이 작품은 캐나다 연구소의 건강 연구 (148808 148792)에 의해 지원 되었다, SE는 심 혼 및 치기 기초, 온타리오 주정부 사무실, 십 센트의 3 월, 피터 Munk 심장 연구에 대 한 테드 로저스 센터에서 직원 수상에 의해 지원 되었다 심장 센터입니다. XCC는 CIHR 밴팅 화목을 보유 하고있다. 라 심 혼 & 치기/리처드 Lewar 재학 수상 보유 하고있다.

윤리 성명:이 프로토콜을 검토 하 고 대학 건강 네트워크 (토론토, 캐나다)에서 동물 관리 위원회에 의해 승인 동물 관리에 캐나다 위원회 준수 하 고.
1. 버퍼 준비
<ol><li>HBB 버퍼 (행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS), 2% 열 비활성화 소 혈 청, 0.2% 소 혈 청 알 부 민)을 준비 합니다. 열 10 mL 비활성화 둔감 한 혈 청 및 HBSS의 500 ml 소 혈 청 알 부 민 1 g 추가 합니다. 필터는 0.2 µ m 필터를 통해 소독 및 4 ° c.에 저장</li>
	<li>FACS 버퍼를 준비 (인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 2% 열 소 혈 청, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA, pH 8.0) 비활성화). 10 mL 열 비활성화 둔감 한 혈 청 및 PBS의 500 mL에 0.5 M EDTA의 1 mL를 추가 합니다. 필터는 0.2 µ m 필터를 통해 소독 및 4 ° c.에 저장 참고: 솔루션을 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 1 개월.</li>
</ol>2. 순환 하는 백혈구의 라벨
<ol><li>Aseptically 200 µ L/마우스의 최종 주입 볼륨에 대 한 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS)에 희석 하는 항 체의 1 µ g와 반대로 마우스 CD45 주입을 준비 합니다. 28.5 G 인슐린 주사기에 볼륨을 로드 하 고 멀리 빛 유지. 참고: 사용 하 여 두 개의 서로 다른 형광 색소 표시 안티 CD45 항 체 intracardiac 얼룩에서 혈관 내 (i.v. 관리 통해 스테인드) 차별화 (소화 후 스테인드, 4 단계 참조).</li>
	<li>
전 5 분 동안 적 열 램프에 꼬리를 노출 하 여 쥐 (8-12 주 이전) 따뜻한. 주의: 동물을 과열 하지 마십시오. 안전한 거리에서 램프를 유지 (> 30 cm).<ol>
<li>적절 한 장치를 사용 하 여 sternal 위치에서 동물을 제 지. 색인과 중간 손가락으로 꼬리의 기지와 엄지 및 손가락으로 꼬리의 중반 원심 지역 immobilizing 함으로써 비 지배적인 손 가진 꼬리 안정 고. 주의: 피부를 뽑아 수로 꼬리의 끝에 너무 많은 힘을 적용 되지 않습니다. 정 맥으로 향하도록 경사와 바늘을 삽입 합니다. 그것은 정 맥을 펑크 쉽게 병렬 항상 정 맥 바늘을 유지. 참고: 피가 주사기를 입력 발생할 수 있습니다 및 좋은 주입의 표시 이다. 90도 각도로 바늘을 절곡 i.v. 관리 용이 하 게 수 있습니다. 안전 사무실 확인으로 벤딩 바늘 위험을 나타낼 수 있습니다.</li>
		<li>200 µ L을 꼬리 정 맥에 정 맥 주사. 유체 흐름을 쉽게 하 고 일시적으로 혈관을 선택을 취소 해야 합니다. 주의: 저항을 충족 하는 경우에 액체를 강요 하지 마십시오. 이 바늘의 방치의 표시 이다.</li>
		<li>고통 없이 마우스 euthanizing 전에 5 분 동안 순환 항 체를 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 심장 분리 및 소화
<ol><li>
CO2 를 사용 하 여 마우스를 안락사 또는 다른 제도 허용된 안락사 절차.
	<ol>
<li>CO2 안락사에 대 한 CO2 챔버에 마우스 놓고 (즉, 챔버 10 L, 2 L/min에서 칠 경우) 분당 챔버 볼륨의 20%를 채우기 비율을 설정 합니다. 호흡이 정지 될 때까지 2 분 및 모니터 마우스에 대 한 실행 합니다.</li>
		<li>CO2 를 종료 하 고 추가 1-2 분 호흡 챔버를 열기 전에 정지 했습니다 확인에 대 한 마우스를 두고 고 마우스는 마우스 처리를 진행 하기 전에 죽은 것인지 발가락 핀치를 수행.</li>
	</ol>
</li>
