Name: an in vitro approach to photodynamic therapy
Uploaded: 2018-08-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 53 s
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저자 아무 승인 있다.

1입니다. 셀의 준비
<ol><li>문화 매체의 2 mL에 20000 셀 biosafety 캐비닛에 무 균 기술을 사용 하 여 6 잘 플레이트의 각 음에 플레이트.</li>
	<li>6 잘 플레이트 플레이트에 셀 수 있도록 24 h 습도 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 배치 합니다.</li>
</ol>2. 셀의 처리를 위한 Photosensitizer의 준비
<ol><li>문화 매체에 0.5, 1 및 2 m m 5-ALA 솔루션을 준비 합니다. 소 태아 혈 청 (FBS) 문화 매체의 성분 인 경우에, 준비 하 고 5-ALA 0.1% 문화 매체 솔루션에 포함 된 셀을 치료 FBS 외피에 대 한. 11 , 12 이 경우 SCC-13 셀 필요가 없습니다 FBS, 5 날개 keratinocyte 혈 청 무료 중간 소 뇌 하 수 체 추출 및 표 피 성장 인자 보충에 직접 추가 되었습니다 그래서.</li>
	<li>문화 매체를 발음 하 고 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 최소 2 mL로 세포를 씻어.</li>
	<li>PBS를 발음 하 고 별도 접시 또는 우물으로 0, 0.5, 1 또는 2 m m 5-ALA 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>0, 0.5, 1, 셀을 품 어 또는 30 분에 대 한 블록을 난방 36 37 ° C에 2 m m 5-살라는 알루미늄 호 일을 사용 하 여 외피 동안 가벼운 노출에서 세포를 보호 합니다.</li>
	<li>0, 0.5, 1 및 2 m m 5-ALA 솔루션을 발음 하 고 PBS의 2 mL로 세포 세척.</li>
	<li>PBS를 발음 하 고 블루 빛 조사에 대 한 문화 매체의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
</ol>3. 푸른 빛 광선 요법
<ol><li>셀, 해 전에 블루 빛 장치 (예를 들어, 발광 다이오드, 형광, 또는 할로겐 빛) 설정 하 고 1 사이클에 대 한 실행 (1000 s) 장치를 따뜻하게. 파란 가벼운 장치는 출력 파장 5 + 417의 있어야 한다 nm. 치료 전에 1 사이클에 대 한 실행 장치를 수 있도록 푸른 빛 파장 및 방사는 photoactivation 단계에 걸쳐 일관성이 보장 합니다.</li>
	<li>세포 표면에 방사를 측정 하는 광도 계를 사용 합니다. 세포 표면에 푸른 빛 방사는 10 mW/cm2이어야 한다. 빛과는 셀 사이의 거리는 광원의 강도 따라2 10 mW/cm irradiance를 달성 하기 위하여 조정 될 필요가 있습니다.</li>
	<li>0, 0.5, 1 및 2 m m ALA 치료 그룹 블루 광원 아래 검은 표면에 놓습니다. 셀 1000에 대 한 파란색 빛을 비추는 s (16 분 및 40 s) 10 J/c m2의 총 fluence에 대 한. 블루 빛 photoactivation, 다음 셀 분석에 대 한 준비가.입니다.</li>
</ol>4. 수집 및 얼룩
<ol><li>( 재료의 표참조)는 제조업체 지침에 따라 흐름 버퍼를 준비 합니다.</li>
	<li>문화 매체 및 2 mL의 PBS로 세척 셀 발음.</li>
	<li>0.25 %trypsin-EDTA의 1 mL을 추가 하 고 약 3 ~ 5 분 동안 분리 하는 세포를 허용. 셀 셀 분리 확인 현미경 검사할 수 있습니다.</li>
	<li>비활성화 된 트립 신을 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 문화 매체 (PBS)의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>분류 5 mL 흐름 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다.</li>
	<li>셀 펠 릿을 제거 하지 않고 5 분 Aspirate 솔루션에 대 한 201 x g 에서 원심 분리기에 5 mL 흐름 튜브를 회전 합니다.</li>
	<li>각 샘플을 활용된 annexin V 항 체 (흐름 버퍼의 39 µ L 당 annexin v의 1 µ L)으로 흐름 버퍼의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>Resuspend 셀과 annexin V 바인딩 수 있도록 20 분 (37 ° C, 5% CO2) 인큐베이터에 놓습니다.</li>
	<li>각 샘플에 7-AAD의 3 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
</ol>5. 흐름 Cytometric 분석
<ol><li>설정에 대 한 흐름 cytometer 제조업체 지침에 따라 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>수집 및 분석 cytometry 샘플. 13
</li>
	<li>치료 및 분산 분석 (ANOVA)14를 사용 하 여 컨트롤 그룹의 통계 비교를 수행 합니다. 컨트롤의 평균을 치료 그룹의 의미를 비교 하 여 특별 게시물 분석 Dunnett의 테스트와 함께.</li>
</ol>

<ol>
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DUSA/일 제약 제공 5-살라 고 블루 U 빛 장치. 이 원고는 박사 Jagdeo의 잔류에 의해 지원 되었다 자금. 내용을 미국 재향 군인 담당 부서 또는 미국 정부의 의견을 대표 하지 않는다.

