저자는 여기 설명 하는 방법 설정 하는 동안 그들의 입력에 대 한 제롬 Larghero와 발레리 Vanneaux (Hôpital 세인트 루이스, 파리, 프랑스)에 감사 하 고 싶습니다.
이 작품은 ANR에서 교부 금에 의해 지원 되었다 [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation 부 라 검색 Médicale [바이오 공학 프로그램-DBS20140930777] LABEX 부활 [ANR-10-LABX-73] 올리비에 Goureau와 크리스텔 Monville에서. 그것은 NeurATRIS는 변환 연구 인프라 (Investissements d'Avenir) 신경 과학 [ANR-11-INBS-0011] 및 INGESTEM, 국가 인프라 (Investissements d'Avenir)에 biotherapies에 대 한 만능 기술에 의해 지원 되었다 고 차별화 된 줄기 세포 [ANR-11-INBS-000] 크리스텔 Monville에. 카림 벤 M'Barek DIM Stempole 및 LABEX 부활 [ANR-10-LABX-73] 장학금에 의해 지원 되었다. 줄기 협회 프랑세즈 contre 레 Myopathies (AFM)에서 지 원하는 희귀 질환에 대 한 Biotherapies 연구소의 일부입니다-Téléthon.

이 프로토콜에 사용 되는 모든 인간의 재료 유럽 연합 규정에 따라 사용 되었다. 이 연구에 사용 된 인간의 ES 세포 라인 독특한 배아에서 파생 되었다. 부부는 배아를 기증 했다 완벽 하 게 통보 했다 고 익명 기부에 대 한 그들의 동의 주었다. 임상 등급 인간 ES 세포 라인이이 배아에서 파생 된, 틀, 자격, 되었고 제대로 문서화로 슬 린 셀 (영국)에 의해. 햄 (APHP, Hôpital 세인트루이스) 병원 지침에 따르면 태 반 기증에 대 한 동의 서명 하는 어머니에 제왕 절 동안 무 균 조건 하에서 조달 했다.
1입니다. 문화 미디어 및 시 약의 준비
<ol><li>
RPE 세포 배양 매체의 준비
	<ol>
<li>RPE 세포 배양 매체를 준비 하려면 추가 4% 혈 청 대체 (20 mL 500 mL의 최종 볼륨에 대 한), 희석 1000 x 2-mercaptoethanol (500 mL의 최종 볼륨에 대 한 500 µ L), 및 1 %Eagle′s 최소 필수 매체 (MEM) 비 본질적인 아미노산 솔루션 (최종 5 mL 500 mL의 볼륨)를 수정된이 글 Dulbecco의 매체 (DMEM) 높은 포도 당 (475 mL 500 mL의 최종 볼륨에 대 한).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
전송/보존 매체의 준비
	<ol>
<li>전송/보존 매체를 준비 하려면 CO2페니실린-스 (5 mL 500 mL의 최종 볼륨에 대 한)의 1%를 추가-독립 매체 (495 mL 500 mL의 최종 볼륨에 대 한) 4 ° c.에 그것을 유지 하 고</li>
	</ol>
</li>
	<li>
물의 Resuspension thermolysin 효소의
	<ol>
<li>Thermolysin의 재고 솔루션의 준비<ol>
<li>Thermolysin의 재고 솔루션을 준비, 실내 온도-20 ° C에 저장 된 thermolysin 분말을 녹여.</li>
			<li>효소 활동 변수 배치에서 배치 될 수 있습니다, 사용할 수 일괄 처리의 thermolysin 가루와 함께 제공 된 분석의 인증서에 따라이 작업을 계산 합니다. 분할은 "활동 중립 Protease 계산 = ANPC" (분석의 인증서에 표시 된) 181 (이 티로신의 분자량)에 의해. 결과 얻은 제공 된 thermolysin 분말 (U/유리병)의 총 효소 활동에 해당 합니다.</li>
			<li>총 효소 활동 (U/유리병) 200 (U/mL)로 나눈 값에 해당 하는 물의 볼륨을 추가 하 여 200 U/mL에서 재고 솔루션을 준비 합니다.</li>
			<li>위쪽 및 아래쪽에 추가 된 물 pipetting으로 효소를 분해. 소용돌이 30 s 및 확인에 대 한 솔루션 여부 분말 완전히 일시 중지 되었습니다. 더 많은 pipetting 전체 해산에 대 한 필요할 수 있습니다.</li>
			<li>약 수 재고 솔루션-20 ° c.에 그것을 저장 하 고</li>
		</ol>
</li>
		<li>Thermolysin의 작업 솔루션의 준비 참고: thermolysin 솔루션 햄 치료 당일에 준비 되어야 한다.<ol>
<li>해 동 thermolysin-20 ° c.에 저장 된 200 U/mL에서의 주식 aliquots 1 U/mL의 마지막 효소 활동을 얻기 위하여 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 재고 솔루션 200 x 희석. 1-4 햄 패치 치료 40 mL를 준비 합니다.</li>
			<li>Thermolysin 솔루션을 사용 하 여 0.2 µ m 필터 사전 통해 필터링.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
젤라틴의 물의 Resuspension
	<ol>
<li>20% 젤라틴 솔루션 및 블록의 준비 참고: 20% 젤라틴 솔루션 및 블록 수 있습니다 준비까지 사용 하기 전에 1 주.<ol>
<li>CO2를 따뜻한-42 ° c (최대 1 h) 30 분 물 욕조에 독립 매체. 50 mL 튜브에 추가의 40 mL에 젤라틴의 10 g CO2예 열-독립 매체 및 소용돌이 솔루션.</li>
			<li>42 ° c.에 30-60 분 젤라틴 해산 소용돌이 균질 솔루션을 각 10 분.</li>
			<li>일단 해결책은 균질, 4 6 cm 문화 요리 20% 젤라틴 솔루션의 4 mL를 추가 합니다. 거품을 하지 마십시오. 요리를 보호 하기 위해 플라스틱 파라핀 영화를 추가 하 고 4 ° c.에 강화 하기 위해 솔루션을 수</li>
		</ol>
</li>
		<li>8% 젤라틴 용액의 준비 참고: 8% 젤라틴 솔루션 사용 하기 전에 날 준비 그리고 4 ° c.에 저장<ol>
<li>CO2를 따뜻한-42 ° C (최대 1 h) 30 분 동안에 독립 매체. 50 mL 튜브에 추가의 46 ml 젤라틴 4 g CO2예 열-독립 매체 및 소용돌이 솔루션.</li>
			<li>42 ° c.에 30-60 분 젤라틴 해산 플라스틱 파라핀 영화 튜브를 보호 하 고 계속 물 욕조에 37 ° C에서 같은 날 사용 하는 경우를 추가 하거나 나중에 사용 하는 경우 4 ° C에서 그것을 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Thermolysin 치료 인간 양수 막의
<ol><li>
인간의 양수 막 세척
	<ol>
<li>햄 작은 조각 (약 30 x 30 mm) PBS에 4 ° C에서 이미 나일론 비 계에 고정 또는 고정으로 제공 했습니다. 제공 하는 경우 30 분 동안 인큐베이터에서 37 ° C에서 막 해 동 냉동.</li>
		<li>세포 막 세척:<ol>
<li>PBS의 80 mL를 포함 하는 250 mL 병에서 1-4 막 장소. 많은 병을 사용 하 여 필요에 따라.</li>
			<li>5 분 동안 고속에 판 통에 각 병을 흔들어 다음 PBS를 삭제 합니다. PBS와 반복의 80 mL를 추가 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Thermolysin 치료
	<ol>
<li>포함 하는 막 병 당 thermolysin (1 U/mL)의 작업 솔루션의 40 mL를 추가 (1-4 막 병; 당 한 번에 최대 3 병).</li>
		<li>450 rpm 그리고 소용돌이에 5 분 동안 병을 흔들어 30 그들 s. 1 x 반복.</li>
		<li>Thermolysin 솔루션을 삭제 하 고 PBS의 80 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>450 rpm에서 5 분 동안 병을 흔들어. PBS를 삭제 하 고 PBS의 80 mL를 추가 합니다. 3 배를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 문화 삽입에 인간의 양수 막의 고정
<ol><li>햄 하나, 하나를 제거 하 긴 살 균 겸 자 (그는 병의 바닥을 도달할 수 있다)를 사용 하 고 각 햄 PBS의 10 mL를 포함 하는 10 cm 문화 접시에 전송.</li>
	<li>10 mL PBS의 포함 된 새로운 10 cm 문화 접시, 아래로 나일론 막의 한을 놓습니다. 2 나일론에 멤브레인을 해결 하는 데 사용 되는 4 개의 클립을 분리 합니다.</li>
	<li>나일론 및 막 사이 문화 삽입의 작은 링을 삽입 합니다.</li>