	<li>70% 에탄올과 마우스 스프레이입니다. 복 부에 피부를 들어올리고 흉 골까지 엉덩이의 수준에서 시작 하 여 복 부 정중 선 따라 절단 하 여 마우스를 해 부 합니다. 복 부를 열고 노출 막 간 이동 합니다.</li>
	<li>
폐와 심장 puncturing 되지 않도록 주의 하면서 중간의 양쪽에 횡 경 막, 다음 갈비뼈를 잘라.
	<ol>
<li>노출 마음 필 링으로 다시 갈비뼈, 다음 컷된 먼저 왼쪽된 심 방 뒤 오른쪽 심 방. 주의: 심 방,이 기관에 포함 된 혈액을 내 뿜 기의 효율성을 줄일 수로 동맥 또는 정 맥, 부상 보장을 자를 때 주의 사용 합니다.</li>
		<li>21g 바늘으로 장착 되어 60 mL 주사기를 사용 하 여 차가운 PBS와 차가운 PBS의 15-20 mL와 하트 perfuse 부드럽게 집게와 심장의 기본을 파악 하 고 꼭대기 근처 좌 심 실에 바늘을 삽입. 우 심 실에서 절차를 반복 합니다. 적절 한 주입 흰색 폐 창백한 간 결과. 참고: 관류 수행 되어야 한다 안락사 후 5 분 이내 순환 세포와 관심의 장기를 오염 시킬 수 있는 혈액 응고를 피하기 위하여.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
심장의 기지 겸 자 잡고 부드럽게 올려 심장 다음 pericardial 자루, 대동맥 및 혈관, 주요 폐 동맥을 절단 하 여 마음을 분리 합니다.
	<ol>
<li>부드럽게 보풀 깨끗 한 종이 타월에 엄지와 집게 손가락 사이의 마음을 잡고 마음을 청소 하 고 겸 심 방 및 주요 동맥 및 정 맥 및 어떤 다른 오염 물질의 잔재 해 내. 참고:는 심 방 전체를 제거 하 고 전혀 다른 조직, 혈관, 폐 등이 조직 그들의 자신의 거주 면역 세포를가지고 있는지 확인 합니다. 폐 특히 인구가 큰 면역 세포는 그 심근의 작은 인구를 마스크할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
차가운 PBS의 50 µ L 5 cm 플라스틱 접시에 마음을 놓습니다.
	<ol>
<li>보이는 아무 조각이 있다 그리고 그것이 부드러운 일관성 때까지 곡선된 해가 위를 사용 하 여 마음을 말하다. 참고: 조직 손실을 최소화 하기 위해 자르고 동안 접시의 포함 된 영역에서 마음을 유지 하려고 합니다.</li>
		<li>Thetrituratedheart 조직 2 mL microcentrifuge 튜브와 함께 800 µ L 찬 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM)으로 곡선된 집게를 사용 하 여 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
나, 60 U/mL hyaluronidase 유형 I-S의, 그리고 DNase의 60 U/mL 450 U/mL ofcollagenase 추가-각 샘플을.
	<ol>
<li>45-60 분 50 rpm에서 락 통에 37 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
소화, 짧게 소용돌이 샘플 후 (20 s) 즉시 샘플 4 ° c.에 계속 하 얼음에 장소
	<ol>
<li>1 mL pipettor를 사용 하 여 플라스틱 샘플 아래로 조직 샘플 균질 및 피 펫 팁을 방해할 하지 않습니다 때까지. 참고: 플라스틱을 특정 한 횟수를 정의 재현성을 증가할 수 있습니다. 마음은 최적의 소화 되지, 심근의 조각 피펫으로 방해 수 있습니다. 부드럽게 microcentrifuge 튜브에 대 한 피 펫 팁을 연 삭 균질 직물의 더 큰 조각을 하는 데 도움이 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
미리 젖은 차가운 HBB의 1 mL 50 mL 원뿔 튜브에 40 µ m 셀 스 트레이너.
	<ol>
<li>무 균된 샘플 필터에 추가 하 고 차가운 HBB의 12-14 mL를 천천히 붓는 의해 통해 세척.</li>
		<li>전송 필터링 이라는 15 mL 원뿔 튜브 샘플 및 4 ° c.에 계속</li>
	</ol>
</li>
	<li>
4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기 샘플 상쾌한에서 발음.
	<ol>
<li>각 샘플에 염화 염화 칼륨 (ACK) 세포의 용 해 버퍼의 1 mL을 추가 하 여 붉은 혈액 세포를 lyse. Vortexing에 의해 샘플을 resuspend 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>세포의 용 해 완료 되 면 추가 5-8 mL의 차가운 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 혈을 중지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>400 x gfor 4 ° c.에서 5 분에 샘플을 원심 상쾌한에서 발음.</li>
