이 방법은 미토성 네트워크 뒤에 있는 조절 기계장치 및 세포 주기 시계의 동적 속성 및 기능과 같은 시스템 생물학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 각각 다중 세포 주기가 있는 대량의 물방울을 생성하여 정량적 조작 및 분석을 위한 높은 처리량 프레임워크를 제공한다는 것입니다. 시작하려면 동물과 식물극 사이의 경계가 불분명한 계란의 배치 또는 동물 극 위에 불규칙한 흰색 반점이 있는 것을 폐기하십시오.
다음으로, 한 여성 개구리에서 계란의 적절 한 배치를 선택 하 고 600 밀리 리터 비커에 계란을 전송. 0.2배MMR 버퍼를 과도하게 붓고, 1배 추출 버퍼에 시스테인을 달걀에 부드럽게 넣습니다. 그 후, 비커를 손으로 힘차게 흔들어 계란의 젤리 코트를 제거합니다.
시스테인 버퍼의 총 800 밀리리터와 또는 계란이 집계하고 비커의 바닥에 정착 할 때까지세 번 이 세척을 반복합니다. 젤리 코트를 제거한 후 0.2x MMR 용액 1리터로 계란을 4회 세척합니다. 유리 파이펫을 사용하여 흰색으로 변하는 알을 집어 들고 버립니다.
비커에서 MMR 버퍼를 붓고 200 밀리리터의 칼슘 이오노포어 용액을 계란에 넣습니다. 유리 파이펫을 사용하여 계란이 활성화될 때까지 부드럽게 저어주고, 칼슘 이오노포어 용액을 제거합니다. 너무 오랫동안 칼슘 이오노포어 용액에 계란을 두면 멸망을 시작할 수 있습니다.
계란을 1.5분 간 저어서 활성화 효율을 확인합니다. 활성화되지 않은 경우 교반을 다시 시작하고 90%의 활성화가 이루어질 때까지 더 자주 확인합니다. 계란이 비커의 바닥에 정착 한 후 활성화 효율성을 확인하십시오.
잘 활성화 된 계란은 동물 극의 약 25 %와 식물극의 75 %를 가지고 있습니다. 다음으로, 프로테아제 억제제로 보충된 추출물 버퍼의 총 부피 50 밀리리터로 계란을 두 번 씻으시면 됩니다. 그런 다음 계란을 0.4 밀리리터 스냅 캡 마이크로튜브로 조심스럽게 옮기습니다.
마이크로튜브를 200g에서 60초 간 원심분리한 다음 600g에서 30초 간 계란을 포장합니다. 그런 다음 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 각 단계 후 계란 위에 과도한 버퍼를 제거합니다. 그 후, 15, 000 g에서 4섭씨에서 10분간 계란을 분쇄하십시오.
면도날을 사용하여 튜브를 잘라 서 세 겹의 으깬 달걀을 분리하고 중간 층에 조잡한 세포질을 유지합니다. 그런 다음, 조질 세포질을 옮겨 초원심분리기 튜브를 청소합니다. 프로테아제 억제제와 사이토찰라신 B를 각각 밀리리터당 10 마이크로그램으로 보충합니다.
원유 세포질을 15, 000g, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다. 그런 다음 면도날을 사용하여 튜브를 자르고 중간 층에 세포질을 유지합니다. 갓 준비한 추출물을 얼음 위에 놓습니다.
먼저, 준비된 추출물에 세큐린-mCherry mRNA를 첨가한다. 다음으로, 추출물 mRNA 혼합물에 2%PFPE-PEG 형광활성제의 200마이크로리터를 추가한다. 소용돌이 믹서를 사용하여 물방울을 생성하여 필요에 따라 소용돌이 속도와 지속 시간을 조정합니다.
그런 다음 방울을 육안으로 검사하여 크기가 균일했는지 확인합니다. 200 마이크로리터 파이펫을 사용하여 위에 떠 있는 액적과 동일한 계면활성제를 PCR 튜브로 옮습니다. 유리 튜브를 물방울 층에 담그고 물방울이 튜브의 약 75 %를 채울 때까지 기다립니다.
그런 다음 튜브를 계면활성제 층으로 밀어 넣고 튜브를 완전히 채웁니다. 다음으로, 유리 바닥 접시에 미네랄 오일을 채웁니다. 그런 다음 미세 핀셋을 사용하여 액적으로 채워진 튜브를 오일에 담급다.
유리 파이펫을 사용하여 눈에 보이는 이물질이나 유출된 물방울을 제거합니다. 물방울의 움직임과 누출을 피하기 위해 물방울로 채워진 유리 튜브는 미네랄 오일 아래에 조심스럽게 침지되어야합니다. 양 끝에서 균형을 맞추거나 튜브 끝에 미네랄 오일 몇 방울을 동시에 추가할 수 있습니다.
그 후, 전동식 xy 스테이지를 장착한 피형성 현미경을 사용하여 물방울을 이미지화한다. 물방울이 활동을 잃을 때까지 밝은 필드에 시간 경과 비디오를 기록하고 6 ~ 9 분마다 여러 형광 채널을 기록합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 핵을 가진 간단한, 핵 없는 세포 및 복잡한 세포 둘 다에 있는 미토성 진동이 생성되었습니다.
핵없는 방울은 92 시간 동안 최대 30 개의 무양 식 사이클을 생성했습니다. 하류 미토틱 이벤트를 구동하는 미토틱 발진기의 능력도 조사되었다. 자기 지탱된 미토틱 발진기는 뚜렷한 세포 주기 단계의 자율적 변경을 통해 관찰된 핵 형태학의 변화를 주도했습니다.
이 절차를 시도하는 동안, 그것은 시간에 민감한, 추출을 만들 때 시간을 염두에 기억하는 것이 중요합니다, 항상 계란을 유지하고 얼음에 추출. 개발 후, 이 기술은 제노푸스 laevis의 튜닝성과 스토세서티와 같은 복잡한 시계 특성의 기본 원칙을 탐구하는 시스템 생물학 분야의 연구자들이 길을 열었습니다.
