이 프로토콜을 따르면 사용자는 시험관 내 또는 생체 내 응용 프로그램에 적합한 고순도 및 수율의 AAV 벡터를 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 구성의 차이로 다양한 AAV 혈청형을 생산하고 정화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 두 가지 요소를 결합하면 세포 유형 및 조직 특정 발현을 얻는 데 유용할 수 있다.
일부 혈청형의 생산은 낮은 수율을 줄 수 있습니다. 이것은 가까운 혈청형이 있고 개별적으로 평가되어야 하는 생산입니다. 이러한 절차를 시연하는 것은 실험실의 기술자인 셸리 프리퐁(Shelly Fripont)이 될 것입니다.
HEK 세포를 성장한 후, 360 마이크로그램의 도우미 플라스미드, 벡터 캡시드를 인코딩하는 플라스미드 180 마이크로그램, DNA 혼합을 준비하기 위해 150 밀리미터 나트륨 염화물의 18 밀리리터에 트랜스진을 함유한 플라스미드 180 마이크로그램을 혼합한다. 이 믹스를 50밀리리터 원물 튜브 3개에 분배합니다. 새로운 원판 튜브에서 PEI 840 마이크로그램과 150 밀리머 나트륨 염화 나트륨 6 밀리리터를 혼합하여 6개의 세포 배양 요리에 대한 PEI 믹스를 준비합니다.
그런 다음, PEI 믹스의 6 밀리리터를 첨가하고, 방울로 떨어뜨리고, DNA 혼합을 포함하는 원뿔형 튜브 중 하나에 첨가한다. 실온에서 20분 동안 배양하세요. 다음으로 인큐베이터에서 6개의 세포 배양 접시를 제거합니다.
라미나르 플로우 후드에 각 접시에서 매체를 완전히 흡인시합니다. 미리 데워진 DPBS 5밀리리터로 접시를 헹구어 매체의 흔적을 제거합니다. DPBS가 전체 표면에 고르게 분포되도록 각 접시를 부드럽게 기울입니다.
그런 다음 DPBS를 부드럽게 흡인합니다. DMEM 12 밀리리터를 각 접시에 천천히 넣고 파이펫을 접시 가장자리에 놓습니다. PEI와 DNA 혼합물을 3~5회 위아래로 배관하여 섞는다.
이 혼합물의 2 밀리리터를 드롭 패션으로 한 방울씩 첨가하여 전체 표면에 조심스럽게 분배하십시오. 18 세포 배양 접시에 도달 할 때까지 한 번에 여섯 세포 배양 접시를 사용하여이 과정을 반복합니다. PEI DNA 혼합물을 분배하기 위해 세포 배양 접시를 부드럽게 흔들어 줍니다.
전감염된 세포를 섭씨 37도에서 95%의 습도, 5시간 동안 이산화탄소5%로 배양합니다. 그 후 기존 배지를 제거하지 않고 18가지 요리에 각각 12밀리리터의 DMEM 10을 추가합니다. 동일한 조건에서 감염된 세포를 계속 배양하십시오.
72시간 후 의질전환시, 세포 스크레이퍼를 사용하여 각 배양 접시에서 세포를 조심스럽게 분리합니다. 15 밀리리터 원모 튜브에서 두 배양 요리의 배지와 세포를 수집하여 얼음 위에 보관합니다. 원심분리기는 420배, 섭씨 4도에서 10분간 10분간 원심분리기의 가속과 감속을 최대로 설정합니다.
조심스럽게 폐기물 처리 용기에 부어 각 튜브에서 상체를 폐기. 그런 다음 세포 펠릿을 함유한 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 우리는 리시스 버퍼의 두 밀리리터에 각 펠릿을 일시 중단하고 5 ~ 10 번 위아래로 파이펫을 하여 혼합합니다.
세 개의 튜브에서 AAV를 함께 가져옵니다. 시작하려면 에탄올과 혼합된 드라이 아이스를 포함하는 양동이에 배치하여 다시 중단된 세포를 동결하십시오. 그런 다음 즉시 섭씨 37도에 설정된 수조에 배치하여 세포를 해동하십시오.
이 동결 및 해동 주기를 세 번 반복하여 세포를 lyse하고 AAV 입자를 방출합니다. 세 번째 해동 단계 후, 원심분리기는 1167회 G, 섭씨 4도에서 15분 동안. 수퍼네이츠를 조심스럽게 옮겨 50밀리리터 원내 튜브를 청소합니다.