	<li>각 샘플을 microcentrifuge 이라는 1.5 mL 튜브에 FACS 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기까지 2 h 4 ° c.에 저장 된 샘플</li>
</ol>4. flow Cytometry 얼룩이 지 고 분석
<ol><li>
4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기 샘플
	<ol>
<li>일반적인 항 체 바인딩을 줄이기 위해 희석 1: 100 안티-CD16/CD32 및 Monocyte 차단 (1:20) 샘플 당 50 µ L FACS에 대 한 회계 ( 재료의 표참조). 15 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
		<li>샘플 당 FACS의 50 µ L에 대 한 항 체 희석 (각 항 체에 대 한 1: 250) 회계를 준비 합니다. 참고: 생존 염료를 포함할 수 있습니다 항 체 칵테일에 죽은 세포를 제외 하기 위하여. 또는, 사용 (그림 1C 와 D) 흐름 분석에 의해 작은 크기 제외 될 수 있습니다.</li>
		<li>세척, 없이 항 체 각각 샘플링 하 고 믹스 마스터 믹스의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>어둠 속에서 30 분 동안 4 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세척 하 고 샘플 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 각 샘플에 600 µ L FACS를 추가</li>
	<li>상쾌한 오프 aspirate와 300 µ L FACS에 펠 릿을 resuspend. 어둠 속에서 4 ° C에서 샘플을 유지. 참고: DAPI, 등 일부 생존 염료, cytometry를 실행 하기 전에 10 분 이내 얼룩이 필요 합니다.</li>
	<li>Cytometry 분석 ( 그림 1 및 2참조) 다음 3 h 이내. 더 이상 시간이 필요, 단기 고정 낮은 농도 paraformaldehyde를 사용 하 여 경우 (0.5-1 %PBS) 얼룩을 보존 하는 것이 좋습니다. 참고: 그것은 좋습니다 흐름 cytometer의 응용의 방해를 방지 하기 위해 시작 흐름 cytometry 분석 전에 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 샘플을 필터링 할.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis.">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotective+function+of+cardiac+macrophages.">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li><li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD103(+)+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis.">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li><li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells.">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+migration+of+effector+CD8++T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung.">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li><li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+CD103++dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha++conventional+dendritic+cells.">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li></ol>