	<li>막 작은 반지를 완전히 덮는 다는 것을 확인 하십시오. 막 위에 문화 삽입의 두 번째 부분을 클립. 햄의 지하실 막 문화 삽입 내부 직면 하고있다. 마지막 두 클립을 분리 합니다.</li>
	<li>잘라, 멸 균가 위로, 문화 삽입 필요한 경우 외부 막의 초과. 12-잘 접시에 문화 삽입에서 고정 막 전송 집게를 사용 하 여 PBS를 더하고 37 ° C, 5% CO2인큐베이터에 접시를 저장.</li>
	<li>다른 멤브레인과 (3.2 3.5 단계)에서 이러한 작업을 반복 합니다.</li>
</ol>4. 해빙 및 인간 양수 내 세포 막에 망막 안료 상피 세포의 시드
<ol><li>
망막 색소 상피 세포의 해빙
	<ol>
<li>RPE 세포 은행 극저온 유리병 당 1 백만 세포에서 액체 질소에서 고정입니다. 필요에 따라 많은 극저온 튜브를 녹여 (350000 세포 막 당 시드 있습니다).</li>
		<li>극저온 유리병 당 RPE 매체의 3 mL를 포함 하는 15 mL 튜브를 준비 합니다. 일단 병 동 각 튜브를 셀을 전송 합니다. 다른 튜브에 대 한이 작업을 반복 합니다.</li>
		<li>균질 (위쪽 및 아래쪽을 몇 번을 플라스틱 resuspend RPE 중간에 셀) 셀 솔루션의 10 µ L과 1.5 mL 튜브에 그것을 전송. Trypan 블루의 10 µ L를 추가 합니다. 세 실에서이 솔루션의 장소 15 µ L 다음 가능한 셀 (파란색에서 색 하지) 4 X 목표 현미경의 수를 계산 합니다. 다른 튜브에 대 한이 작업을 반복 합니다.</li>
		<li>한편, 원심에서 110 x g 5 분 삭제에 대 한 15 mL 튜브는 상쾌한 고 700000 셀/mL에서 셀 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인간 양 막 세포 막으로 망막 색소 상피 세포의 시드
	<ol>
<li>포함 하는 인큐베이터에서 막 12 잘 플레이트를 제거 합니다.</li>
		<li>PBS 발음 준비 단계 4.1.4 문화 삽입의 센터에에서 세포 현 탁 액의 500 µ L를 추가 합니다. (잘) 내 문화 삽입 외부 RPE 매체의 1 mL를 추가 합니다. 다른 막에 대 한 반복 합니다.</li>
		<li>포함 하는 인큐베이터에서 막 12-잘 접시를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 인간의 양수 내 세포 막에 망막 안료 상피 세포 배양의 유지 보수
<ol><li>중간 2 갱신 월요일과 금요일 때까지 적어도에 보통 주당 x 문화권의 일 30.</li>
	<li>각 잘 문화 삽입 내외 매체를 발음 하 고 신선한 매체 (문화 삽입 외부 1 mL 및 내부 500 µ L)으로 갱신. 37 ° C, 5% CO2배양 기에서 접시를 놓습니다.</li>
</ol>6. 망막 안료 상피 패치 이식에 대 한 준비
참고: 하루 30 문화에서 시작, 조직이 식을 위한 준비 이다.
<ol><li>따뜻한 물 목욕 30 분 동안 37 ° C에서 8% 젤라틴 솔루션 작성 찬 CO2와 vibratome의 내부 챔버-독립 매체 (4 ° C)에서.</li>
	<li>
장소는 vibratome로 20% 젤라틴 블록.
	<ol>
<li>냉장고에서 20% 젤라틴의 블록을 포함 하는 6 cm 문화 접시를 가져가 라. 메스를 사용 하 여, 5 cm x 5 cm 블록을 잘라. Cyanoacrylate 접착제 또는 해당 지원 블록의 상단 측면을 붙여 넣습니다.</li>
		<li>장소는 vibratome에 새로운 블레이드입니다.</li>
		<li>면도날의 동일한 수준에 올 때까지 블록의 레벨을 조정 합니다.</li>
		<li>신선한 CO2지원 주위 목욕을 채우기-4 ° c.에 독립 매체 Vibratome 블록 균일 하 게 잘라 때까지 중간 속도 사용 하 여, 매끄러운 표면에 지도 함께 블록을 잘라. 0 위치를 설정 합니다.</li>
		<li>그것은 완전히 건조 될 때까지 젤라틴의 블록 주위 매체 발음 그리고 포함 하는 37 ° c.에 인큐베이터에서 조직 12 잘 문화 접시</li>
		<li>집게를 사용 하 여 신중 하 게 젤라틴 블록 위에 문화 삽입을 엽니다. 커트가 위, 막 (세포 배양 하지 했다 반지) 외부 세포를 포함 하지 않는의 모든 부분. 전체 잔여 중간 발음</li>
		<li>멤브레인을 커버 하기 위해 37 ° C에 액체 8% 젤라틴 용액 1 mL를 추가 합니다. 초과 조심 스럽게 제거. 응고에 젤라틴을 허용 하도록 5-8 분을 기다립니다.</li>
		<li>신선한 CO2추가-막 덮여 때까지 목욕 (4 ° C)에서 독립 매체.</li>
		<li>절단, 블록 동작 하는 방법을 알고 남은 중간 속도-100 µ m의 위치에 vibratome와 함께. 섹션의 끝에, 조직의 방향을 유지 하기 위해 주의 해야 합니다.</li>
		<li>메스, 잘라 섹션의 방향을 식별 하는 코너.</li>
		<li>주걱으로 젤라틴에 포함 된 멤브레인을 수집 하 고 받는 사람 눈으로 접목까지 4 ° C에서 보존 매체 가득 6 잘 플레이트에 배치.</li>
		<li>이식 시 수술 현미경 (쥐에 대 한 1-3, 비 인간 영장류에 대 한 10-15 m m2 ) 받는 사람 눈의 크기에 임 플 란 트의 크기를 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function.">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li><li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinitis+pigmentosa.">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).</li><li>Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+mutations+causing+retinitis+pigmentosa.">Genes and mutations causing retinitis pigmentosa.</a> Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).</li><li>Gehrs, K. M., Anderson, D. H., Johnson, L. V., Hageman, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration--emerging+pathogenetic+and+therapeutic+concepts.">Age-related macular degeneration--emerging pathogenetic and therapeutic concepts.</a> Annals of Medicine. 38 (7), 450-471 (2006).</li><li>Swaroop, A., Chew, E. Y., Rickman, C. B., Abecasis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+a+multifactorial+late-onset+disease:+from+genetic+susceptibility+to+disease+mechanisms+for+age-related+macular+degeneration.">Unraveling a multifactorial late-onset disease: from genetic susceptibility to disease mechanisms for age-related macular degeneration.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 10, 19-43 (2009).</li><li>Khandhadia, S., Cherry, J., Lotery, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration.">Age-related macular degeneration.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 724, 15-36 (2012).</li><li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet. Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).</li><li>Ben M'Barek, K., Regent, F., Monville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+pluripotent+stem+cells+to+study+and+treat+retinopathies.">Use of human pluripotent stem cells to study and treat retinopathies.