각 튜브에 핵을 첨가하여 상피의 밀리리터당 50단위의 최종 농도를 가집니다. 30분 동안 섭씨 37도에서 배양하고, 10분마다 튜브를 소용돌이치며 핵이 상체와 철저히 혼합되도록 합니다. 원심분리기는 13490회 G의 경우, 섭씨 4도에서 20분간 상복부를 명확히 합니다.
그런 다음 10 밀리리터 주사기의 플런저를 제거하고 0.45 마이크로미터 필터를 주사기에 부착하고 깨끗한 50 밀리리터 원유형 튜브 위에 놓습니다. 주사기를 명확히 한 상체로 조심스럽게 채웁니다. 플런저를 사용하여 필터를 통해 용해를 강제로 사용합니다.
다음으로, 표에 설명된 대로 각 iodixanol 분획을 4개의 별도의 50 밀리리터 원뿔 튜브로 준비합니다. 파이펫 8 밀리리터의 15% iodixanol세 개의 초원심분리기 튜브 각각에 넣습니다. 파이펫 5.5 밀리리터25% 이오디산놀이 깨끗한 50밀리리터 원콘튜브에 들어간다.
미립자 파스퇴 파이펫을 사용하여 15% iodixanol 솔루션보다 25% 미만의 5.5 밀리리터를 신중하게 층으로 레이어합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 40%와 60%의 솔루션을 추가합니다. Iodixanol 분수는 레이어링에 혼합해서는 안됩니다.
파스퇴르 파이펫을 사용하여 원유 리세이트 15% 이오디산올 그라데이션 위에 원유 리세이트를 레이어링하여 드롭으로 떨어뜨려 원유 리세이트와 이오디산올 용액 사이의 인터페이스를 방해하지 않도록 합니다. 반월상연골이 튜브 목의 기저에 도달할 때까지 각 초원심심분리관을 충진하여 튜브가 극심분리 시 발생하는 매우 높은 힘 하에서 붕괴되지 않도록 한다. 적절한 뚜껑을 사용하여 튜브를 닫습니다.
디지털 스케일을 사용하여 세 개의 초원심 분리 튜브가 모두 동일한 무게를 가지고 있는지 확인하십시오. 원유 리세이트 위에 더 많은 리시스 버퍼를 추가하여 필요에 따라 무게를 조정합니다. 고정 각도 티타늄 로터를 사용하여 튜브를 301580G, 최대 가속 및 감속을 사용하여 1시간 40분 동안 12도에서 원심분리합니다.
다음으로 바늘을 5 밀리리터 주사기에 부착합니다. 로터의 튜브에서 스페이서를 제거하고 원심화 후 튜브를 복구합니다. 벡터 입자를 포함하는 40% iodixanol 분획만 흡인합니다.
샘플을 처리하거나 섭씨 4도에 보관하십시오. 여기서, 프로토콜은 다양한 캡시드, 게놈 구성, 프로모터 유형 및 유전자 화물을 사용하여 AAV 벡터를 생성하는 데 사용될 수 있음을 입증한다. 이 예에서, 우리는 자기 무료 게놈에서 녹색 형광 단백질을 표현한 두 개의 다른 AAV 벡터를 생성하고 정제하였다.
두 벡터는 서로 다른 capsids:PHPB 및 AAV9로 구별됩니다. 그(것)들은 꼬리 정맥 주입을 통해, 성인 C57 검은 6 마우스로 전달되었습니다. 3주 후 환원발수준을 평가하기 위해, 형광염에 컨쥬게이트된 이차 항체를 이용한 검출을 통해 GFP에 대한 1차 항체로 염색된다.
형광 강도 측정은 PHPB 벡터가 AAV9에 비해 사용될 때 GFP 발현이 현저한 증가를 나타낸다. GFP의 증가는 뇌관, 소뇌, 그리고 뇌간에서 관찰되었다. 분획을 포함하는 벡터의 정확한 수집은 이 프로토콜에 매우 중요합니다.
제대로 수행되지 않은 경우 벡터 수율뿐만 아니라 벡터 순도가 부정적인 영향을 받습니다. AAV 벡터를 생성할 수 있는 작은 실험실은 중추 신경계에 있는 유전자를 전달하기 위하여 수많은 실험가능성을 이용하는 위치에 있을 것입니다. 이 프로토콜은 초원심분리기의 사용을 필요로하며 사고를 피하기 위해이 작업을 처리하기 전에 적절한 교육을받는 것이 중요합니다.
또한 AAV 벡터는 종종 바이오 해저드로 분류되므로 해당 벡터를 처리하고 관리하기 전에 현지 규정을 준수해야 합니다.
