Name: visualizing genetic variants, short targets, and point mutations in the morphological tissue context with an rna in situ hybridization assay
Uploaded: 2018-08-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
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이 연구에 사용 된 인간의 종양 샘플 deidentified 되었고 인간의 연구에 대 한 로컬 윤리 지침에 따라 상용 소스 로부터 획득.
1. 샘플, 장비 및 시 약 준비
<ol><li>
FFPE 샘플 준비
	<ol>
<li>조직<ol>
<li>바로 다음 해 부, 조직 (두께에서 3-4 m m의 블록으로 절단) 10% 중립 버퍼링 포 르 말린 (NBF) 실 온 (RT)에서 16-32 h에 대 한 수정 했다. 참고: 고정 시간 조직 유형 및 크기에 따라 달라 집니다.</li>
			<li>인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1 샘플을 세척 하 고 표준 에탄올 (EtOH) 시리즈를 사용 하 여 탈수 (70 %30-60 분, 80% EtOH 30-60 분, 90% EtOH 30-60 분, 95% EtOH 30-60 분, 3 x 100% EtOH EtOH 30-60 분) 뒤에 크 실 렌.</li>
			<li>6 표준 절차 사용 하 여 파라핀에 샘플을 포함 하 고 초과 파라핀을 제거 하는 데 필요한 파라핀 블록을 잘라. 참고: 블록 크기 조직 샘플 크기에 따라 다르지만 일반적인 크기는 0.75 0.75 인치2 x 또는 더 작은.</li>
		</ol>
</li>
		<li>셀 라인<ol>
<li>수집 하 고 특정 셀 라인에 대 한 권장 방법 셀을 펠 렛.</li>
			<li>회전자에 24 h에 대 한 RT에서 10% 포름알데히드에서 셀을 수정 합니다.</li>
			<li>Prewarmed 처리 젤에서 펠 릿으로 셀 준비 (예., Histogel). 얼음, parafilm의 조각에 젤 셀 펠 릿을 배치 하 여 공고히 펠 릿을 허용 하 고 Submerge 1 x PBS에 젤 셀 펠 릿 2-3 분 동안 앉아 보자.</li>
			<li>탈수 하 고 1.1.1 단계에서 설명한 대로 셀 펠 릿을 포함.</li>
		</ol>
</li>
		<li>섹션 준비<ol>
<li>포함 된 조직/세포는 톰을 사용 하 여 5 ± 1 μ m 섹션으로, 정전 접착제 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 잘라내어 실시간에 그들을 하룻밤 건조 참고: 슬라이드 저장할 수 있습니다 RT에 최대 3 개월 동안 건조에서.</li>
			<li>슬라이드 슬라이드 랙에 배치 하 고 분석 결과 수행 하기 전에 순환 공기 오븐 1 h를 위한 60 ° C에 탑재 된 조직 슬라이드를 구워. 참고: 슬라이드를 사용 하 여 즉시 또는 1 주일 방와 RT에 저장. 장기간된 보관 RNA 저하 될 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
장비 준비
	<ol>
<li>40 ° c 교 잡 오븐을 설정 철저 하 게 젖은 humidifying 종이 습도 제어 쟁반으로 어떤 잔여 dH2오 삽입 종이 제거 하 고 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안 prewarm를 교 잡 오븐 트레이 삽입.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
시 약 준비
	<ol>
<li>크 실 렌의 200 mL와 함께 에이전트 요리를 비운 2를 100%의 200 mL와 함께 두 개의 얼룩 요리를 채우기 EtOH 섹션의 deparaffinization를 위해 사용 될 것입니다.</li>
		<li>10 x 대상 검색 시 약 20 mL를 dH2O의 180 mL을 추가 하 여 상용 1 x 대상 검색 시 약 200ml를 준비 합니다. 기선에 두 슬라이드 홀더를 배치 합니다. 대상 검색 시 약 x 1의 200 mL와 함께 한 슬라이드 홀더를 채워 다른 슬라이드 홀더 dH2오 열 200 mL 증기선을 사용 하 여 종 두 솔루션.</li>
		<li>40 ° c의 60ml를 희석 하 여 1 x 워시 버퍼의 10-20 분 준비 3 L에 대 한 따뜻한 50 x 워시 버퍼 prewarmed dH2O. 2.94 l 50 x 워시 버퍼</li>
		<li>증기 두건에서 dH2o.의 100 mL를 100 mL의 길의 되며 추가 하 여 솔루션 counterstaining 50% 길 되며 준비 증기 두건에서 dH2오의 250 mL를 28-30% 수산화 암모늄의 1.43 mL을 추가 하 여 청소법 시 약 (0.02% (w/v) 암모니아 물)를 준비</li>
		<li>Prewarm 교 잡 조사 전에 10 분 동안 40 ° C에서 대상 프로브와 실시간 증폭 시 약 (앰프 0-6)</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. RNA 제자리에서 교 잡 시험
<ol><li>
Deparaffinization 및 탈수
	<ol>
<li>1.1.3.2 단계에서 설명한 대로 베이킹 후 (선택 사항 중지 포인트 1), 동요와 5 분 동안 크 실 렌에 섹션을 deparaffinize. 다시 5 분 Dehydrate 100%에 대 한 신선한 자일 렌에 deparaffinize 동요, 그리고 신선한 100%에서 다시 반복 2 분 EtOH EtOH 2 분.</li>
		<li>공기 순환 공기 오븐에서 60 ° C에서 5 분에 대 한 슬라이드를 건조 또는 RT에 때까지 완전히 건조 (옵션 중지 포인트 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샘플 전처리
	<ol>
