Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Canadian Institutes of Health Research (148808 und 148792), SE wurde unterstützt durch ein Herz und Stroke Foundation, Personal Award vom Ontario Provincial Office, March of Dimes, Ted Rogers Centre for Heart Research und Peter Munk Herz Zentrum. XCC hält eine CIHR Banting Fellowship. LA hält ein Herz & Schlaganfall/Richard Lewar Zugehörigkeit Award.

Ethik-Anweisung: Dieses Protokoll wurde überprüft und genehmigt Animal Care auf vom Ausschuss des University Health Network (Toronto, Kanada) und ist in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care.
1. Puffer Vorbereitung
<ol><li>HBB Puffer (Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS), 2 % Hitze inaktiviert Rinderserum, 0,2 % Rinderserumalbumin) vorzubereiten. Fügen Sie 10 mL Hitze Rinderserum und 1 g Rinderserumalbumin, 500 mL HBSS inaktiviert. Filter durch einen 0,2 µm-Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie FACS-Puffer (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 2 % Hitze inaktiviert Rinderserum, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA, pH 8,0)). Fügen Sie 10 mL Hitze Rinderserum und 1 mL 0,5 M EDTA bis 500 mL PBS inaktiviert. Filter durch einen 0,2 µm-Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C. Hinweis: Lösungen können bei 4 ° C bis zu 1 Monat aufbewahrt werden.</li>
</ol>(2) Kennzeichnung des zirkulierenden Leukozyten
<ol><li>Aseptisch bereiten Sie Anti-Maus CD45 Injektion mit 1 µg des Antikörpers in sterilen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für eine endgültige Injektionsvolumen von 200 µL/Maus verdünnt. Ladevolumen in eine 28,5 G Insulin Spritze und Licht fernhalten. Hinweis: Verwenden Sie zwei verschiedene Fluorochrom-markierte Anti-CD45 Antikörper um den intravaskulären (gefärbt durch intravenöse Verabreichung) Die intrakardiale Färbung unterscheiden (gebeizt nach der Verdauung, siehe Schritt 4).</li>
	<li>
Wärmen Sie indem man die Rute zu einer roten Wärmelampe für 5 min es Mäuse (8 – 12 Wochen alt vor). Achtung: Überhitzen Sie das Tier nicht. Halten Sie die Lampe in einem sicheren Abstand (> 30 cm).<ol>
<li>Zurückhalten Sie das Tier in der sternalen Position mithilfe eines entsprechenden Geräts. Setzen Sie aus und stabilisieren Sie das Heck mit der nichtdominanten Hand durch Immobilisierung der Schwanzwurzel mit den Zeige- und Mittelfinger und der Mitte distalen Region der Schwanz mit Daumen und Ringfinger. Achtung: Beziehen Sie zuviel Kraft an der Spitze der Rute nicht, wie die Haut abgezogen werden kann. Stechen Sie die Nadel mit der Fase nach oben in die Vene. Halten Sie die Nadel parallel zu der Vene zu allen Zeiten, da es leicht zu durchstechen die Vene. Hinweis: Blut in die Spritze gelangen können auftreten und ist ein Zeichen für eine gute Injektion. Biegen die Nadel in einem Winkel von 90° kann intravenös zu verabreichenden Verwaltung erleichtern. Bestätigen Sie mit Ihrer Sicherheit Büro wie Biege Nadeln eine Gefahr darstellen können.</li>
		<li>Injizieren Sie 200 µL intravenös in die Rute Vene. Die Flüssigkeit sollte leicht fließen und deaktivieren Sie vorübergehend die Vene. Achtung: Nicht mit Gewalt Flüssigkeit im Widerstand erfüllt ist. Dies ist Zeichen für Abhandenkommen der Nadel.</li>
		<li>Lassen Sie Antikörper für 5 min vor menschlich euthanizing Maus zirkulieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Herz zu isolieren und die Verdauung
<ol><li>
Mäuse mit CO2 einschläfern oder durch andere Verfahren institutionell anerkannte Euthanasie.