</a> World Journal of Stem Cells. 7 (3), 596-604 (2015).</li><li>Ben M'Barek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ESC-derived+retinal+epithelial+cell+sheets+potentiate+rescue+of+photoreceptor+cell+loss+in+rats+with+retinal+degeneration.">Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration.</a> Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).</li><li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li><li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+Stargardt's+macular+dystrophy:+Follow-up+of+two+open-label+phase+1/2+studies.">Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: Follow-up of two open-label phase 1/2 studies.</a> Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).</li><li>Hsiung, J., Zhu, D., Hinton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cell+monolayers+have+higher+resistance+to+oxidative+stress-induced+cell+death+than+nonpolarized+cultures.">Polarized human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cell monolayers have higher resistance to oxidative stress-induced cell death than nonpolarized cultures.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (1), 10-20 (2015).</li><li>Diniz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+implantation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells:+improved+survival+when+implanted+as+a+monolayer.">Subretinal implantation of retinal pigment epithelial cells derived from human embryonic stem cells: improved survival when implanted as a monolayer.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 54 (7), 5087-5096 (2013).</li><li>Kamao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+sheets+aiming+for+clinical+application.">Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).</li><li>Mandai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+induced+stem-cell-derived+retinal+cells+for+macular+degeneration.">Autologous induced stem-cell-derived retinal cells for macular degeneration.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1038-1046 (2017).</li><li>Thomas, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+functionality+of+hESC-derived+retinal+pigment+epithelium+cells+cultured+as+a+monolayer+on+polymer+substrates+transplanted+in+RCS+rats.">Survival and functionality of hESC-derived retinal pigment epithelium cells cultured as a monolayer on polymer substrates transplanted in RCS rats.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 57 (6), 2877-2887 (2016).</li><li>Borooah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+treat+retinal+disease.">Using human induced pluripotent stem cells to treat retinal disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 37, 163-181 (2013).</li><li>Leach, L. L., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Making+stem+cells+retinal:+Methods+for+deriving+retinal+pigment+epithelium+and+implications+for+patients+with+ocular+disease.">Concise review: Making stem cells retinal: Methods for deriving retinal pigment epithelium and implications for patients with ocular disease.</a> Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Lustremant, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+tool+to+model+a+form+of+Leber+congenital+amaurosis.">Human induced pluripotent stem cells as a tool to model a form of Leber congenital amaurosis.</a> Cellular Reprogramming. 15 (3), 233-246 (2013).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+Cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS Cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li><li>Maruotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule-directed,+efficient+generation+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+pluripotent+stem+cells.">Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10950-10955 (2015).</li><li>Stanzel, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+RPE+stem+cells+grown+into+polarized+RPE+monolayers+on+a+polyester+matrix+are+maintained+after+grafting+into+rabbit+subretinal+space.">Human RPE stem cells grown into polarized RPE monolayers on a polyester matrix are maintained after grafting into rabbit subretinal space.</a> Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).