0.5, 1 및 2 m m 5-날개 뒤에 1, 000의 30 분 외피 다음 SCC-13 apoptosis에 상당한 증가 푸른 빛의 s. 이러한 결과 30 분 뒤에 블루 빛 활성화의 5-ALA 외피 fibroblast 세포 apoptosis12, 진행의 백분율에 복용량 의존 증가 리드 보여주는 우리의 이전 출판된 연구와 일치 14.
공부 초가 실험적인 접근 장점과 한계 있다. 설명된 방법 준수 상용 PS로 임상 연습 그리고 광원 사용 되었다. 연구원은 다른 세포 유형, PSs, 광원 및 조사 매개 변수 메서드를 사용자 지정할 수 있습니다. 그러나,이 프로토콜은 부착 세포 경작 한 단층에 대 한 설계 되었습니다 등이 접근에 한계가 있다. 임상 연습에서 조직 아키텍처 또는 질병 병리학 (hyperkeratosis즉, 또는 섬유 증) 차이 PS 흡수 저하 될 수 있습니다 또는 침투15빛. 그 결과, 치료 복용량 및 실험 결과 수 있습니다 일치 하지 않을 직접 임상 연습. 회전 타원 체 종양 모델 및 미세 칩 더 밀접 하 게 종양 microenvironments16,,1718를 복제 하는 방법으로 연구 되었습니다. Spheroids는 내부와 외부 세포 틈새 차동는 photosensitizers를 통합 하 고 다른 유형의 종양 아키텍처를 나타내는 수 있습니다. 다른 연구원은 화면 처리 조건 및 photosensitizers의 혈관 전달 미세 칩을 사용 했습니다. 그러나, 미세 칩 개발 비용이 많이 드는 또는 연구원 기술에 익숙하지에 대 한 구현 하기 어려운 수 있습니다. 또한, spheroids 및 미세 칩에 있는 photosensitizers 직접 혈관 보급 없이 종양 표면에 적용 되는 피부 암의 임상 치료를 반영 하지 않을 수 있습니다. 연구원은 다른 질병 시스템에서 공부 PDT에 대 한 단층 문화, 회전 타원 체 종양 모델 및 미세 칩의 찬 부 양론을 평가 해야 합니다. 면역 세포 또는 세포 외 기질으로 초 복잡 한 세포-세포 상호 작용에 미치는 영향을 확인할 수 아니다. 연구팀은 생체 외에서 실험 결과 동물 모델과 임상 시험을 사용 하 여 확인 해야 합니다. 높은 간 테스트 유효성을 달성 하기 위해 생체 외에서 초 실험을 수행할 때 일관 된 외피와 가벼운 매개 변수를 유지 하기 위해 중요 하다.
온도 변경 PDT19의 효능으로 알려져 있다. 한 연구는 세포 죽음, 5 날개 통풍 관, PP IX 형성과 cytokine 출시 44 ° C19에 최대 5-날개 온도에서 세포를 배양 하 여 향상 될 수 있습니다 설명 했다. 44 ° C의 위 외피 온도 열 유도 된 세포 죽음으로 이어질 수 있습니다 그리고 외피 온도 20 ° c을 중요 한 5-ALA 이해 및 축적19이어질 수 있습니다. 연구원은 잠재적으로 혼동 열 효과 대 한 제어를 일정 한 온도에서 온도 조절 난방 블록에 PS 외피를 수행 하는 것이 좋습니다. 또한, 충분 한 양의 시간 PP IX 5-ALA의 변환에 대 한는 photosensitizer 품 어 중요 하다. 이 프로토콜에 SCC-13 셀 성공적으로 세포 apoptosis 유도 30 분 동안 5-ALA와 인 큐베이 팅 했다. 우리 이전 5-ALA의 10 분 인큐베이션 크게 치료 제어 fibroblasts11,14에 비해 섬유 아 세포에 있는 apoptosis 증가 하지 않았다 설명 했다. PP-IX 5-ALA 37 ° c.에 6 분 동안 잠복기 후 마우스 피부에 축적 시작 따라서, 10 분 후 5-ALA 인큐베이션, 있을 수 있습니다 하지 유도 세포 apoptosis20PP-9의 충분 한 축적. 우리의 이전 연구11,14에 따라 5-날개에 대 한 20 ~ 30 분의 최소 잠복기를 좋습니다. 연구팀은 부 화 기간 설정, 관심, 셀 유형, 및 임상 표시의 photosensitizer 실험실에 따라 최적화 할 수 있습니다. 제조업체 지침을 사용 하 여 최상의 결과 대 한 항 체 적정 및 최적화 실험을 수행할 수 있습니다. 블루 라이트 photoactivation dihydroethidium 흐름 cytometric 정량화 선생님의를 포함 하 여 다음 관심의 다른 분석을 수행할 수 있습니다. 14
빛의 양을 변화 표면 영역 (즉, irradiance)의 단위 당 전달 하 고 photoactivation 단계 총 방사선 복용량 (즉, fluence) 선생님 형성 및 세포 apoptosis21에 영향을 미칠 수 있습니다. Fluence, irradiance, 시간과 관계는 다음 방정식에 의해 기술 될 수 있다:
Fluence (J/c m2) Irradiance (W/c m2) = x 시간 (s)
Fluence는 시간에 따라, 길이 또는 photoactivation 단계를 단축 치료 효능을 변경할 수 있습니다. 방사 광원 및 대상 조직 사이 제곱 거리에 비례 이다. 결과적으로, 빛이 너무 멀리 떨어져, 있을 수 있습니다 하지 자극 대상된 조직에 전달 하는 충분 한 빛 에너지는 ps. 또는,는 irradiance 주변 표면에서 반영 빛에 의해 증가 수 있습니다. 따라서, 빛의 반사를 방지 하기 위해 검은 표면에 세포 배양 배지와 빛 위하여 수행 하는 것이 좋습니다. 연구원은 상업적으로 사용할 수 또는 FDA 승인 파란색 발광 다이오드 및 PDT 실험에 사용 하 여 형광 장치를 획득할 수 있습니다 있지만 이러한 장치 가벼운 분야 균일 하 고 다른 전원 출력을 할 수 있습니다. 파장 별 photometer 세포 표면 및 일관성 있는 결과 대 한 모든 실험 하기 전에 빛의 균일성에 방사를 측정 하기 위해 사용 되어야 한다. 필요한 경우 필드 균일성 향상을 상업적으로 사용할 수 있는 디퓨저를 사용할 수 있습니다.
요약 하자면, 우리 생체 외에서 접근 이론, 실험 방법, 제한, 잠재적인 함정 및 최적화에 대 한 권장 사항을 자세히 설명 하 여 PDT를 조사 하는 것을 설명 했습니다. PDT는 소설 PSs, 프로토콜, 및 초에 대 한 새로운 표시의 최적화의 개발에 대 한 유용한 임상 절차 및 생체 외에서 연구 수 있습니다.