	<ol>
<li>Platzieren Sie für CO2 Euthanasie den Mauszeiger in der CO2 -Kammer und die Füllrate auf 20 % des kammervolumens pro Minute (d. h., wenn die Kammer 10 L, Füllung bei 2 L/min). Führen Sie für 2 min und Monitor Maus bis Atmung aufgehört hat.</li>
		<li>Schalten Sie die CO2 und lassen Sie die Maus für eine zusätzliche 1-2 min. sicher atmen aufgehört hat, vor dem Öffnen der Kammers und führen ein Zeh Kneifen um zu bestätigen, dass die Maus tot bevor Sie mit die Maus zu verarbeiten ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sprühen Sie die Maus mit 70 % Ethanol. Heben Sie die Haut am Bauch und sezieren Sie die Maus durch Schnitt entlang der ventralen Mittellinie Anfang auf der Ebene von der Hüfte bis zum Brustbein. Öffnen Sie den Bauch und bewegen Sie die Leber, das Zwerchfell verfügbar zu machen.</li>
	<li>
Schneiden Sie die Membran dann die Rippen auf beiden Seiten der Mittellinie, wobei Sie darauf achten, um zu vermeiden, Punktion, Lunge und Herz.
	<ol>
<li>Expose das Herz durch Peeling damals die Rippen, schneiden zuerst die linken Vorhöfen gefolgt von den rechten Herzvorhof. Achtung: Seien Sie vorsichtig beim Schneiden die Vorhöfe, sicherzustellen, dass keine Arterien oder Venen verletzt werden, da dies die Effizienz der Spülung des Blutes in die Organe enthalten verringern kann.</li>
		<li>Durchspülen Sie das Herz mit 15 – 20 mL kaltem PBS mit einer 60 mL-Spritze mit einer Nadel 21 G ausgestattet und kaltem PBS. Vorsichtig fassen Sie die Basis des Herzens mit der Zange und Stechen Sie die Nadel in die linke Herzkammer in der Nähe der Spitze. Wiederholen Sie den Vorgang in der rechten Herzkammer. Eine korrekte Injektion führt zu weißen Lunge und Leber blass. Hinweis: Perfusion sollte durchgeführt werden innerhalb von 5 Minuten nach Sterbehilfe zur Vermeidung Blutgerinnung, die die Organe des Interesses mit zirkulierenden Zellen verunreinigen können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Halten Sie die Basis des Herzens mit der Pinzette und sanft hochziehen Sie das Herz, dann lösen Sie mitten durch Schneiden die großen Lungenarterien und Venen, Aorta und der Herzbeutel Plünderung zu.
	<ol>
<li>Das Herz sanft halten das Herz zwischen Daumen und Zeigefinger in einem sauberen fusselfreien Papiertuch zu reinigen und die Vorhöfe und die Reste der großen Arterien und Venen und andere Verunreinigungen mit einer Pinzette abziehen. Hinweis: Stellen Sie sicher die Gesamtheit der Vorhöfe wird entfernt und keine andere Gewebe wie die Lunge oder Blutgefäße, vorhanden sind, da diese Gewebe ihre eigenen Wohnsitz Immunzellen haben. Die Lunge hat insbesondere eine großen Immunzelle Bevölkerung, die die kleinere Populationen innerhalb der Herzmuskel überdecken kann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Legen Sie das Herz in einer 5 cm Plastikschale mit 50 µL kaltem PBS.
	<ol>
<li>Hacken Sie die Herzen mit gebogenen sezierenden Schere bis gibt es keine sichtbaren Stücke und es eine weiche Konsistenz hat. Hinweis: Versuchen Sie, das Herz in einem geschlossenen Bereich der Schale zu halten, beim Häckseln um Gewebeverlust zu minimieren.</li>
		<li>Thetrituratedheart Gewebe mit gebogenen Pinzette in 2 mL Microcentrifuge Schlauch mit 800 µL kalter Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) zu übertragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hinzufügen von 450 U/mL Ofcollagenase I, 60 U/mL von Hyaluronidase Typ I-S und 60 U/mL der DNase-ich zu jeder Probe.
	<ol>
<li>Inkubieren Sie Proben bei 37 ° C auf einen rockigen Shaker bei 50 u/min für 45 – 60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nach der Verdauung, kurz Wirbel Proben (20 s) und sofort auf Eis, Proben bei 4 ° c zu halten
	<ol>
<li>Mit Hilfe einer 1 mL-Pipette, pipette Proben rauf und runter bis Gewebeproben homogen sind und die PIPETTENSPITZE nicht verstopfen. Hinweis: Definieren eine bestimmte Anzahl von Wiederholungen, pipette kann Reproduzierbarkeit erhöhen. Wenn das Herz nicht optimal verdaut werden, können Teile des Myokard die Pipette behindern. Die PIPETTENSPITZE gegen den Microcentrifuge Schlauch vorsichtig Schleifen hilft, größere Stücke des Gewebes zu homogenisieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vornässen Sie 40 µm Zelle Sieb auf ein 50 mL konische Röhrchen mit 1 mL kalte HBB gelegt.