</li><li>Ilmarinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrathin+polyimide+membrane+as+cell+carrier+for+subretinal+transplantation+of+human+embryonic+stem+cell+derived+retinal+pigment+epithelium.">Ultrathin polyimide membrane as cell carrier for subretinal transplantation of human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelium.</a> PloS One. 10 (11), e0143669 (2015).</li><li>Thumann, G., Schraermeyer, U., Bartz-Schmidt, K. U., Heimann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Descemet's+membrane+as+membranous+support+in+RPE/IPE+transplantation.">Descemet's membrane as membranous support in RPE/IPE transplantation.</a> Current Eye Research. 16 (12), 1236-1238 (1997).</li><li>Kiilgaard, J. F., Scherfig, E., Prause, J. U., la Cour, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+amniotic+membrane+to+the+subretinal+space+in+pigs.">Transplantation of amniotic membrane to the subretinal space in pigs.</a> Stem Cells International. 2012, 716968 (2012).</li><li>Capeans, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+membrane+as+support+for+human+retinal+pigment+epithelium+(RPE)+cell+growth.">Amniotic membrane as support for human retinal pigment epithelium (RPE) cell growth.</a> Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (3), 271-277 (2003).</li><li>Ohno-Matsui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+amniotic+membrane+on+retinal+pigment+epithelial+cell+differentiation.">The effects of amniotic membrane on retinal pigment epithelial cell differentiation.</a> Molecular Vision. 11, 1-10 (2005).</li><li>Paolin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+membranes+in+ophthalmology:+long+term+data+on+transplantation+outcomes.">Amniotic membranes in ophthalmology: long term data on transplantation outcomes.</a> Cell and Tissue Banking. 17 (1), 51-58 (2016).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+for+subretinal+implantation+of+ultrathin+substrates+containing+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+monolayer.">A novel approach for subretinal implantation of ultrathin substrates containing stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer.</a> Ophthalmic Research. 48 (4), 186-191 (2012).</li><li>Pennington, B. O., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cell-based+therapies+in+combination+with+substrate+for+the+treatment+of+age-related+macular+degeneration.">Pluripotent stem cell-based therapies in combination with substrate for the treatment of age-related macular degeneration.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics: The Official Journal of the Association. 32 (5), 261-271 (2016).</li><li>Song, M. J., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+into+the+future:+Using+induced+pluripotent+stem+cells+to+build+two+and+three+dimensional+ocular+tissue+for+cell+therapy+and+disease+modeling.">Looking into the future: Using induced pluripotent stem cells to build two and three dimensional ocular tissue for cell therapy and disease modeling.</a> Brain Research. 1638 (Pt A), 2-14 (2016).</li><li>Ramsden, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+retinal+regeneration:+Past,+present+and+future).">Stem cells in retinal regeneration: Past, present and future).</a> Development. 140 (12), 2576-2585 (2013).</li><li>da Cruz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration.">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).</li><li>Kashani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioengineered+retinal+pigment+epithelial+monolayer+for+advanced,+dry+age-related+macular+degeneration.">A bioengineered retinal pigment epithelial monolayer for advanced, dry age-related macular degeneration.</a> Science Translational Medicine. 10 (435), (2018).</li><li>Binder, S., Stanzel, B. V., Krebs, I., Glittenberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+the+RPE+in+AMD.">Transplantation of the RPE in AMD.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 26 (5), 516-554 (2007).</li><li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARPE-19,+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties.">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).</li><li>Salero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+RPE+can+be+activated+into+a+multipotent+stem+cell+that+produces+mesenchymal+derivatives.">Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).</li></ol>