Photodynamic 치료 (태평양 서머 타임) 뒤에 보이는 빛 photoactivation 세포 apoptosis를 유도 하는 것 적용된 photosensitizer (PS)의 외피를 포함 한 의료 절차입니다. 연방 의약품 안전 청 (FDA) actinic keratosis (AK)의 치료에 대 한 PDT를 승인 했습니다 그리고 임상 지침 특정 비 흑색 종 피부 암과 여드름 vulgaris1,2에 대 한 처리로 PDT를 추천. 태평양 표준시에 대 한 신흥 비 피부과 사용 위장, 전립선, 부인과 암3의 치료를 포함합니다. 그것은 저렴 한 비용, 비-침략 적, 그리고 최소한의 부작용 및 흉터2관련 된 PDT는 유리한 치료 양식 적임 이다.
PDT의 첫 번째 단계는 PS 적용 이며 침2축적을 허용. 미국에서는, 국 소 5-aminolevulinic 산 (5-ALA)는 일반적으로 AKs 치료에 사용 됩니다. 부 화 하는 동안 단계, 5-ALA protoporphyrin IX (PP-IX) 통합된 셀3헤 생 합성 통로 통해 변환 됩니다. 암 및 전 암 세포 감소 protoporphyrin IX (PP-IX), 최종 제품으로 변환, ferrochelatase 활동, 헤. 그 결과, 암 세포 정상 세포4,5에 비해 PP IX 누적 됩니다. 암 및 전 암 세포 주변 조직 기준으로 PP-IX의이 축적이 초 최소한의 부작용으로 타겟된 접근을 할 수 있습니다. 가벼운 방사선 반응성 산소 종 (ROS) 생성 산소 PP IX에서 흥분된 전자를 수용 하는 때 이끌어 낸다. PP-IX는 파란색과 빨간색 빛2를 포함 하 여 가시 광선 스펙트럼에 걸쳐 작은 봉우리 자외선 스펙트럼에서 피크 흡수. 선생님 형성 세포 apoptosis, 막 장애, 미토 콘 드 리아 손상, 면역 변조, keratinocyte 확산, 및 교원 질 회전율6,7,,89 에 궁극적으로 이어질 수 있습니다. , 10.
PDT와 진화 치료 양식 적임3는 1970 년대에 개발 되었다. AKs의 처리를 위한 FDA 승인 프로토콜 14-18 시간, 5-ALA 피부 외피를 권장 하지만 1 ~ 2 h 외피 임상 연습2에 일반적으로 사용 됩니다. 생체 외에서 우리는 짧은 15 분 5-ALA 외피 섬유 세포 apoptosis 치료 fibroblasts11,12에 비해 증가 시킬 수 있습니다 나타났습니다. 또한, 소설 chlorin, phthalocyanine, 및 나노 기반 PSs 초 효능3을 개선 하기 위해 공부 되 고 있다. 여기, 우리는 체 외에서 하는 방법 연구 PDT 부착 편평 세포 암 종에서 셀을 제시. 이 프로토콜에서 SCC-13 셀 0, 0.5, 1.0, 및 2 m m 5-ALA 30 분 및 photoactivated 1000 417 nm 블루 빛으로 incubated는 s. 기본 결과 측정은 apoptosis와 괴 사, annexin V 및 7-aminoactinomycin D (7-AAD) cytometry 기준으로 측정. 이 치료 프로토콜 PDT를 시뮬레이션 하도록 설계 되었습니다 그리고 다른 셀 라인, photosensitizers, 부 화 온도, 또는 photoactivation 파장 PDT 사용 하 여 공부 하 고 조정할 수 있습니다. 추가 제어 그룹의 준비 할 수 있습니다, 흠 없는, 단일 fluorophore를 포함 하 여 스테인드, cytometry에 대 한 부정, 및 긍정적인 컨트롤. 이론, 프로토콜, 실험적인 디자인, 그리고 apoptosis 또는 괴 사 cytometry 위한 게이팅의 종합적인 검토 다른13을찾을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Keratinocyte serum free medium&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>17005042</td><td>Culture medium for SSC-13 cells</td></tr><tr><td>DMEM low glucose glutamax</td><td>Thermofisher</td><td>10567022</td><td>Possible culture medium for other cell types</td></tr><tr><td>6-well culture plates</td><td>Thermofisher</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermofisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Thermofisher</td><td>15250061</td><td>For cell counting and plating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BLU-U light&amp;nbsp;</td><td>DUSA</td><td>Request from manufacturer</td><td>Other blue LED, flourescent, or halogen lights may used&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5-ALA</td><td>DUSA</td><td>Request from manufacturer</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>C17032</td><td></td></tr><tr><td>FlowCellect Annexin Red Kit</td><td>Millipore Sigma&amp;nbsp;</td><td>FCCH100108&amp;nbsp;</td><td>Propidium iodide may replace 7-AAD. Comes with annexin-V, 7-AAD, and flow buffer</td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD</td><td>Request from manufacturer</td><td>Any flow cytometer may be used&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Counting Chamber</td><td>Hausser</td><td>3120</td><td>For cell counting and plating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>Request from manufacturer</td><td>Flow cytometry analysis software</td></tr></tbody></table>

