세포의 생리 학적 상태를 묶어 규제 시스템 진화, <s<html> 클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 8, 9, 10까지. 증거의 성장 몸은 신진 대사 및 독성을 연결하는 중요한 레귤레이터로 코디를 가리 킵니다. 먼저 디 펩티드 퍼 미아 제 (DPP) 유전자 (11)의 리프레로서 고초균에서 발견되지만, 코디는 현재 거의 모든 낮은 G + C 그램 양성 세균 (12, 13)에 의해 생성되는 것으로 알려져 및 조절되는 탄소가 관여하는 유전자 수십 질소 대사 14, 15, 16, 17, 18, 19. 병원성 종에서, 코디는 가장 중요한 독성 유전자 (20), (21)의 일부의 발현을 제어하고,. EF &quot;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 코디 리간드의 두 개의 클래스에 의해 DNA 결합 단백질로 활성화되어 분지 쇄 아미노산 (BCAA를, 이소류신, 류신 및 발린 [ILV])과 GTP 전사 이러한 영양소가 풍부하면., 코디 억압 (또는 어떤 경우에, 자극). 이러한 영양소가 제한 될 때, 코디 활동이 점차 감소되고, - 경로를 다시하는 것은 중앙 대사에 연결된 다양한 대사 경로를 통해 전구체하는 경사 전사 반응을 초래 28, 29, 30. 질량 분석기 (LC-MS)에 결합 된 액체 크로마토 그래피 탠덤 정확하게 저분자 세포 대사 (31)를 식별하고 정량화 할 수있는 강력한 기술이다. transc와 결합 할 때riptome 분석 (예, RNA-SEQ)는이 분석 워크 플로우 환경이나 영양 스트레스에 반응하여 발생하는 생리적 변화에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 여기서는 LC-MS를 통해 포도상 구균 세포 및 후속 분석 대사 추출을위한 방법을 제시한다. 이 방법은 S. aureus에 생리학 코디의다면 발현 성 효과를 보여주기 위해 사용되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="933">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:363px;">Material/Equipmenta</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:241px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">DeLong Culture Flask (250 ml)</td>
			<td style="width:167px;">Belco</td>
			<td>2510-00250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sidearm Flask, 500 ml</td>
			<td style="width:167px;">Pyrex</td>
			<td style="width:163px;">5340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">3-hole Rubber Stopper, #7</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">14-131E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Stainless Steel Filter holder/frit</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td>89428-936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Petri Dish, 35 mm</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:163px;">430588</td>
			<td>Not tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Mixed cellulose ester membrane, 0.22 &#956;m pore size</td>
			<td style="width:167px;">Millipore</td>
			<td>GSWP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Impact-resistant tubes, 2 ml</td>
			<td style="width:167px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:163px;">1420-9600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Silica Beads, 0.1 mm</td>
			<td style="width:167px;">Biospec Products Inc</td>
			<td>11079101Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:363px;">Precellys 24 homogenizer</td>
			<td style="width:167px;">Bertin Instruments</td>
			<td style="width:163px;">EQ03119-200-RD000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:167px;">Pierce (Thermo Scientific)</td>
			<td style="width:163px;">23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Cogent Diamond hydride type C column</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">70000-15P-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, 6200 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G6230B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Quat Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4204A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Bin Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4220A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Valve Drive, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1107A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Isocratic Pump, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1310B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">TCC, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1316C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Sampler, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G4226A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Thermostat, 1290 Series</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G1330B&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Chemical</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Tryptic Soy Broth</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Difco Agar, Granulated</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:163px;">214530</td>
			<td>Solid media contains 1.5% [w/v] agar</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Phosphate-buffered saline (pH 7.4) 10X</td>
			<td style="width:167px;">Ambion</td>
			<td style="width:163px;">AM9624</td>
			<td>Dilute fresh to 1X with ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A955-500</td>
			<td>Optima LC-MS</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Methanol</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">A456-500</td>
			<td>Optima LC-MS; toxic</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">Formic Acid</td>
			<td style="width:167px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">94318</td>
			<td>For mass spectrometry, 98%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Software</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">MassHunter</td>
			<td style="width:167px;">Agilent</td>
			<td style="width:163px;">G3337AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Bacterial Strain</td>
			<td style="width:167px;">Species</td>
			<td style="width:163px;">Strain</td>
			<td>Genotype</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:363px;">SRB 337</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>wild type</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:363px;">SRB 372</td>
			<td style="width:167px;">Staphylococcus aureus</td>
			<td style="width:163px;">USA200 MSSA UAMS-1</td>
			<td>&#916;codY::erm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:933px;">aChemicals and materials listed are specific to the method described and do not include standard laboratory chemicals or supplies.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tandem liquid chromatography&#8211;mass spectrometry-based approach for metabolite analysis of staphylococcus aureus