올리비에 Goureau 중인 인간 만능 줄기 세포에서 망막 세포의 생성에 관련 된 특허에 발명자 이다. 다른 저자는 공개 없다.

우리는 생물 학적 비 계 및 동물 모델에 이식에 대 한 준비에 RPE 세포의 문화에 대 한 메서드를 설명합니다. 프로토콜의 중요 한 단계 중 하나는 젤라틴으로 포함 될 때까지 절차를 따라 햄의 방향의 정비 이다. 실제로, 막의 네이티브 상피 제거 되 고 그것의 지하실 막 노출된9된다. RPE 세포 지하실 막이 위에 씨앗을 품고 있다. 젤라틴을 포함 하기 위한 준비, 시 정의 된 온도에서 모든 제품을 사용 하는 중요 한 됩니다. 실제로, 젤라틴은 4 ° C와 바디 온도 (37 ° C)9에서 액체에서 단단한 수 속성이 있습니다. 온도 존경 하지, 젤라틴 응고 수 있다 또는이 효과 적절 하지 단계에서 액 화.
몇 가지 생물 학적 건설 기계 제안 되었습니다, 멧의 막25 또는 햄26처럼. 특히, 햄, 제왕 절 개27, 했다 시연 subretinal 공간에 잘 용납 될 제한 된 염증을 일으키는 원인이 되 고 안 neovascularization26감소. 멤브레인은 성공적으로 인간의 RPE 세포9,28의 문화를 지원합니다. 또한,이 막에 있는 또한 오랜 역사 클리닉29, 그들 RPE 세포 치료에 대 한 비 계에 대 한 좋은 후보 만들기. 다른 생물 지원이 프로토콜 쉽게 구현 될 수 있습니다. 폴리머 기반 가상 건설 기계는 이미 엄밀한 고 이식13,30,31,,3233이전 포함 하는 젤라틴을 필요 하지 않을 수도. 이식에 대 한 다른 시스템 개발 되었으며, 최근에 hESC 파생 RPE 단층 합성 파 릴 렌 기질 Bruch의 막35 모방 하도록 설계 또는 단단한 폴 리 에스테 비 계34 에 인간의 눈에 subretinal 납품 . 이러한 전략은 비록 유망한, 우리는 생물 학적 건설 기계 RPE 조직 공학 위한 최상의 플랫폼을 제공할 수 있습니다 믿습니다.
이 프로토콜에서 시드 RPE 세포 자발적인 차별화 방법을 사용 하 여 인간의 ES 세포에서 파생 되었다. 그러나, RPE 세포의 다른 종류를 사용할 수, 하나는 RPE 세포 선19,,3637, 또는 시신에서 얻은 기본 RPE 세포 또는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 38. 또한, 만능 줄기 세포를 사용 하 여 여러 프로토콜 RPE 세포 자발적 분화에 따라 또는 작은 분자를 사용 하 여 차별화18,22가이드를 지난 몇 년 동안 개발 되었다. 이러한 다른 차별화 프로토콜에서 얻은 RPE 세포 조직 공학이 방법으로도 사용 될 수 있습니다.
이 방법의 한도 4 ° c.에서 포함 된 조직의 안정성 수술 사이트에 선적의 앞에 단지 젤라틴에 포함 하는 그것은 engraftment까지이 온도에서 유지 되어야 합니다. 그런 맥락에서 수술 48 시간 내에서 수행 되어야 합니다.
이 메서드는 병원에 쉽게 옮겨질 수 있었다. 젤라틴에 포함 된 RPE 조직 CO2에서 4 ° C에서 보존-독립 매체. 이 매체 필요한 경우, 사후 부검 및 인간으로 이식에 사용 되는 각 막의 보존에 대 한 미국 식품의 약 청 (FDA)에 의해 이미 승인 된 다른 사람으로 대체 수 있습니다. 우리는 성공적으로 이식 설치류 모델9, 개념 증명 연구에 대 한이 전략의 효율성을 증명 하 고 우리가 현재 임상 시험에 대 한 그것을 구현 하기 전에 비 인간 영장류에서 수술 접근 유효성 검사는 RP는 RPE에 영향을 미치는 특정 형태의 환자를 치료 하.