	<ol>
<li>Der Filter homogenisierten Probe hinzu und langsam gießen 12 – 14 mL kalte HBB durch Waschen.</li>
		<li>Gefilterten Proben auf einem gekennzeichneten 15 mL konische Rohr übertragen und bei 4 ° c halten</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Zentrifuge Proben bei 400 X g für 5 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie überstand.
	<ol>
<li>Lyse von Erythrozyten durch Zugabe von 1 mL der Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysis Puffer für jede Probe. Aufschwemmen Sie Proben durch aufschütteln und in 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Wenn Lyse abgeschlossen ist, fügen Sie 5 – 8 mL des kalten Hank ausgewogen Salz Lösung (HBSS), Hämolyse zu stoppen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Proben auf 400 X Gfor 5 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie überstand.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL der FACS-Puffer zu jeder Probe und Transfer zu einem gekennzeichneten 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Hinweis: Das Protokoll kann hier bis zu 2 h mit Proben bei 4 ° c gelagert pausiert werden</li>
</ol>(4) flow Cytometry Färbung und Analyse
<ol><li>
Zentrifuge Proben bei 400 X g für 5 min bei 4 ° C.
	<ol>
<li>Um unspezifische Antikörperbindung zu reduzieren, zu verdünnen, 1: 100 Anti-CD16/CD32 und Monocyte-Blocker (01:20) (siehe Tabelle der Materialien) Bilanzierung von 50 µL FACS pro Probe. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.</li>
		<li>Bereiten Sie den Antikörper-Verdünnung (1: 250 für jeden Antikörper) entfielen 50 µL FACS pro Probe. Hinweis: Ein Lebensfähigkeit Farbstoff kann in der Antikörper cocktail aufgenommen werden, um abgestorbene Zellen auszuschließen. Alternativ kann die geringe Größe Ausschluss durch Flow-Analyse verwendet (Abbildung 1C und D).</li>
		<li>Ohne Waschen, fügen Sie 50 µL Antikörper-master-Mix zu jeder Probe und mischen.</li>
		<li>Inkubieren Sie Proben bei 4 ° C für 30 Minuten im Dunkeln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jede Probe zu waschen und Zentrifugieren Sie Proben bei 400 X g für 5 min bei 4 ° c fügen Sie 600 µL FACS hinzu</li>
	<li>Aspirieren Sie überstand und aufzuwirbeln Sie Pellet in 300 µL FACS. Halten Sie Proben bei 4 ° C im Dunkeln. Hinweis: Einige Lebensfähigkeit Farbstoffe, wie z. B. DAPI, erfordern Färbung innerhalb von 10 min vor dem Ausführen der Durchflusszytometrie.</li>
	<li>Analysieren von Durchflusszytometrie (siehe Abbildungen 1 und 2) innerhalb der nächsten 3 h. Wenn eine längere Zeit erforderlich, kurzfristigen Fixierung mit einer niedrigen Konzentration Paraformaldehyd ist (0,5 – 1 % mit PBS-Puffer) wird empfohlen, die Färbung zu erhalten. Hinweis: Es wird empfohlen, um Proben durch ein 40 µm Zelle Sieb vor initiieren Flow Cytometry Analyse zu filtern, zur Vermeidung von Verstopfung der Fluidik das Durchflusszytometer.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis.">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotective+function+of+cardiac+macrophages.">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li><li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD103(+)+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis.">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li><li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells.">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+migration+of+effector+CD8++T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung.">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li><li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+CD103++dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha++conventional+dendritic+cells.">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Myokardiale Entzündung oder Herzmuskelentzündung (Myokarditis), ist ein Merkmal der meisten Herz-Kreislauf-Krankheiten. Der Herzmuskel ist jedoch nicht frei von eigener immun Komponenten in Krankheitszuständen. Im Steady-State viele Immunzellen befinden sich im Myokard und spielen die wesentliche Rolle der Wartung und Schutz. Die Charakterisierung dieser vielfältigen Populationen von Zellen wäre nicht möglich ohne Methoden wie dem präsentiert in diesem Protokoll gewesen.