an in vitro approach to photodynamic therapy

Photodynamic 치료 (태평양 서머 타임) 뒤에 보이는 빛 photoactivation 세포 apoptosis를 유도 하는 것 적용된 photosensitizer (PS)의 외피를 포함 한 의료 절차입니다. 연방 의약품 안전 청 actinic keratosis, 치료에 대 한 PDT를 승인 했습니다 그리고 임상 지침 특정 비 흑색 종 피부 암과 여드름 vulgaris에 대 한 처리로 PDT를 추천. 그것은 저렴 한 비용, 비-침략 적, 및 관련 된 최소한의 부작용 그리고 무섭게 PDT는 유리한 치료 양식 적임 이다. PDT의 첫 번째 단계는 PS 적용 이며 침 축적을 허용. 후속 빛 방사선 세포 apoptosis, 막 장애, 미토 콘 드 리아 손상, 면역 변조, keratinocyte 확산, 및 교원 질 회전율에 궁극적으로 이어질 수 있습니다 반응성 산소 종 형성을 유도 합니다. 여기, 우리는 체 외에서 하는 방법 연구 PDT 부착 셀 라인에서 제시. 이 치료 프로토콜 PDT를 시뮬레이션 하도록 설계 되었습니다 그리고 다양 한 셀 라인, photosensitizers, 부 화 온도, 또는 photoactivation 파장 PDT 사용 하 여 공부 하 고 조정할 수 있습니다. 편평 세포 암 종 세포 30 분 및 417 nm 블루 빛 1000 photoactivated 0, 0.5, 1.0, 및 2 m m 5-aminolevulinic 산 (5-ALA) incubated 했다 s. 기본 결과 측정 apoptosis와 괴 사, annexin V 및 7-aminoactinomycin D cytometry 기준으로 측정 했다. 다음 5-살라의 30 분 외피 세포 apoptosis에 복용량 의존 증가 높은 간 테스트 유효성을 달성 하기 위해 생체 외에서 초 실험을 수행할 때 일관 된 외피와 가벼운 매개 변수를 유지 하기 위해 중요 하다. PDT는 소설 PSs, 프로토콜, 및 초에 대 한 새로운 표시의 최적화의 개발에 대 한 유용한 임상 절차 및 생체 외에서 연구 수 있습니다.