RPE 생존 및 대뇌는 그것은 밀접 하 게 관련 된1의 항상성 위해 결정적 이다.입니다. 여러 가지 병 적인 조건 변경의 기능 및 생존, RP 등 AMD.
RP는 RPE 세포 또는 두2,3, 대뇌의 기능에 영향을 주는 상속된 monogenic 돌연변이의 그룹입니다. 그것은 특히 RPE에 영향을 주는 돌연변이 세포 RP2의 5 %는 추정. AMD는 다른 조건이 RPE 레이어 변경 최고의 궁극적으로 중앙 시각 손실. AMD은 유전과 환경 요인의 복잡 한 상호 작용에 의해 발생 하 고 노인4,,56에 영향을 줍니다. 계획에 따르면 AMD 20207에 의해 전세계 196 백만 환자에 대 한 우려 됩니다. 이러한 장애에 대 한 효과적인 치료법 존재 하 고 제안 하는 전략 중 하나 죽은/작동 하지 않는 기존 RPE 세포8에 대 한 보상 하기 위해 새로운 RPE 세포의 이식입니다.
투입 될 최종 제품의 배합의 모드 기능 최고의 결과 보장 하기 위해 필수적 이다. 그들의 생존, 통합 및 기능9,10,,1112 에 관한 우려를 제기 하는 RPE 세포로는 셀 서 스 펜 션, 배달, 쉽고 간단 방법 임에도 불구 하 고 주입 , 13. 과학자는 지금 개발 하 고 더 복잡 한 공식 제공 설계 망막 조직9,13,14,,1516. 이러한 맥락에서 우리는 체 외에서 RPE 조직 이식9에 사용할 수 있는 생성 하는 원래 방법 개발.
인간 미 발달 줄기 (ES) 세포에서 파생 된 RPE 세포 은행이이 프로토콜에 사용 됩니다. 그러나, 대안 RPE 세포 은행 (인간 유도 만능 줄기 세포, 기본 RPE 세포, 등) 다른 셀 소스에서 다른 방법으로 분화 하 고이 프로토콜에 대 한 적절 한 있습니다. 그것은 포함 하는 감독된 차별화 cytokines 그리고/또한 작은 분자17,18,19,20,,2122를 사용 하 여 프로토콜.
이식 하는 비 계에 설계 조직을 준비 한다. 지난 몇 년 동안, 다른 건설 기계는 폴리머 또는 생물 기원13,,2324의 매트릭스에 기반으로 개발 되었다. 여기, 생물 학적 기판 사용 햄, 하지만 denuded Bruch 막 같은 다른 기판에 구현 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 메서드는 RPE 네이티브 환경에 더 관련 된 생물 비 계를 사용 하 여 이점이 있습니다.
인간의 ES 세포 유래 RPE 세포 완전히 조약돌 단층으로 구성 하기 위해서는 적어도 4 주 동안 교양. 그 단계에서 얻은 상피 기능적 이며9편광. 마지막으로,이 조직 쉽게 주름로 그것을 한번 더 강성과 탄성 주입 절차 동안 그것을 보호 하기 위해 하이드로 겔 캐리어의 얇은 층에 포함 됩니다. 이 제품은 다음 접목까지 4 ° C에 저장 됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterile biosafety cabinet</td>
			<td>TechGen International</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid waste disposal system for aspiration</td>
			<td>Vacuubrand</td>
			<td>BVC 21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-controlled +37&#160;&#176;C cell incubator</td>
			<td>Thermo Electron Corporation</td>
			<td>BVC 21 NT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200&#160;&#181;L pipette: P200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#160;mL pipette: P1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet aid</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>75001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>+4&#160;&#176;C refrigerator</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>501758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (x2)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>555227F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Grant subaqua pro</td>
			<td>SUB6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>CP225D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>5804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SC30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal Rocking Shaker</td>
			<td>IKA-WERKE</td>
			<td>IKA MTS 214D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LAB DANCER S40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>500351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic paraffin film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.200 &#181;m single use syringe filter</td>
			<td>SARTORIUS</td>
			<td>16532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe without needle 50 mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>50012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottles 250mL</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>28024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile Falcon tubes</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile Falcon tubes</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>culture insert</td>
			<td>Scaffdex</td>
			<td>C00001N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60&#160;mm cell culture disches: B6</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 well cell culture plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Ted Pella, Inc</td>
			<td>121-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate glue</td>
			<td>Castorama</td>
			<td>3178040670105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1X (500&#160;mL)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysine</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5339880001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>61965-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12618-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-NEAA (100X)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol (50&#160;mM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2-independent medium</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>18045-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>104078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human amniotic membrane</td>
			<td>Tissue bank St Louis hospital (Paris, France)</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering transplantation-suitable retinal pigment epithelium tissue derived from human embryonic stem cells