세균성 병원균을 저지하기위한 노력의 일환으로, 호스트는 종종 감염의 사이트에있는 영양소의 이용을 제한 할 수 있습니다. 이 제한은 규제 요인은 세포의 신진 대사를 조절, 대응되는 키 대사의 존재비를 변경할 수 있습니다. 최근에는 단백질과 RNA의 숫자가 독성 유전자 발현의 중요한 규제로 등장했다. 예를 들어, 코디 단백질 분지 쇄 아미노산 및 GTP의 레벨에 응답하고 널리 낮은 G + C 그램 양성 세균에 보존된다. 황색 포도상 구균의 글로벌 레귤레이터로서, 코디 독성 대사 유전자 수십개의 표현을 제어한다. 우리는 황색 포도상 구균이 코디가 부분적으로 잠재적 호스트 환경에서 발생하는 영양소 제한 조건에 적응하기위한 노력의 일환으로 자사의 대사 상태를 변경하는 데 사용하는 가설을 세웠다. 이 논문은 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토 그래피를 이용하여 S. 구균에서 대사를 추출하여 분석하는 방법을 설명trometry,이 가설을 테스트하기 위해 개발 된 프로토콜입니다. 이 방법은 또한 연속 chemostat 문화를 사용하지 않고 생물학적 정상 상태와 일정한 통기를 유지하는 등 엄격하고 재현성을 보장 모범 사례를 강조한다. USA200의 메티 실린 감수성 황색 포도상 구균에 대한 상대 UAMS -1- 모 균주를 분리은 동질 코디 돌연변이 아스파 테이트 (예를 들어, 트레오닌과 이소류신) 유래의 아미노산의 현저한 증가를 나타내 및 (그 전구체 감소 예, 아스파라긴산 및 O의 -acetylhomoserine ). 이러한 결과는 RNA-서열 분석으로 얻어진 전사 데이터와 상관 관계가 다음 코디 널 돌연변이의 10 및 800 배 사이의 상향 조절이 경로의 유전자가 있었다. 사체와 대사 체의 글로벌 분석을 커플 링하는 것은 환경이나 영양 스트레스에 직면했을 때 박테리아가 PHY를에 잠재적 인 통찰력을 제공하고, 신진 대사를 변경하는 방법을 밝힐 수영양 결핍과 관련된 iological 변화는 감염 동안 경험했다. 이러한 발견은 새로운 항 감염 제 및 치료제의 개발을위한 방법을 포장 할 수있다.