SCC-13 후 셀 0, 0.5, 1 및 2 m m 5-ALA와 함께 30 분 동안 incubated 되었고 1000 반구 블루 빛, 세포 apoptosis에 복용량 의존 증가의 s. 총 apoptosis (의미의 평균 ± 표준 오차)는 3.94 ± 0.34, 7.90 ± 0.52, 23.86 ± 0.52, 0, 0.5, 1 및 2 m m 5-날개를 가진 외피의 30 분 후 38.33 ± 1.81 각각, 그리고 파란색의 1000 초 빛 (그림 1). 우리는 0, 0.5, 1 및 2 m m 5-ALA incubated 그룹 ANOVA를 사용 하 여 가운데 apoptotic 세포의 평균 비율을 비교. 1 및 2 m m 5-ALA 치료 셀 0 m m 5-ALA 치료 세포에 비해 세포 apoptosis에 크게 증가 했다. 그림 2A 보여주는 대표적인 흐름 측면 살포 (SSC) SCC-13 셀 0, 0.5, 1 및 2 m m 5-살라와 함께 알을 품을 대 앞으로 분산형 (FSC)의 cytometric 게이팅 동그라미 게이팅 SCC-13 세포 인구를 포함합니다. 이 실험을 위해 7500 이벤트 수집 하 고 SCC-13 셀 인구 게이트 캡처한 이벤트의 90% 이상. 그림 2B 는 x 축과 y 축에 annexin V에 7-AAD의 대표 작을 보여줍니다. 세포 인구는 4 개의 사분면으로 문이 (4 분기에 1 분기) 차별을 apoptotic 세포. 1 분기 (높은 annexin v, 낮은 7-AAD) 나타내는 셀 초기 apoptosis를 겪고. Q2 (높은 annexin v, 높은 7-AAD) 대표 셀 늦은 apoptosis 또는 괴 사 진행. 3 분기 (낮은 annexin v, 높은 7-AAD) 나타내는 세포 괴 사를 겪고. 4 분기 (낮은 annexin v, 낮은 7-AAD) 대표 하지 겪고 apoptosis 또는 괴 사 세포. Apoptosis를 받고 세포의 백분율을 계산 하려면 우리는 q 1과 q 2에 셀의 비율 추가 되었습니다. 5-ALA 인큐베이션 기간 길이, 부 화 온도, 또는 photoactivation 방사선 복용량에 불일치는 초 효능을 변경할 수 있습니다. 그림 3 부 화 온도 변화 하는 때 대표 annexin V 및 7-AAD 흐름 cytometric 음모를 보여줍니다 (즉, 27, 36, 또는 42 ° C). Apoptosis에 온도 의존 증가 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig1.jpg"> 그림 1: 5-살라의 30 분 부 화 후 apoptosis에 복용량 의존 증가 5-ALA 36 ° C에서 1000 다음 30 분 동안 incubated SCC-13 셀에 푸른 빛의 s. 각 치료 및 제어 그룹에서 평균 백분율 annexin V 긍정적인 세포를 나타내는 막대입니다. 실험 기술 3 중에서 수행 했다. 통계적 의미는 p 와 ANOVA에 의해 결정 되었다 < 0.05 별표 (*)로 표시 됩니다. 오차 막대는 평균 ± 표준 오차의 의미를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58190/58190fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig2.jpg"> 그림 2: 대표 Cytometry 플롯. (A) 대표 앞으로 분산형 대 측 분산형 cytometry 구획 임의의 단위 (AU)에 대 한 x-축 및 y 축 0, 0.5, 1 및 2 m m 5-ALA incubated 셀. 이 실험을 위해 7500 이벤트 수집 하 고 SCC-13 셀 인구 게이트 캡처한 이벤트의 90%. (B) 대표 annexin V 대 7 AAD cytometry 플롯 AU에 대 한 x-축 및 y 축 0, 0.5, 1 및 2 m m 5-ALA incubated 셀에 대 한 합니다. 질문 1: 초기 apoptotic 세포, Q2: 늦은 apoptotic/회 저 성 세포, 3 분기: 회 저 성 세포, 및 4 분기: 가능한 셀. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58190/58190fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58190/58190fig3.jpg"> 그림 3: 5-ALA 다른 온도에서 배양 초 효능을 변경할 수 있습니다. 7-AAD cytometry 대표 annexin V 대 플롯 AU에 대 한 x-축 및 y-축 0.5 m m 5-27, 36, 42 ° c.에서 ALA와 incubated SCC-13 셀에 대 한 질문 1: 초기 apoptotic 세포, Q2: 늦은 apoptotic/회 저 성 세포, 3 분기: 회 저 성 세포, 및 4 분기: 가능한 셀. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58190/58190fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