Eine Kombination aus mechanischen und enzymatische Verdauung von Myokard erlaubt die Isolation einer einzelnen Zelle Suspension, die in Kombination mit anderen Methoden der Analyse, wie Flow Cytometry oder Immunomagnetic Wulst Isolation verwendet werden können. Einige Überlegungen in Bezug auf das vorliegende Verfahren müssen berücksichtigt werden. Zuerst alle unsere Analysen beziehen sich auf die Bevölkerung im Myokard; Wir schließen die Vorhöfe aus unserer Analyse sind spezialisierte Gewebe mit seinen eigenen Besonderheiten. Zweitens werden die Beträge von Enzymen verwendet als Leistungseinheiten, helfen bei der Einrichtung der Verdauung mit Hilfe von Enzymen aus anderen Quellen angegeben. Empirisch-Optimierung Die Endkonzentration von Enzymen und die Zeit der Verdauung ist jedoch dringend empfohlen, da Beschränkung Enzym die Zellausbeute deutlich reduzieren kann und zu viel Verdauung kann drastische Auswirkungen auf Rentabilität. Drittens die optionale Schritt mit intravaskulären Verwaltung der beschriftete Antikörper empfiehlt sich besonders bei ungewöhnliche Populationen in der normalen Myokard (z. B. Lymphozyten, Monozyten und neutrophile)2 oder unter Umständen zu studieren Wann Zahlen der Bevölkerung im Blut können sich ändern (Monocytosis, Granulocytosis oder Lymphozytose) die geben eines falschen Eindruck der Veränderungen in den Herzmuskel, die mit dieser Methode oder alternativ die Mikroskopie bestätigt werden müssen. Allerdings ist dieser Schritt von begrenztem Nutzen, bei der Analyse von Makrophagen oder Reife DCs, da diese Zellen nur selten in erheblichen Mengen im Blut (Abbildung 2D) befinden. Es ist wichtig, die Menge der Antikörper verabreicht zu optimieren und die Inkubationszeit vor Einbußen bei der Maus als langfristige Inkubation können für einige Antikörper-Diffusion in das Herz, besonders in einem entzündeten Herzmuskel. Zu guter Letzt ist es sehr wichtig, sorgfältig in der Isolation des Herzens, Beseitigung der Reste der großen Arterien, Venen oder jedes andere Gewebe wie die Lunge. Diese Verunreinigung Gewebe erhöhte hoch Zahlen von Immunzellen, die leicht die myokardialen indigenen Bevölkerungsgruppen Maske können.
Es ist sehr wichtig, Ausschluss von abgestorbenen Zellen durchzuführen, ob Lebensfähigkeit Farbstoffe verwenden oder durch geringe Größe Ausschluss während Flow Cytometry-Analyse, Verdauung (oder Gewebeschäden in Krankheitsmodellen) kann dazu führen, dass eine relativ große Menge von abgestorbenen Zellen. Wir haben die Effizienz des Toten Zelle Ausgrenzung durch Größe und eine Rentabilität Zeichennutzung (Abbildung 1B und D), gegenüber demonstrieren ihre nahe Äquivalenz. Wichtig ist, kann nicht Größe Ausschluss nach Fixierung und Permeabilisierung verwendet werden, da dieses Verfahren senkt die Zellengröße.
Obwohl Autofluoreszenz selten ein Problem, kardiale Makrophagen mit Durchflusszytometrie zu identifizieren ist, dies noch Wichtigeres stellt ein Problem dar bei dem Versuch, die Expression von einige Marker, vor allem mit Fluorochromes begeistert von hoher Energie (charakterisieren kürzere) Lichtwellenlängen (350 – 500 nm). In diesen Experimenten ist es dringend empfohlen, Isotype Steuerelemente verwenden, vermeiden die blau-violetten Laser (Fluorescein-Herstellung, Phycoerythrin, Pacific Blue/brillant violett 421) und verwenden Fluorochromes mit Emissionen über 600 nm, wie z. B. Allophycocyanin.
Die Verwendung von Protokollen wie die enthaltenen werden immer wichtiger, da eine zunehmende Menge an Literatur ist die Rolle der Intensität und Art der Entzündung bei der Bewertung und Charakterisierung der Ergebnisse des Herz-Kreislauf-Krankheit zu identifizieren. Diese Methode ermöglicht höhere Zelle Charakterisierung als Histologie. Zum Beispiel die Verwendung der Linie Ablaufverfolgung für die Identifizierung von ontogenically verschiedene Teilmengen von Makrophagen mit ihren unterschiedlichen programmierten Funktionen2erlaubt. In ähnlicher Weise kann diese Methode verwendet, um die T-Zell-Reaktionen während einer myokardialen Entzündung zu studieren und mit ex-Vivo Stimulation zur Studie T-Zell Polarisation8kombiniert werden.