저자는 공개 없다.

심근 염증, 또는 심근 염, 가장 심혈 관 질환의 기능입니다. 그러나, 심근 질병이 아닌 상태에서 자체 면역 구성 요소 없는 아니다. 정상 상태 동안 많은 면역 세포에는 심근 있으며 유지 보수 및 보호의 필수적인 역할. 셀의 이러한 다양 한 인구 특성 것 없었을이 프로토콜에서 제시 하는 것과 같은 방법 없이 불가능 하다.
심근의 기계 및 효소 소화의 조합 분석, 흐름 cytometry 또는 immunomagnetic 구슬 격리 등의 다른 방법으로 조합에 사용할 수 있는 단일 세포 현 탁 액의 격리를 허용 합니다. 현재 방법에 관한 몇 가지 고려 사항 계정으로 촬영 해야 합니다. 첫째, 모든 우리의 분석; 심근 내 인구를 참조 이들은 자신의 작업 전문된 조직으로는 심 방 우리의 분석에서 배제 합니다. 둘째, 효소 사용 양의 소화 효소를 사용 하 여 다른 소스에서 설정에 도움을 활동 단위로 표현 됩니다. 그러나, 효소의 최종 농도와 소화의 시간 경험 주의자 최적화가 좋습니다, 크게 셀 생산량을 줄일 수 있습니다 효소를 제한 하 고 너무 많은 소화 크게 생존 능력에 영향을 미칠 수 있습니다. 셋째, 선택적 단계 이라는 항 체의 혈관 내 관리와 관련 된 특히 좋습니다 흔히 인구 (림프 톨, monocytes 또는 호 중구) 등 정상적인 심근2 또는 상황에서 공부를 할 때 때 혈액에 인구 수가 (monocytosis, granulocytosis 또는 lymphocytosis) 변경 될 수 있습니다 있는 심근이 메서드 또는, 양자 택일로, 현미경을 사용 하 여 확인 하는 시간 변경의 잘못 된 인상을 줄 수 있습니다. 그러나,이 단계는 한정 된 유틸리티의 대 식 세포 또는 성숙한 Dc 분석으로이 세포는 거의 혈액 (그림 2D)에 상당한 수량에서 발견. 관리 하는 항 체의 양을 최적화 하는 것이 중요 하다 고 마우스를 희생 하기 전에 보육 시간 장기로 보육을 허용할 수 있다 염증된 심근에서 특히 마음에 일부 항 체 확산. 마지막으로, 그것은 매우 중요 한 주요 동맥, 정 맥 또는 폐 같은 다른 조직의 잔해를 제거, 심장의 격리에 세심 한. 이러한 오염 물질 조직 있다 높은 심근 원주민 인구 마스크를 쉽게 할 수 있는 면역 세포의 숫자를 상승 된.
그것은 죽은 세포의 배제를 수행 하는 매우 중요 하다, 생존 염료를 사용 하 여 여부를 또는 소화 (또는 질병 모델에서 조직 손상) 흐름 cytometry 분석, 중 소형 제외를 통해 상대적으로 많은 양의 죽은 세포를 발생할 수 있습니다. 우리 크기와 생존 레이블 (그림 1B 와 D)를 사용 하 여 죽은 세포 배제의 효율 비교는 그들의 가까운 등가 보여주는. 중요 한 것은, 크기 제외가이 절차는 크게 셀 크기 감소 서 고정 및 permeabilization 후 사용할 수 없습니다.
이 특성을 일부 마커, 특히 형광 높은 에너지 (에 의해 흥분된의 표현 하려고 할 때 더 중요 한 문제를 나타냅니다 autofluorescence 거의 cytometry 사용 하 여 심장 세포를 식별 하는 문제가 있지만, 짧은) 빛 파장 (350-500 nm) 이 실험에서 적극 권장 하 isotype 컨트롤을 사용 하 여, (fluorescein isothiocyanate, phycoerythrin, 퍼시픽 블루/화려한 바이올렛 421) 파란색과 보라색 레이저를 피하기 위해 사용할 형광 600 위 배출 nm, allophycocyanin 등.
여기에 소개 하는 것으로 프로토콜을 사용 하 여 강도와 평가 및 심혈 관 질환의 결과에서 염증의 종류의 역할을 파악 하는 문학의 증가 금액으로 더 중요 한 되 고 있다. 이 메서드는 조직학 보다 셀 특성의 높은 수준을 허용합니다. 예를 들어, 그들의 프로그램된의 다른 기능2대 식 세포의 ontogenically 다른 하위 집합의 식별을 위해 허용 하는 혈통 추적의 사용. 마찬가지로,이 방법은 심근 염증 동안 T 세포 응답을 공부 하는 데 사용 하 고 비보 전 T 셀 분극8공부를 자극과 결합 될 수 있습니다.