Photodynamic 치료 (PDT)는 것 적용된 photosensitizer (PS) 뒤에 보이는 빛 photoactivation apoptosis 유도 보육 관련 의료 절차입니다. 우리는 생체 외에서 PDT 프로토콜 PS 인큐베이션 및 가벼운 치료 매개 변수는 차이 연구 하는 데 사용할 수 있습니다 태평양 표준시를 시뮬레이션 하도록 설계 되었습니다 제시.

Photodynamic 치료 체 외에서 접근

Photodynamic therapy (PDT) is a medical procedure that involves incubation of an exogenously applied photosensitizer (PS) followed by visible light ...

an-in-vitro-approach-to-photodynamic-therapy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

8.6K 조회수.  University of California, Davis. Photodynamic 치료 (PDT)는 것 적용된 photosensitizer (PS) 뒤에 보이는 빛 photoactivation apoptosis 유도 보육 관련 의료 절차입니다. 우리는 생체 외에서 PDT 프로토콜 PS 인큐베이션 및 가벼운 치료 매개 변수는 차이 연구 하는 데 사용할 수 있습니다 태평양 표준시를 시뮬레이션 하도록 설계 되었습니다 제시.

비디오: An In Vitro Approach to Photodynamic Therapy

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

체외에서</em전이성 종양 성장에 휴면하고 스위치를 연구하기> 시스템

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

연구

의학

Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT) is reported. The nanoparticles are formed by hydrophobic interaction of the semiconducting polymer MEH-PPV (poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene]) with the fullerene PCBM (phenyl-C61-butyric acid methyl ester) in the presence of a non-compatible solvent. MEH-PPV has a high extinction coefficient that leads to high rates of triplet formation, and efficient charge and energy transfer to the fullerene PCBM. The latter processes enhance the efficiency of the PDT system through fullerene assisted triplet and radical formation, and ultrafast deactivation of MEH-PPV excited stated. The results reported here show that this nanoparticle PDT sensitizing system is highly effective and shows unexpected specificity to cancer cell lines.

This protocol describes a method for the fabrication of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene. These nanoparticles were investigated for their potential use as a next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT).

혼합 폴리머 / 풀러렌 나노 입자 감광제를 실시와 광 역학 치료

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next ...

화학

5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Primary Bone Tumor and Bone Metastases Cell Lines

Bone metastases are associated with poor prognosis and low quality of life for the affected patients. Photodynamic therapy (PDT) emerges as a noninvasive therapy that can target local metastatic bone lesions. This paper presents an in vitro method to study the PDT effect in adherent cell lines. To this end, we demonstrate a step-by-step approach to subject both primary (giant cell bone tumor) and human bone metastatic cancer cell lines (derived from a primary invasive ductal breast carcinoma and renal carcinoma) to 5-aminolevulinic acid (5-ALA)-mediated PDT. 
After 24 h post 5-ALA-PDT irradiation (blue light-wavelength 436 nm), the therapeutic effect was assessed in terms of cell migration potential, viability, apoptotic features, and cellular growth arrest (senescence). Post 5-ALA-PDT irradiation, musculoskeletal-derived cell lines respond differently to the same doses and exposure of PDT. Depending on the extent of cellular damage triggered by PDT exposure, two different cell fates-apoptosis and senescence were noted. Variable sensitivity to PDT therapy among different bone cancer cell lines provides useful information for selecting more appropriate PDT settings in clinical settings. This protocol is designed to exemplify the use of PDT in the context of musculoskeletal neoplastic cell lines. It may be adjusted to investigate the therapeutic effect of PDT on various cancer cell lines and various photosensitizers and light sources.

This protocol presents a step-by-step methodological approach of exposing bone metastatic cells lines and primary bone tumors to 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy (PDT). The effects on cell migration potential/invasiveness, viability, apoptosis, and senescence potential are also analyzed following PDT exposure.