Verschiedene Formen der myokardialen Stress oder Verletzungen, einschließlich ischämische (Ischämie Reperfusion oder Myokardinfarkt) und nicht-ischämische (Hypertonie oder Myokarditis), fördern die Einstellung von Entzündungszellen mit reparative und schützend, sondern auch pathogenen Eigenschaften. Bereits im Jahr 1891, beschrieben Romberg erstmals das Vorhandensein von zellulären Infiltrate im Herzmuskel von Patienten mit Typhus und Scharlach1. Jedoch erforderlich der Detailstudie des kardialen Immunzellen die Entwicklung von fortgeschrittenen Immunphänotypisierung Techniken. Infolgedessen haben wir erst vor kurzem begonnen zu verstehen, dass eine vielfältige Bevölkerung von Immunzellen mit notwendigen Wartungs-Rollen während der Steady-State innerhalb der Herzmuskel befindet.
Histologie wurde und immer noch ist, die am häufigsten verwendete Methode, kardiale Immunzellen während einer Entzündung zu charakterisieren. Während Histologie ein wertvolles diagnostisches Instrument darstellt, hat seine Verwendung in der Studie von kardialen Immunzellen jedoch wichtige Einschränkungen. Die Immunzellen mit Wohnsitz im Myokard stellen einen sehr kleinen Teil der gesamten Zellen und sind mehr oder weniger gleichmäßig verteilt in einem verhältnismäßig großen Raum. Ähnlich, zeigen verschiedene Formen der kardialen Entzündung, wie virale Myokarditis, fokale Muster der Entzündung. Dies bedeutet, dass die genaue Analyse des Immunsystems des Herzens erfordern oft höhere Grade der histologischen Probenahme, Erhöhung der Kosten um Verzerrungen zu reduzieren. Darüber hinaus bietet die Histologie eine sehr begrenzte Menge von brauchbaren Informationen in Zelle Identifikation (z.B. Anzahl der Parameter). Mit einer ständig wachsenden Zahl der Zelle Teilmengen, die mehrere Ausdruck Marker (einschließlich oberflächenmarker, Transkriptionsfaktoren oder abgesondert Moleküle) erfordert, hat sich Durchflusszytometrie als das mächtigste Werkzeug für die Immunphänotypisierung etabliert, aufgrund der Low-Cost und hohem Durchsatz.
Die Immunphänotypisierung Techniken richtet sich eng an der Entwicklung von effizienten Verdauung-Protokolle, die für einzelne Zellen Analyse einer großen Anzahl von Zellen erlaubt. Die Entwicklung der ausführliche Protokolle der Zelle Extraktion eröffnet ein neues Fenster der Möglichkeiten in der Studie von kardialen Immunologie. Durch die Kombination von Verdauung, Durchflusszytometrie und Transkriptom wurden die großen Populationen von Makrophagen und dendritischen Zellen, die ihren Wohnsitz im Herzen zeichnet sich2,3. Die am häufigsten vorkommende Bevölkerung von kardialen Immunzellen im Steady-State sind CD64++ MerTK Makrophagen, die weiter unterteilt werden können, basierend auf ihren Ausdruck CCR2 oder CD11c2. CCR2+ Makrophagen stammen aus Erwachsenen Knochenmark Hämatopoese, während die Mehrheit des CCR2– Makrophagen, die hohe oder niedrige Niveaus des MHC-II zum Ausdruck bringen können, sind vor allem pränatalen Ursprungs. Makrophagen führen Sie wichtige Funktionen wie Reparatur4 und Entfernung von Schmutz5 bei Verletzungen oder elektrische Verbindungstechnik6 im Steady-State zu unterstützen. Während verschiedene Formen von Entzündungen ein wichtige Zustrom von Ly6CHallo MHC-IIlo CD64Int Monozyten auftreten, zu unterscheiden, die später in Ly6CHallo CCR2+ Makrophagen2,7 . Eine deutlich kleinere, aber wichtige Population von Zellen, die ihren Wohnsitz im Myokard von gesunden Personen besteht aus dendritischen Zellen8,9. Die zwei großen Teilmengen von kardialen herkömmlichen DCs (cDCs) wurden vor kurzem charakterisiert: cDC1 (CD103+ DCs) und cDC2 (CD11b+ DCs). DCs eine wichtige Rolle in der Verteidigung gegen Infektion8 aber auch Selbstverletzung während einer Entzündung, besonders bei Myokardinfarkt9fördern können.
Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Isolierung von lebensfähigen kardiale Immunzellen aus Maus Myokard. Die Methode kombiniert mechanische und enzymatische Verdauung mit Zelle-Sieb Filtration um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten, die analysiert oder durch Flow Cytometry sortieren oder magnetischer Wulst Bereicherung weiter gereinigt werden können. Genaue Messungen der extravascular Herzmuskelzellen erfordern kardialen Durchblutung um mögliche Verunreinigungen aus dem Blutkreislauf der kardiologische Microvasculature zu entfernen. Darüber hinaus präsentieren wir Ihnen einen optionalen Schritt des intravaskulären Kennzeichnung von Immunzellen, die verwendet werden, um weitere Herzmuskelzellen intravaskulären Verunreinigungen, basierend auf der Galkina Et Al. Protokoll10unterscheiden. Schließlich präsentieren wir eine grundlegende Flow Cytometry Analyse Ermittlung die wichtigsten Subpopulationen von Makrophagen und cDC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:340px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:123px;">Wisent</td>
			<td style="width:185px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:167px;">1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-511-CL</td>
			<td>1x HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum filter , 0.2 &#181;m Filtropur V50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">28G 1/2 1 cc insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">60 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td>1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td>from Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase type I-S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase-I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513</td>
			<td>from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell strainer, 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128025</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC anti-mouse CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121414</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117334</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PE anti-mouse Ly-6G</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse I-Ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116422</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139315</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103113</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>1:40 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>426101</td>
			<td>1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo V10</td>
			<td>TreeStar Inc</td>
			<td></td>
			<td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse: Batf3-/-</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX: 013755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of extravascular immune cells of the heart

Das Immunsystem ist ein wesentlicher Bestandteil eines gesunden Herzens. Der Herzmuskel ist Heimat einer reichen Bevölkerung von verschiedenen Immunzellen Teilmengen mit funktionaler Aufteilung bei Steady-State und bei verschiedenen Formen von Entzündungen. Bis vor kurzem das Studium der Immunzellen im Herzen erforderte den Einsatz der Mikroskopie oder schlecht entwickelte Verdauung Protokolle, genügend Sensibilität während einer schweren Entzündung aber konnten nicht sicher identifizieren kleine-aber wichtige-Populationen von Zellen im Steady-State. Hier diskutieren wir eine einfache Methode kombinieren enzymatische (Kollagenase, Hyaluronidase und DNAse) und mechanische Verdauung der murinen Herzen vorangestellt intravaskulärer Verabreichung von eindringmittel radioaktiv markierten Antikörper gegen kleine unterscheiden aber unvermeidbar intravaskulären Zelle Verunreinigungen. Diese Methode erzeugt eine Aussetzung der isolierten lebensfähige Zellen, die durch Durchflusszytometrie zur Identifikation, Phänotypisierung und Quantifizierung analysiert oder weiter gereinigt mit Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung oder magnetischer Wulst Trennung für werden können transkriptionelle Analyse oder in-vitro- Studien. Wir sind ein Beispiel für eine schrittweise durchflusszytometrischen Analyse der wichtigsten Makrophagen und dendritischen Zellpopulationen des Herzens zu unterscheiden. Für eine mittlere Größe Experiment (10 Herzen) erfordert der Abschluss des Verfahrens 2 – 3 h.

Bislang wurde keine gute Methode entwickelt, um Immunzellen von anderen Herzmuskelzellen Bestandteilen, wie Kardiomyozyten zu isolieren. Daher erfordert eine Analyse der einzelnen Herzmuskelzellen Suspension durch Durchflusszytometrie Pre Anspritzung mit CD45, die immun Zellpopulationen, gefolgt von Einzelzellen und geringen Größe Ausgrenzung gating (Abb. 1A) zu identifizieren. Alternativ kann eine Lebensfähigkeit Färbung durchgeführt werden, um abgestorbene Zellen auszuschließen. Geringen Größe Ausgrenzung und Lebensfähigkeit Farbstoff Färbung repräsentieren fast gleichwertige Methoden, abgestorbenen Zellen (Abbildung 1B und 1D) auszuschließen. Es wird dringend empfohlen, mit dem Antikörper Färbung bald nach der Verdauung Verfahren vorgehen und immer die Zellsuspension bei 4 ° C, da die Lebensfähigkeit der Zellen zerfallen kann. Dieses Verfahren liefert in der Regel etwa 80 – 90 % der lebensfähigen Immunzellen.