심근 긴장 또는 부상, 허 혈 성 등 (국 소 빈 혈 reperfusion 또는 심근 경색)의 다른 형태와 비-허 혈 성 고혈압 (심근 염), 아니라 회복 및 보호, 염증 세포의 모집 홍보 병원 성 속성입니다. 1891, 빠르면 Romberg 처음 발진 티 푸 스, 성 홍 열1감염 환자의 심근에 세포 침투의 존재를 설명. 그러나, 심장 면역 세포의 상세한 연구 고급 immunophenotyping 기술 개발이 필요합니다. 그 결과, 최근에 우리가 안정 상태 동안 필수적인 유지 관리 역할을 가진 면역 세포의 다양 한 인구는 심근 내에 있는 이해 하기 시작 했습니다.
조직학, 되었으며 여전히 염증 동안 심장 면역 세포의 특성을 가장 일반적인 방법입니다. 그러나, 조직학 나타내는 유용한 진단 도구, 심장 면역 세포의 연구에 사용 중요 한 제한이 있다. 심근에 있는 면역 세포 총 세포의 아주 작은 비율을 대표 하 고 비례적으로 엄청난 공간에 더 많거나 적은 고르게 배포 됩니다. 마찬가지로, 여러 형태의 심장 염증, 바이러스 성 심근 염 등 염증의 초점 패턴을 표시합니다. 이 의미는 심장의 면역 시스템의 정확한 분석 종종 조직학 샘플링, 바이어스를 줄이기 위해 비용을 증가 시키기의 더 높은 학위를 필요로 합니다. 또한, 조직학 매우 제한 된 양의 셀 식별 (예: 매개 변수 개수)에 유용한 정보를 제공합니다. 여러 식 마커 (를 포함 하 여 표면 마커, 녹음 방송 요인 또는 분 비 분자)의 사용을 필요로 하는 셀의 하위 집합의 증가 수, cytometry immunophenotyping를 위한 가장 강력한 도구 자체를 설립 했다 저가 및 높은 처리량
Immunophenotyping 기술의 사용은 세포의 많은 수의 단일 세포 분석에 대 한 허용 하는 효율적인 소화 프로토콜의 개발에 밀접 하 게 의존. 세포 추출의 철저 한 프로토콜의 개발 심장 면역학의 연구 기회의 새로운 창을 열었습니다. 소화, cytometry 및 transcriptomics의 조합을 통해 대 식 세포와 수지상 세포에에서의 주요 인구 특징된2,3되었습니다. 정상 상태 동안 심장 면역 세포의 가장 풍부한 인구는 CD64+MerTK+ 세포, 더 분할 될 수 있다는 CCR2 또는 CD11c2의 그들의 표정에 따라. CCR2+ 세포 성인 골 수 조에서 발생 한 반면 대부분 CCR2의 MHC-II에 대 한 높은 또는 낮은 수준의 표현할 수,- 대 식 세포는 태아 근원의 주로 이다. 대 식 세포 수리4 부상 또는 안정 상태에서 전기 연결6 을 지 원하는 동안 파편5 의 제거 등의 주요 기능을 수행 합니다. 다른 형태의 염증 동안 Ly6C안녕하세요 MHC-IIlo CD64int monocytes의 중요 한 유입 발생는 나중에 Ly6C안녕하세요 CCR2 차별화+ 세포2,7 . 현저 하 게 더 작고, 그러나 중요 한, 인구에서 건강 한 개인의 심근 세포의 수지상 세포8,9로 구성 된다. 심장 기존의 DCs (cDCs)의 두 가지 주요 하위 집합을 최근 특징 되었습니다: cDC1 (CD103+ Dc)와 cDC2 (CD11b+ Dc). DCs 감염8 에 대 한 방어에 중요 한 역할을 재생 하지만 또한 심근 경색9중 특히 염증, 동안 자기 부상을 홍보할 수 있습니다.
여기, 우리가 마우스 심근에서 가능한 심장 면역 세포의 분리에 대 한 간단한 방법을 설명합니다. 메서드를 사용 하면 단일 셀 서 스 분석, 또는 추가 정화, 교류 cytometry 정렬 또는 자석 구슬 농축 수를 얻기 위하여 셀 스 트레이너 여과와 효소 및 기계적 소화를 결합 합니다. Extravascular 심근 세포의 정확한 측정 심장 microvasculature의 혈 류에서 가능한 오염 물질을 제거 하기 위해 심장 관류를 필요 합니다. 또한, 우리는 더 심근 세포 Galkina 외. 프로토콜10에 따라 혈관 내 오염 물질에서 차별화 하는 데 사용할 수 있는 면역 세포의 혈관 내 라벨의 단계는 선택 사항 제시. 마지막으로, 우리는 주요 대 식 세포 및 cDC 모집단을 식별 하는 기본적인 흐름 cytometry 분석을 제시.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:340px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:123px;">Wisent</td>
			<td style="width:185px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:167px;">1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-511-CL</td>
			<td>1x HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum filter , 0.2 &#181;m Filtropur V50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">28G 1/2 1 cc insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">60 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td>1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td>from Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase type I-S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase-I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513</td>
			<td>from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell strainer, 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128025</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC anti-mouse CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121414</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117334</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PE anti-mouse Ly-6G</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse I-Ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116422</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139315</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103113</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>1:40 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>426101</td>
			<td>1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo V10</td>
			<td>TreeStar Inc</td>
			<td></td>
			<td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse: Batf3-/-</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX: 013755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of extravascular immune cells of the heart