Bone metastases are associated with poor prognosis and low quality of life for the affected patients. Photodynamic therapy (PDT) emerges as a noninvasive ...

암 연구학

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic Therapy is a novel approach for a more tumor selective treatment.
Photodynamic Therapy (PDT) that makes use of a nontoxic photosensitizer (PS), which, upon activation with light of a specific wavelength in the presence of oxygen, generates oxygen radicals that elicit a cytotoxic response1. Despite its approval almost twenty years ago by the FDA, PDT is nowadays only used to treat a limited number of cancer types (skin, bladder) and nononcological diseases (psoriasis, actinic keratosis)2.
The major advantage of the use of PDT is the ability to perform a local treatment, which prevents systemic side effects. Moreover, it allows the treatment of tumors at delicate sites (e.g. around nerves or blood vessels). Here, an intraoperative application of PDT is considered in osteosarcoma (OS), a tumor of the bone, to target primary tumor satellites left behind in tumor surrounding tissue after surgical tumor resection. The treatment aims at decreasing the number of recurrences and at reducing the risk for (postoperative) metastasis.
In the present study, we present in vitro PDT procedures to establish the optimal PDT settings for effective treatment of widely used OS cell lines that are used to reproduce the human disease in well established intratibial OS mouse models. The uptake of the PS mTHPC was examined with a spectrophotometer and phototoxicity was provoked with laser light excitation of mTHPC at 652 nm to induce cell death assessed with a WST-1 assay and by the counting of surviving cells. The established techniques enable us to define the optimal PDT settings for future studies in animal models. They are an easy and quick tool for the evaluation of the efficacy of PDT in vitro before an application in vivo.

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

The protocol reported here allows the evaluation of the efficacy of photodynamic therapy (PDT) in cell lines and the optimization of the PDT settings before applying the therapy in animal models.

골육종 세포의 광 역학 치료의 세포 독성 효능<em&gt; 체외</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

근적외선 Photoimmunotherapy 기술을 사용하여 혼합 된 3D 문화에서 선택적 세포 제거

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

생체공학

An In-House-Built and Light-Emitting-Diode-Based Photodynamic Therapy Device for Enhancing Verteporfin Cytotoxicity in a 2D Cell Culture Model

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built using a set of conventional programmable light-emitting diodes (LEDs), a liquid crystal display (LCD) module, and a light sensor connected to a commercial microcontroller board. The box-based structure of the prototype was made with medium-density fiberboards (MDFs). The internal compartment can simultaneously allocate four cell culture multiwell microplates.
As a proof of concept, we studied the cytotoxic effect of the photosensitizer (PS) verteporfin against the HeLa cell line in two-dimensional (2D) culture. HeLa cells were treated with increasing concentrations of verteporfin for 24 h. The drug-containing supernatant medium was discarded, the adherent cells were washed with phosphate-buffered saline (PBS), and drug-free medium was added. In this study, the effect of verteporfin on cells was examined either without light exposure or after exposure for 1 h to light using red-green-blue (RGB) values of 255, 255, and 255 (average fluence of 49.1 &#177; 0.6 J/cm2). After 24 h, the cell viability was assessed by the 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay.
Experimental results showed that exposure of cells treated with verteporfin to the light from the device enhances the drug&#39;s cytotoxic effect via a mechanism mediated by reactive oxygen species (ROS). In addition, the use of the prototype described in this work was validated by comparing the results with a commercial PDT device. Thus, this LED-based photodynamic therapy prototype represents a good alternative for in vitro studies of PDT.

Here, we describe a novel, simple, and low-cost device to successfully perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays using two-dimensional HeLa cell culture and verteporfin as a photosensitizer.

2D 세포 배양 모델에서 Verteporfin 세포 독성을 향상시키기 위한 자체 제작 및 발광 다이오드 기반 광역학 치료 장치

This paper describes a novel, simple, and low-cost device to perform in vitro photodynamic therapy (PDT) assays, named the PhotoACT. The device was built ...

생화학

In Vitro and In Vivo Evaluation of Photocontrolled Biologically Active Compounds - Potential Drug Candidates for Cancer Photopharmacology

Photocontrolled, biologically active compounds are an emerging class of &#34;smart&#34; drug candidates. They provide additional safety in systemic chemotherapy due to their precise spatiotemporal activation by directing a benign, non-ionizable light to a specific location within the patient&#39;s body. This paper presents a set of methods to evaluate the in vitro potency and ex vivo efficiency of the photoactivation of photocontrolled, biologically active compounds as well as the in vivo efficacy at early stages of drug development. The methodology is applied to anticancer cytotoxic peptides, namely, the diarylethene-containing analogs of a known antibiotic, gramicidin S. The experiments are performed using 2D (adherent cells) and 3D (spheroids) cell cultures of a cancer cell line (Lewis lung carcinoma, LLC), live tissue surrogates (pork meat mince), and an allograft cancer model (subcutaneous LLC) in immunocompetent mice. The selection of the most effective compounds and estimation of realistic phototherapeutic windows are performed via automated fluorescence microscopy. The photoactivation efficiency at varying illumination regimens is determined at different depths in a model tissue, and the optimal light dosage is applied in the final therapeutic in vivo experiment.