Das Myokard beherbergt eine vielfältige Kolonie von Immunzellen, von denen viele noch ausstehende Identifizierung und Charakterisierung sind. Makrophagen, identifiziert als CD64+ Zellen, sind die wichtigsten immun Bevölkerung des Herzens, 60 – 70 % aller Immunzellen (Abbildung 1C, oben) vertreten. Die Verdauung eines Erwachsenen murinen Herzens ergibt über 3 – 5 x 104 Makrophagen, abhängig von Größe des Herzens. Kardiale Makrophagen können weiter unterteilt werden, basierend auf ihren Ausdruck von CD11c oder CCR2 und ihre Ebenen des MHC-II-2.
Die anderen kardialen immun Subpopulation, die gut gekennzeichnet worden sind konventionellen dendritischen Zellen. Konventionelle DCs sind CD64– Zellen, dass ausdrückliche Mittelstufe, hohes Maß an MHC-II und hohe CD11c (Abbildung 1 C, unten). Diese Zellen können weiter unterteilt werden, basierend auf ihren Ausdruck von CD103 oder CD11b8,9. DCs darstellen eine viel kleineren kardiale Subpopulation im Vergleich zu Makrophagen. Die Verdauung eines Erwachsenen murinen Herzens ergibt sich zwischen 150 und 500 DCs jede Teilmenge.
Durchblutung des Herzens mit kaltem PBS ist unerlässlich beim Identifizieren von immun-Zell-Populationen innerhalb der Herzmuskel. Unvollkommene Perfusion kann jedoch die Beträge des intravaskulären Verunreinigungen in den Proben, führt zu wichtigen Voreingenommenheit, die auf periphere Veränderungen (Blut) stützen kann erhöhen, anstatt Änderungen in der kardialen Infiltrate. In diesen Fällen helfen intravaskulären Verwaltung von Leuchtstofflampen radioaktiv markierten Anti-CD45-Antikörpern, die alle Immunzellen zirkulieren durch Makro- und Microvasculature (Abb. 2A) Etiketten, Herzmuskelzellen aus unterscheiden intravaskulären Verunreinigungen. Abbildung 2 B zeigt ein Beispiel für eine unvollkommen PERFUNDIERTEN Herzen in dem 20 % der Immunzellen intravaskulären Verunreinigungen sind. Wichtig ist, hat dieses Maß an Verschmutzung wenig Einfluss auf Makrophagen und DC-Analyse, da diese Zellen im Blut (Abbildung 2D) selten zu finden sind.
Die Verwendung der Durchflusszytometrie aus einer einzigen Zelle Suspension von Myokard ermöglicht die Studie von der kleinen Subpopulationen des Herzens. Z. B. der Mangel des Transkriptionsfaktors BATF3 nachweislich zu verhindern, dass die Entwicklung der Reifen CD103+ DCs in verschiedenen Geweben11. Um zu studieren, wenn dies auch im Falle der Herzmuskel gilt, wurden einzelne Zellsuspensionen von Herzzellen von 8 – 15 Wochen alten BATF3-defizienten oder Kontrolle wurfgeschwistern (im Hintergrund der C57BL/6) mit Durchflusszytometrie analysiert. Aufgrund der kleinen Bevölkerungsgröße und Anzahl der Marker benötigt, um die DC-Teilmengen zu unterscheiden Histologie konnte nicht genügend Strom für die Analyse, eine definitive Antwort zu erreichen zur Verfügung gestellt haben. Jedoch verwenden Flow Cytometry Analyse vergleichen die Immunzellen des Myokard von Wildtyp-im Vergleich zu einer Batf3- / - Mäuse, ein Mangel an CD103+ DCs kann bestätigt werden, in der letzteren (Abbildung 3A und B). Darüber hinaus haben wir beobachtet, dass BATF3-Mangel nicht wesentlich, die Zusammensetzung der anderen kardialen Populationen (Abbildung 3C und D ändern). Diese Ergebnisse stehen exemplarisch für den Grad der Sensibilität, die durch diese kombinierte Methode der enzymatischen und mechanische Verdauung zu einem einzigen Zellsuspension erreicht werden kann.