우리는 풍부하고 복잡한 배지에서 체외 성장 동안 S. 구균 세포 내 대사 풀을 분석 하였다. 원리 증명 된 바와 같이, 우리는 비교 메티 실린 감수성 S. 구균 골수염 간 대사 프로파일 UAMS -1- (야생형 [WT]) 및 글로벌 전사 조절 코디 (Δ 코디) (26)가없는 동종의 균주를 분리. 프로토콜의 단계 2에 기술 된 바와 같이 정상 상태에서, WT 및 코디 균주의 지수 배양, TSB 배지에 설립되었다. 야생형과 코디 -null 돌연변이 문화의 성장 동작은 성장 수율과 속도 (그림 1)에서 경증 차이, 유사 하였다. RNA-SEQ 및 마이크로 어레이 기술을 사용하여, 우리와 다른 아스파 테이트에서 파생 된 아미노산의 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 여러 유전자가 코디 -null 돌연변이 C에서 해제 억압 된 것으로 나타났다TSB 체외 성장 (도 2) 25, 27, 30 중 WT 세포 ompared. 또한 brnQ1 및 brnQ2, 분지 쇄 아미노산 permeases위한 코드는 codY- 널 변이체 30, 35에서 과발현된다. 널 돌연변이로 변형되어 상기 경로와 연관된 대사 정상 세포 존재비, 우리는 LC-MS 기반 대사 산물 프로파일 링이 수행되는 정도를 결정한다. WT 및 codY- 널 돌연변이 세포 생물학적 안정 상태로 성장하고, 프로토콜의 단계 4에 기재된 바와 같이 채취 하였다. 우리는 (재료 목록 참조) 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 각 크로마토 그래피 해결 대사에 대한 강도 이온 피크 영역을 통합하여 대사 산물 중 농도를 결정했다. 우리는 DIFF 보정각 시료의 잔류 펩티드 농도 대사 존재비를 정규화하여 바이오 매스 erences. 우리는 상기 각 샘플 내의 모든 대사 물질의 평균 이온 개수를 계산하여 상기 기준 값 야생형 샘플을 사용하여 샘플 간의 전위 배치 효과에 대한 이들 값을 수정. 이 방법은 조건에서 대사 산물 중 농도의 간 샘플 비교를 활성화. 주어진 샘플 내의 간 대사 비교 마찬가지로 제 표준 첨가 법을 사용하여 양의 몰 이온 카운트에서 정규화 대사 존재비를 변환함으로써 달성 될 수있다. 우리는 UAMS-1과 codY- 널 돌연변이의 아스파 테이트 경로의 핵심 중간체의 수준을 비교했다. 그림 3에서 보는 바와 같이, (예를 들어, 쓰 레오 닌 (ISO) 류신)이 경로의 최종 제품은 코디 -null 돌연변이 세포에서 더 풍부 전구체 동안 (예를 들면,아스 파르 테이트 및 O 아세틸 호모 세린)는 WT 세포에서 더욱 풍부하다. BrnQ의 결합 된 상향 조절은 36 permeases 및 ILV 생합성 경로 가능성 류신 및 이소류신 (30)의 증가를 이끈다. 차이점은 (&lt;4 배) 비교적 작지만, 정량 및 배치 보정 코디에 의해 매개되는 전사 변형과 일치 견고하고 통계적으로 유의 한 변화를 나타내 LC-MS 기반. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55558/55558fig1.jpg" /> 도 1 : S. aureus에 UAMS-1의 성장 거동 및 TSB에서 동질 코디 -null 돌연변이. 예비 배양 물이 OD 600 ~ 1 시간 후에 달성에게 정상 상태에서 소비 지수 성장 세포를 확장하기 위해, 신선한 배양 배지에서 0.05의 광학 농도로 다시 희석 하였다. LC-MS 대사 물질 분석 용 샘플을 수집했다실험 문화 ~ 0.5 (화살표)의 광학 밀도. 표시된 데이터는 세 개의 복제 생물학적 대표. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55558/55558fig2.jpg" /> 도 2 : 아스파라긴산으로부터 유도 선택된 대사 회로도. 유전자와 그 제품은 이탤릭체로 표시되어 아스파라긴산 계 아미노산의 합성을 촉매 오페론; RNA-29 서열 분석에 의해 결정된 바와 같이 코디 -null 돌연변이에 전사 개체수의 증가는 야생형에 비해, 또한 주목된다. DHP 2,6- diaminoheptanedioate (2,6- 디아 미노). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55558/55558fig3.jpg" /> 그림 3 : 아스 파르 테이트 가족의 대사 산물 중 농도는 코디의 돌연변이에 변경된다. 에서 선택된 대사 로그 2 -fold 변경UAMS -1- (WT)에 비해 codY- 널 돌연변이 나타낸다. 변화는 으 스트레인의 생물학적 세 복제 평균 풍부하여 codY- 널 균주의 생물학적 세 복제 평균 풍부 나누어 계산 하였다. 각 대사 생물학적 복제 사이의 표준 오차는 35 % &lt;이었다. 파선 로그 2 1.5 배로 변경이 실험에서 사용되는 차단을 나타낸다.

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A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

여기서 우리는 액체 크로마토 그래피 및 질량 분석을 통해 황색 포도상 구균과 이후 분석에서 대사 물질의 추출을위한 프로토콜을 기술한다.