눈의 여러 가지 병 적인 조건에는 기능 또는 망막 안료 상피 (RPE)의 생존에 영향을. 이러한 망막 화 (RP) 및 연령 관련 황 반 변성 (AMD)의 일부 형태를 포함합니다. 세포 치료는 이미 인 간에 있는 예비 결과 격려와 함께 이러한 질병을 치료를 제안 하는 가장 유망한 치료 전략 중 하나 이다. 그러나,는 이식의 준비의 방법의 기능적 결과 비보에 상당한 영향을 있다. 실제로, 세포 현 탁 액으로 투입 하는 RPE 세포는 망막 조직으로 이식 하는 같은 셀 보다 덜 기능적 이다. 여기, 우리 엔지니어 RPE 조직과 vivo에서 이식에 대 한 준비를 간단 하 고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 RPE 세포 생물학 지원, 인간의 양수 막 (햄)에 시드 있습니다. 인공 건설 기계에 비해,이 지원 Bruch의 막 생 RPE 세포 연결 된 가까운 지하실 막의 이점이 있다. 그러나, 그것의 조작 쉽지 않다, 그리고 우리가 그것의 적절 한 경작에 대 한 몇 가지 전략 및 준비에 비보를 접목 개발.

햄은 RPE 세포의 뿌리기 전에 제거 되어야 한다 상피 층 포함. 막의 효소 치료는 떨고 아래 thermolysin와 함께 수행 됩니다. 순서 대로 하지 아니 막 (상피는 1 개의 측에)의 극성을 잃고, 그것은 어떤 구성 (그림 1A) 공급자에 따라 다를 수는 지원에 고정. 이 단계에서 그것의 지원에 막의 접착을 확인 하 고 필요한 경우 클립을 추가. 문화 삽입에 고정 시 막에 있는 구멍을 만드는 피하기 위해 신중 하 게 작업 하 고 (그림 1B)을 향하도록 하는 지하실 멤브레인와 함께 그것의 극성을 유지 합니다. 세포는 세포 막에 씨를 뿌리고, 그들은 이러한 구멍에서 탈출 수 그리고 마지막 셀 농도 감소 될 것 이다. 구멍의 존재는 현미경 또는 문화 삽입 내부 PBS를 추가 PBS 누수 되는 경우를 확인 하 여 구상 될 수 있습니다. 어떤 막 구멍을 폐기 해야한다.
문화 삽입에 정착, 다음 단계 대조 현미경에 잔여 셀의 존재 계산 (그림 1C 및 1d) 이다. 고아 하 게, 몇 가지 죽은 세포는 막의 표면에 남아 있을 수 있습니다 하지만 그 세포 배양 매체 변경 되 면 삭제 될 것 이다 (그림 1C). 지하실 막의 섬유 셀 유지 하는 경우 더 높은 확대율 (그림 1D)에서 볼 수 있었다. 하지 하는 경우 thermolysin 가진 외피의 타이밍을 조정할 수 있습니다.
RPE 세포의 시드 다음 일에서 경우 셀 준수 확인 합니다. 사용 하는 현미경에 따라 명확 하 게 처음 몇 주 동안 셀을 참조 하는 것이 어려울 수 있습니다 하지만 셀을 준수 하지 않는 경우 셀 것입니다 볼 수 세포 배양 매체에서 떠. 일단 상피 형성 되 고 성숙 하기 시작, 그것을 보고 (그림 2A, 2B, 2 C) 현미경 쉽게 된다. 3 주에 셀 RPE (조약돌 조직)의 전형적인 완전 한 단층 상피를 형성합니다. 4 주 후, 상피는 이식 (그림 2D)에 대 한 준비를 위해 충분히 성숙. 그러나, 그것은 병 참 술 이유를 위해 더 많은 주에 대 한 문화에 보관 될 수 있습니다.
이식에서 이식의 준비는 그림 3에 설명 되어 있습니다. 20% 젤라틴 블록에 막의 apposition, 따라 모든 초과 세포 배양 매체 발음. 이 단계는 중요 한, 모든 나머지 매체는 RPE을 막 8% 젤라틴의 접착을 배제 수로. 실제로, 매체는 젤라틴의 층 사이 액체의 필름을 형성할 것 이다.
이식의 포함을 위해 사용 하는 젤라틴의 꽃 색인에 따라 다양 한 힘의 수 (즉, 품질 관리 테스트를 수행 하 고는 표준된 온도에서 젤의 강도 평가 공급 업체에서 제공 하 고 농도)입니다. 경우 사용 하는 젤라틴 충분히 엄밀한는 접목 하는 동안 disaggregates, 젤라틴 사용된 기준 더 높은 강도 가진 또 다른 것 바뀌어야 한다. 젤라틴의 농도 변경 수 있습니다 또한 수, 실험, 그것의 힘 및 탄력 조정에 따라.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58216/58216fig1.jpg"> 그림 1: thermolysin 치료 및 문화에 정착 하기 전에 전후 햄의 대표 이미지 삽입. (A) 조직 은행에서 제공 하는 막의 대표 이미지. (B)에 문화 삽입 고정 막의 대표 이미지. (C) 낮은 확대율에서 thermolysin로 치료 하는 막의 대표 이미지. (D) 높은 확대에 thermolysin로 치료 하는 막의 대표 이미지. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58216/58216fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58216/58216fig2.jpg"> 그림 2: RPE 세포 시드 시 햄의 대표 이미지. (A) 뿌리기 전에 막의 대표 이미지. (B 와 C) 후 시드 3 주 막에 RPE 세포의 대표 이미지. 막 완전 하 게 평면 패널 C에서 볼 수 있습니다. 눈금 막대는 배율에 대 한 20 µ m, 100 µ m (C) =. (D) 30 일 후 시드, 해당 시간의 젤라틴에 그들을 포함 하는 막에 RPE 세포의 대표 이미지. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58216/58216fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58216/58216fig3.jpg"> 그림 3: 젤라틴 영화 안에 햄에 RPE 세포 층을 포함 하는 설계 망막 조직 포함에 대 한 일련의 단계를 설명 하는 스키마. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58216/58216fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