면역 체계가 건강 한 심장의 필수적인 구성 요소입니다. 심근은 정상 상태와 다른 형태의 염증 동안 기능 구획과 다른 면역 세포 하위 집합의 풍부한 인구에 게 가정. 최근까지 연구에서에서 면역 세포의 현미경의 사용을 요구 하거나 심한 염증 동안 충분 한 감도 제공 하지만 하지 못했습니다 자신 있게 제대로 개발된 소화 프로토콜 식별 작은-하지만 키-인구 정상 상태 동안 셀입니다. 여기, 우리는 간단한 방법 결합 효소 (콜라, hyaluronidase DNAse)와 기계적 소화 murine 마음 앞에 작은 차별화에 놓여있는지 분류 항 체의 혈관 내 관리의 논의 하지만 피할 수 없는 혈관 내 세포 오염 물질입니다. 이 방법은 생성 식별 형질, 정량화, cytometry에 의해 분석 하거나 더 형광 활성화 된 세포 분류와 마그네틱 비드 분리 정화 수 있는 분리 가능한 세포의 현 탁 액 transcriptional 분석 또는 생체 외에서 연구. 우리는 주요 대 식 세포와 수지상 세포 인구 중심의 차별화 하는 단계별 흐름 cytometric 분석의 예를 포함 합니다. 중간 크기의 실험 (10 마음)에 대 한 절차의 완료는 2-3 h를 요구 한다.