의 대사 산물 분석을위한 탠덤 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 기반 접근<em&gt; 포도상 구균</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

a-tandem-liquid-chromatographymass-spectrometry-based-approach-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.0K 조회수.  Georgetown University.  여기서 우리는 액체 크로마토 그래피 및 질량 분석을 통해 황색 포도상 구균과 이후 분석에서 대사 물질의 추출을위한 프로토콜을 기술한다. 

비디오: A Tandem Liquid Chromatography–Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

가역 디설파이드 가교 미셀 제조를위한 손쉬운 효율적인 접근법

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

연구

생화학

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

효소 활성 G4 Resolvase1의 정화를위한 G-quadruplex DNA 화성 접근

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, we developed IDBac&#8212;a low-cost and high-throughput matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) bioinformatics pipeline. IDBac software is designed for non-experts, is freely available, and capable of analyzing a few to thousands of bacterial colonies. Here, we present procedures for the preparation of bacterial colonies for MALDI-TOF MS analysis, MS instrument operation, and data processing and visualization in IDBac. In particular, we instruct users how to cluster bacteria into dendrograms based on protein MS fingerprints and interactively create Metabolite Association Networks (MANs) from specialized metabolite data.

IDBac is an open-source mass spectrometry-based bioinformatics pipeline that integrates data from both intact protein and specialized metabolite spectra, collected on cell material scraped from bacterial colonies. The pipeline allows researchers to rapidly organize hundreds to thousands of bacterial colonies into putative taxonomic groups, and further differentiate them based on specialized metabolite production.

미생물 단백질 및 특수 대사 산물 데이터 분석을 위한 오픈 소스 MALDI TOF-MS IDBac 파이프라인 사용

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

디테르페노이드 천연제품의 효소 생산 및 정화를 위한 맞춤형 접근법

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of biological membranes, energy storage and production, cellular signaling, vesicular transport of proteins, organelle biogenesis, and regulated cell death. Because the budding yeast Saccharomyces cerevisiae is a unicellular eukaryote amenable to thorough molecular analyses, its use as a model organism helped uncover mechanisms linking lipid metabolism and intracellular transport to complex biological processes within eukaryotic cells. The availability of a versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of major classes of lipids within a yeast cell is crucial for getting deep insights into these mechanisms. Here we present a protocol to use liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of major cellular lipids of S. cerevisiae. The LC-MS/MS method described is versatile and robust. It enables the identification and quantification of numerous species (including different isobaric or isomeric forms) within each of the 10 lipid classes. This method is sensitive and allows identification and quantitation of some lipid species at concentrations as low as 0.2 pmol/&#181;L. The method has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. The use of alternative mobile phase additives for electrospray ionization mass spectrometry in this method can increase the efficiency of ionization for some lipid species and can be therefore used to improve their identification and quantitation.

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry to identify and quantify major cellular lipids in Saccharomyces cerevisiae. The described method for a quantitative assessment of major lipid classes within a yeast cell is versatile, robust, and sensitive.

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management of product yield and quality. Metabolomics data provides a read-out of these interactions at a given moment in time and is informative of an organism&#39;s biochemical status. Further, individual metabolites or panels of metabolites can be used as precise biomarkers for yield and quality prediction and management. The plant metabolome is predicted to contain thousands of small molecules with varied physicochemical properties that provide an opportunity for a biochemical insight into physiological traits and biomarker discovery. To exploit this, a key aim for metabolomics researchers is to capture as much of the physicochemical diversity as possible within a single analysis. Here we present a liquid chromatography-mass spectrometry-based untargeted metabolomics method for the analysis of field-grown wheat grain. The method uses the liquid chromatograph quaternary solvent manager to introduce a third mobile phase and combines a traditional reversed-phase gradient with a lipid-amenable gradient. Grain preparation, metabolite extraction, instrumental analysis and data processing workflows are described in detail. Good mass accuracy and signal reproducibility were observed, and the method yielded approximately 500 biologically relevant features per ionization mode. Further, significantly different metabolite and lipid feature signals between wheat varieties were determined.

A method for the untargeted analysis of wheat grain metabolites and lipids is presented. The protocol includes an acetonitrile metabolite extraction method and reversed phase liquid chromatography-mass spectrometry methodology, with acquisition in positive and negative electrospray ionization modes.

밀 곡물의 비표적 액체 크로마토그래피 질량 분광계 기반 대사체학 분석

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...