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58114/58114fig1.jpg"> Abbildung 1 : Strategie für kardiale Makrophagen und DCs gating. Isolierte Herzen von C57BL/6 Mäusen wurden verdaut, wie beschrieben, und einzelne Zellsuspension wurde durch Durchflusszytometrie analysiert. (A) Herbeirufung von CD45 + live Singulett Herzzellen. Mit dem CD45 Kennzeichnung Immunzellen aus den einzelnen Herzmuskelzellen Homogenat bestimmt sehr hohes Maß an nicht-immunen Zellen (z.B. Herzzellen, Endothelzellen und Fibroblasten) umfasst. Dubletten ausschließen, indem Sie Vergleich SSC-H Vs SSC-A gefolgt von FSC-H Vs FSC-A. Hinweis: Alle anderen Vergleich zwischen SSC-A, SSC-H und SSC-W oder FSC-A, FSC-H und FSC-W sind ebenso nützlich. Auswahl von lebenden Zellen kann durchgeführt werden, mit Ausnahme von sehr kleinen Zellen (SSC-H Vs FSC-H Tor). (B) Vergleich der Tote Zelle Ausgrenzung mit Größe Vs Lebensfähigkeit Färbung (DAPI). (C) Strategie zur Identifikation von kardialen Makrophagen Gating (CD11b+ CD64+ Zellen) und DCs (CD64– MHC-IIHallo CD11c+). Kardiale Makrophagen können weiter klassifiziert werden, basierend auf ihrer Expression von MHC-II und CD11c. kardiale DCs können unterteilt werden basierend auf ihren Ausdruck von CD103 oder CD11b. (D) repräsentative Grundstücke DAPI + tote Zellen innerhalb der Makrophagen und DC Fächer nach klein-Ausschluss. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58114/58114fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58114/58114fig2.jpg"> Abbildung 2 : Kennzeichnung von intravaskulären Zellen Kontaminanten. (A) Vergleich der intravaskulären CD45 Kennzeichnung von Blut neutrophile und Ly6CHallo Monozyten in Anti-CD45 Antikörper (rot) behandelt oder nicht behandelt (blau) Mäuse. (B) Kennung des intravaskulären Verunreinigungen in einer kardialen Zubereitung von intravaskulären CD45 Kennzeichnung. (C) repräsentative Fluss Grundstücke der myokardialen und intravaskulären Zellen. (D) repräsentative Grundstücke von markierten Zellen innerhalb der Makrophagen und DC Fächer nach Anti-CD45 i.v. Gabe. Beachten Sie, dass Makrophagen und DCs ausschließlich extravascular sind. Intravaskulären Schadstoffe sind in der Regel Lymphozyten, Monozyten und neutrophile2. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58114/58114fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58114/58114fig3.jpg"> Abbildung 3 : Quantifizierung der kardialen Makrophagen und DCs BATF3-defizienten Mäusen. (A) repräsentative Fluss Grundstücke kardiale DCs in Batf3+ / + und Batf3- / - Mäusen. (B) Quantifizierung der kardialen DCs in Batf3+ / + und Batf3- / - Mäusen. Beachten Sie das Fehlen von CD103+ DCs Batf3- / - Mäusen. (C und D) Quantifizierung der kardialen Makrophagen (MF) in Batf3+ / + und Batf3- / - Mäusen. Fehlerbalken darzustellen SEM rote Symbole repräsentieren einzelne Tiere. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58114/58114fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Isolierung und Identifizierung von Extravascular Immunzellen des Herzens

Dieses Protokoll stellt eine einfache und effiziente Methode, um zu isolieren, Identifikation und Quantifizierung von Immunzellen, die ihren Wohnsitz im Myokard von Mäusen im Steady-State oder Entzündungen. Das Protokoll kombiniert mechanische und enzymatische Verdauung zur Erzeugung einer einzelnen Zelle Suspension, die weiter durch Durchflusszytometrie analysiert werden können.

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

isolation-identification-extravascular-immune-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K Aufrufe.  University Health Network (UHN). Dieses Protokoll stellt eine einfache und effiziente Methode, um zu isolieren, Identifikation und Quantifizierung von Immunzellen, die ihren Wohnsitz im Myokard von Mäusen im Steady-State oder Entzündungen. Das Protokoll kombiniert mechanische und enzymatische Verdauung zur Erzeugung einer einzelnen Zelle Suspension, die weiter durch Durchflusszytometrie analysiert werden können.

Serie: Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Seven Steps to Cells Stellate

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Isolierung von Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Eine Einführung in die parasitischen Wespen<em&gt; Drosophila</em&gt; Und die antiparasitäre Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

Isolation von Fettgewebe Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...