날짜 하려면, 좋은 방법 cardiomyocytes 같은 다른 심장 세포 구성 요소에서 면역 세포를 분리 설계 되었습니다. 따라서, cytometry에 의해 심장 단일 세포 현 탁 액의 분석 단일 세포 및 작은 크기 제외 제어그림 1(A) 면역 세포 인구를 식별 하는 CD45와 미리 게이팅 필요 합니다. 또는, 생존 얼룩이 죽은 세포를 제외 하려면 수행할 수 있습니다. 소형 제외 및 생존 염료 얼룩이 죽은 세포 (그림 1B 와 1 D) 제외 거의 동일한 방법을 나타냅니다. 그것은 좋습니다 소화 절차 후 곧 얼룩이 지는 항 체와 함께 진행 하 고 항상 4 ° C에 세포 현 탁 액을 유지 하는 세포의 생존 수 있습니다 부패로. 이 절차는 일반적으로 실행 가능한 면역 세포의 약 80-90%를 생성합니다.
심근의 많은 여전히 보류 중인 식별 및 특성화, 면역 세포의 다양 한 식민지 주택. 대 식 세포, CD64 됨으로+ 셀은 모든 면역 세포 (그림 1C, 톱)의 60-70%는 심장의 주요 면역 인구. 성인 murine 심장의 소화에 대 한 수익률 3-5 x 104 의 세포, 심장의 크기의 따라. 심장 세포 수 수 더 세분화 CD11c 또는 CCR2의 그들의 표현과 MHC-II2의 그들의 수준에 따라.
다른 심장 면역 부분 모집단을 잘 특징은 기존의 수지상 세포입니다. 기존의 DCs는 CD64- 세포 MHC-II의 높은 수준과 CD11c의 상부에 그 표현 중급 (그림 1 C, 하단). 이 세포 수 더 분할 될 CD103 또는 CD11b8,9의 그들의 표정에 따라. Dc는 훨씬 작은 심장 부분 모집단을 세포에 비해 나타냅니다. 소화 성인 murine 심장의 각 하위 집합의 150, 500 Dc 사이 생성합니다.
차가운 PBS 가진 심장의 관류는 심근 내의 면역 세포 인구를 식별 하는 경우 필수적입니다. 그러나, 불완전 재 관류 심장 침투에 변화 보다 주변 변화 (혈액)에 근거 할 수 있다 중요 한 바이어스로 이어지는 샘플에서 혈관 내 오염 물질의 양이 증가할 수 있습니다. 이러한 경우에 매크로 microvasculature그림 2(A)를 통해 서 회람 하는 모든 면역 세포를 레이블, 형광 표시 안티 CD45 항 체의 혈관 내 행정 수에서 심근 세포 분화 혈관 내 오염 물질입니다. 그림 2 B 는 면역 세포의 20%는 혈관 내 오염 물질 불완전 perfused 심장의 예가 나와 있습니다. 중요 한 것은,이 정도의 오염 효과가 거의 대 식 세포 및 DC 분석에 있기 때문에이 세포는 거의 혈액 (그림 2D)에서 발견 됩니다.
Cytometry 심근의 단일 세포 현 탁 액의 사용은 심장의 작은 부분 모집단의 연구에 대 한 수 있습니다. 예를 들어 녹음 방송 요인 BATF3의 결핍 성숙 CD103의 개발을 방지 하기 위해 표시 되었습니다+ Dc 여러 조직11. 이것은 또한 심근의 경우 사실 경우, 공부 하기 위하여 8-15-주-오래 된 BATF3 불충분 한 또는 (C57BL/6 배경)에서 제어 littermates에서 심장 세포의 단일 셀 정지 cytometry 사용 하 여 분석 되었다. 작은 인구 크기와 DC 하위 집합을 차별화 하는 데 필요한 마커의 수 조직학 수 없습니다 제공 확실 한 대답을 도달 하는 분석에 대 한 충분 한 전력. 그러나, 사용 하 여 흐름 cytometry 분석의 심근의 면역 세포를 비교 하 여 야생-타입 Batf3/- 생쥐, CD103의 부족 대+ Dc는 후자 (그림 3A와 B)에서 확인할 수 있습니다. 또한, 우리는 BATF3 부족 크게 다른 심장 인구 (그림 3C, D)의 구성을 변경 하지 않았다 관찰. 이러한 결과 단일 세포 현 탁 액을 달성 하기 위해 효소 및 기계적 소화의 결합된이 메서드를 사용 하 여 얻을 수 있는 감도의 정도를 예증 하다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58114/58114fig1.jpg"> 그림 1 : 심장 세포 및 Dc에 대 한 전략을 게이팅. C57BL/6 쥐에서 고립 된 마음, 설명 된 대로 소화 했다 고 단일 세포 현 탁 액 cytometry에 의해 분석 되었다. (A) Gating CD45 + 라이브 내의 심장 세포의. CD45 라벨 비 면역 세포 (cardiomyocytes즉, 내 피 세포, 섬유 아 세포)의 매우 높은 수준을 포함 하는 심장 단일 셀 homogenate에서 면역 세포를 식별 하기 위해 사용 합니다. SSC-H 대를 비교 하 여 남자를 제외 SSC-A 뒤에 FSC-H 대 FSC-. 참고: SSC-A, SSC-H와 SSC W 또는 FSC-A, FSC-H 및 FSC-W 사이 다른 비교는 마찬가지로 유용 합니다. 다양 한 라이브 세포는 아주 작은 세포 (SSC-H 대 FSC-H 게이트)를 제외 하 여 수행할 수 있습니다. 