망막 조직을 인간의 양수 막과 동물 모델에 이식의 준비 위에 경작 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 망막 색소 상피 세포의 구성 하는 방법을 설명 합니다.

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

engineering-transplantation-suitable-retinal-pigment-epithelium

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.6K 조회수.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM). 망막 조직을 인간의 양수 막과 동물 모델에 이식의 준비 위에 경작 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 파생 된 망막 색소 상피 세포의 구성 하는 방법을 설명 합니다.

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Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

연구

발생학

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

The objective of this report is to describe the protocols to derive the retinal pigment epithelium (RPE) from induced pluripotent stem (iPS) cells using different sizes of embryoid bodies.

배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 도출 (IPS) 세포

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell replacement therapies. Terminally differentiated cell types could be used for the treatment of various degenerative diseases. In vitro differentiation of these cells towards tissues of the lung, liver and pancreas requires as a first step the generation of definitive endodermal cells. This step is rate-limiting for further differentiation towards terminally matured cell types such as insulin-producing beta cells, hepatocytes or other endoderm-derived cell types. Cells that are committed towards the endoderm lineage highly express a multitude of transcription factors such as FOXA2, SOX17, HNF1B, members of the GATA family, and the surface receptor CXCR4. However, differentiation protocols are rarely 100% efficient. Here, we describe a method for the purification of a CXCR4+ cell population after differentiation into the DE by using magnetic microbeads. This purification additionally removes cells of unwanted lineages. The gentle purification method is quick and reliable and might be used to improve downstream applications and differentiations.

Here, we describe a method for the purification of differentiated human embryonic stem cells that are committed towards the definitive endoderm for the improvement of downstream applications and further differentiations.

인간 배아 줄기 세포로부터 생성 된 내배엽 세포의 정제를위한 신속하고 효율적인 방법

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for differentiating hiPSCs into cardiomyocytes (hiPSC-CMs), endothelial cells (hiPSC-ECs), and smooth muscle cells (SMCs) are often limited by low yield, purity, and/or poor phenotypic stability. Here, we present novel protocols for generating hiPSC-CMs, -ECs, and -SMCs that are substantially more efficient than conventional methods, as well as a method for combining cell injection with a cytokine-containing patch created over the site of administration. The patch improves both the retention of the injected cells, by sealing the needle track to prevent the cells from being squeezed out of the myocardium, and cell survival, by releasing insulin-like growth factor (IGF) over an extended period. In a swine model of myocardial ischemia-reperfusion injury, the rate of engraftment was more than two-fold greater when the cells were administered with the cytokine-containing patch comparing to the cells without patch, and treatment with both the cells and the patch, but not with the cells alone, was associated with significant improvements in cardiac function and infarct size.

We present three novel and more efficient protocols for differentiating human induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes, endothelial cells, and smooth muscle cells and a delivery method that improves the engraftment of transplanted cells by combining cell injection with patch-mediated cytokine delivery.

다 능성 줄기 세포는 심근 수리를위한 심장 세포를 유도

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...