In Vitro and In Vivo Evaluation of Photocontrolled Biologically Active Compounds - Potential Drug Candidates for Cancer Photopharmacology

This protocol presents a set of experiments adopted for the evaluation of photoswitchable anticancer peptides, that can be used in the preclinical screening of such compounds. This includes cytotoxicity assessment in 2D and 3D cell cultures, the evaluation of ex vivo (model tissue) photoisomerization efficiency, and in vivo efficacy.

광제어 생물학적 활성 화합물의 시험관 내 및 생체 내 평가 - 암 광약리학을 위한 잠재적 약물 후보

Photocontrolled, biologically active compounds are an emerging class of &#34;smart&#34; drug candidates. They provide additional safety in systemic ...

LED-Based In Vitro Screening for Assessing Photoactivable Molecules in Bacterial Photodynamic Inactivation

The rise of multi-drug-resistant infections and the lack of new antibiotic classes have renewed interest in alternative therapies like photodynamic inactivation of bacteria (aPDI). This process involves the administration of a photosensitizer (PS) activated by a suitable visible light source, producing exacerbated levels of reactive oxygen species (ROS) that damage crucial cellular biomolecules, ultimately causing bacterial cell death. It is crucial to create standardized, easy-to-use, and reproducible initial tests to assess and compare the effectiveness of light-induced phototoxicity of potential photosensitizers. This study introduces a simple and efficient in vitro technique for assessing photodynamic activity against planktonic bacterial cells. By employing a 96-well microplate format along with a large LED panel, the system facilitates the systematic evaluation of various compounds. Such a configuration allows for high-throughput screening of potential photosensitizers in a controlled and consistent environment, simplifying the process of identifying promising candidates for further development. This flexible platform serves as an important step in advancing the development of innovative photodynamic therapies for managing antibiotic-resistant infections.

This protocol describes a straightforward and economical method for evaluating the effectiveness of potential photosensitizers in antibacterial photodynamic inactivation (aPDI), using a 96-well plate format combined with an LED panel light source. This approach enables the simultaneous testing of multiple experimental conditions, including different concentrations, compounds, and bacterial strains.

박테리아 광역학 불활성화에서 광활성 분자를 평가하기 위한 LED 기반 체외 스크리닝

The rise of multi-drug-resistant infections and the lack of new antibiotic classes have renewed interest in alternative therapies like photodynamic ...

In Vitro Phototoxicity Assay: A PDT-based Method to Evaluate the Phototoxic Potential of a Photosensitizer in Lung Cancer Cells

Source: Chang, J. E., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54865/anticancer-efficacy-photodynamic-therapy-with-lung-cancer-targeted">Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016).
Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method for lung cancer treatment. Photosensitizers selectively accumulate in tumor tissue and lead to tumor cell death in the presence of oxygen and the proper wavelength of light. In this protocol video, PDT-based method is used to evaluate the phototoxic potential of a potential photosensitizer in lung cancer cells.

체외 광독성 분석법: 폐암 세포에서 광감작제의 광독성 가능성을 평가하기 위한 PDT 기반 방법

Source: Chang, J. E., et al. Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016).
...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Lung Cancer

In vitro study

In Vivo Antitumor Efficacy Analysis of PDT: A Technique to Determine the Phototoxic Potential of a Photosensitizer in Tumor Bearing Mice

Source: Chang, J. E., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54865/anticancer-efficacy-photodynamic-therapy-with-lung-cancer-targeted">Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles.</a> J. Vis. Exp. (2016).
Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method for lung cancer treatment. Photosensitizers selectively accumulate in tumor tissue and lead to tumor cell death in the presence of oxygen and the proper wavelength of light. This video describes the in vivo anti-tumor efficacy analysis using photosensitizer containing nanoparticles in a tumor-bearing mouse, to determine the phototoxic potential of the photosensitizer.

PDT의 생체 내 항종양 효능 분석: 종양 보유 마우스에서 광감작제의 광독성 가능성을 측정하는 기술

Source: Chang, J. E., et al. Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles. J. Vis. Exp. (2016).
Photodynamic ...

Photodynamic 치료 체 외에서 접근

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