죽은 셀 제외 크기 vs 생존 (DAPI) 얼룩을 사용 하 여의 (B) 비교. (C) 심장 세포의 식별에 대 한 전략을 게이팅 (CD11b+ CD64+ 세포) 및 Dc (CD64- MHC-II안녕하세요 CD11c+). MHC-II의 그들의 표정에 따라 심장 세포를 더 분류 될 수 있다 및 CD11c. 심장 Dc 세분화 될 수 있다 (D) 대표 작 DAPI + 죽은 세포 대 식 세포와 DC의 CD103 또는 CD11b.의 그들의 표정에 따라 작은 크기 제외 후 구획입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58114/58114fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58114/58114fig2.jpg"> 그림 2 : 오염 물질을 세포의 혈관 내 라벨. 혈관 내 CD45 혈액 호 중구 및 Ly6C안녕하세요 monocytes 안티 CD45 항 체에의 라벨의 (A) 비교 (레드) 치료 또는 치료 비 (파란색) 쥐. (B)는 심장 혈관 내 CD45 라벨 준비에서 혈관 내 오염 물질의 식별. (C) 대표적인 흐름 심근 및 혈관 내 세포의 플롯합니다. (D) 이라는 세포 대 식 세포 및 안티 CD45 i.v. 관리 후 DC 구획의 대표 구획. 참고 대 식 세포와 Dc는 독점적으로 extravascular입니다. 혈관 내 오염 물질은 일반적으로 림프 톨, monocytes, 호 중구2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58114/58114fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58114/58114fig3.jpg"> 그림 3 : 심장 세포와 BATF3 불충분 한 쥐에 있는 Dc의 정량화. Batf3심장 Dc의 대표적인 흐름 음모에 (A)+ + 및 Batf3/- 생쥐. Batf3심장 Dc의 부 량 (B)+ + 및 Batf3/- 생쥐. CD103의 부재를 참고+ Dc Batf3/- 생쥐에서. (C 와 D) Batf3에서 심장 세포 (MF)의 부 량+ + 및 Batf3/- 생쥐. 오차 막대 SEM. 레드 기호 대표 개별 동물을 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58114/58114fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

절연 및 심장의 Extravascular 면역 세포의 식별

이 프로토콜 격리, 식별 하 고 안정 된 상태 또는 염증 동안 쥐의 심근에 있는 면역 세포를 계량 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 제공 합니다. 프로토콜은 cytometry에 의해 더 분석 될 수 있는 단일 세포 현 탁 액의 세대에 대 한 효소 및 기계적 소화를 결합 합니다.

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

isolation-identification-extravascular-immune-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K 조회수.  University Health Network (UHN). 이 프로토콜 격리, 식별 하 고 안정 된 상태 또는 염증 동안 쥐의 심근에 있는 면역 세포를 계량 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 제공 합니다. 프로토콜은 cytometry에 의해 더 분석 될 수 있는 단일 세포 현 탁 액의 세대에 대 한 효소 및 기계적 소화를 결합 합니다.

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Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

연구

면역학 및 감염병학

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

셀을 별 모양으로 일곱 단계

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

심장 기능 면역 세포의 분리

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

의 기생충 말벌에 대한 소개<em&gt; Drosophila</em&gt; 그리고 Antiparasite 면역 반응

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

지방 조직 면역 세포의 분리

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...