<li>내 인 성 과산화 효소 활동을 풀기 위해 RT에서 10 분에 대 한 준비-사용 수소 과산화물의 ~ 4 방울과 섹션을 품 어. 슬라이드에서 솔루션을 가만히 따르다와 dH2오로 두 번 그들을 씻어합니다</li>
		<li>대상 검색 시 기선에 100 ° C에서 15-30 분의 200 mL와 함께 섹션을 품 어. 참고: 보육 시간 조직 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜에서 대상 검색 종양 샘플을 셀 알 약 15 분 동안 수행 되었다.</li>
		<li>슬라이드에서 솔루션을 가만히 따르다, dH2O와 두 번 린스, 100%에서 찍어 EtOH 3 분을 슬라이드 또는 RT까지 완전히 순환 공기 오븐에서 60 ℃에서 건조에 대 한.</li>
		<li>소수 성 펜, 약 0.75 x 0.75 인치2를 사용 하 여 섹션 주위 소수 배리어를 그립니다. 참고: 그것은 작은 방 벽을 그리는 권장 하지 않습니다. 큰 섹션에 대 한 더 큰 방 벽을 그릴 수 필요 합니다.</li>
		<li>1 분 동안 완전히 말리 던 하룻밤 RT에 배리어를 하자 (옵션 중지 지점 3).</li>
		<li>슬라이드를 슬라이드 홀더에 놓고 습도 제어 트레이에 슬라이드 홀더를 배치 합니다. 각 슬라이드에 효소 III의 ~ 4 방울을 추가 하 고 단백질 소화에 대 한 교 잡 오븐에 40 ° C에서 15-30 분 동안 그들을 품 어. 참고: 보육 시간 조직 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 이 프로토콜에서 효소 소화는 종양 샘플에 대 일 분 및 셀 펠 릿에 대 일 분 수행 되었다.</li>
		<li>슬라이드에서 솔루션을 가만히 따르다와 dH2오로 두 번 그들을 씻어합니다</li>
	</ol>
</li>
	<li>
프로브 교 잡
	<ol>
<li>전체 섹션을 충당 하기 위해 적절 한 준비-사용 프로브 솔루션의 ~ 4 방울을 추가 합니다. 더 큰 섹션을 사용 하는 경우 추가 ~ 5-6 방울.</li>
		<li>교 잡 오븐에 40 ° C에서 2 시간에 대 한 프로브 교배 슬라이드에서 솔루션을 가만히 따르다 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 이 단계에서 세척 절차를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
신호 증폭
	<ol>
<li>30 분 Decant 솔루션에 대 한 교 잡 오븐에 40 ° C에서 슬라이드 당 앰프 0 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에서 2 분에 대 한 1 x 워시 버퍼의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 이 단계에서 세척 절차를 반복 합니다.</li>
		<li>15 분 Decant 솔루션에 대 한 교 잡 오븐에 40 ° C에서 슬라이드 당 앰프 1 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 세척 절차를 반복 합니다.</li>
		<li>30 분 Decant 솔루션에 대 한 교 잡 오븐에 40 ° C에서 슬라이드 당 앰프 2 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 세척 절차를 반복 합니다.</li>
		<li>30 분 Decant 솔루션에 대 한 교 잡 오븐에 40 ° C에서 슬라이드 당 앰프 3 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 세척 절차를 반복 합니다.</li>
		<li>15 분 Decant 솔루션에 대 한 교 잡 오븐에 40 ° C에서 슬라이드 당 앰프 4 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 세척 절차를 반복 합니다.</li>
		<li>30 분 Decant 솔루션에 대 한 실시간에 슬라이드 당 앰프 5 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 세척 절차를 반복 합니다.</li>
		<li>15 분 Decant 솔루션에 대 한 실시간에 슬라이드 당 앰프 6 ~ 4 방울과 섹션을 품 어 하 고 가끔 동요와 RT에 2 분 동안 세척 버퍼 x 1의 200 mL에 슬라이드를 씻어. 세척 절차를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
신호 검출
	<ol>
<li>솔루션 작업 빠른 레드 염료를 준비 합니다. 0.75 x 0.75 인치2 배리어와 하나의 슬라이드에 대 한 추가 빠른 레드 B 염료의 2 μ 빠른의 120 μ 튜브와 잘 혼합에 레드-A. 참고: 소수 성 장벽 및 슬라이드 수의 크기에 따라 빠른 레드 작업 솔루션의 볼륨 달라 집니다.</li>
		<li>슬라이드에서 과잉 액체를 가만히 따르다와 슬라이드 솔루션 작업 빠른 레드 염료를 추가 합니다. 빛에 노출을 피하기 위해 커버와 함께 트레이에 RT에서 10 분에 대 한 슬라이드를 품 어. 참고: 빠른 작업 준비, 5 분 이내 솔루션 레드를 사용 하 고 직접적인 햇빛 또는 UV 빛에 노출 하지 마십시오.</li>
		<li>레드 빠른 솔루션을 가만히 따르다와 린스 수돗물으로 두 번 슬라이드. 슬라이드 슬라이드 선반에 다시 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Counterstaining
	<ol>
<li>Counterstain 실시간 세척에 2 분 50% 길 되며 솔루션 조직 섹션 수돗물으로 슬라이드 하 고 반복이 여러 번 슬라이드는 분명, 섹션 보라색 남아 때까지. 0.02% 암모니아 물 청소법으로 슬라이드를 찍어 (2-3 번 찍어). 암모니아 물 수돗물으로 교체 하 고 세척 슬라이드 3-5 시간.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
슬라이드 장착
	<ol>
<li>15 분 동안 60 ° C에 또는 RT까지 완전히 공기 순환 오븐에서 슬라이드 건조 건조. 각 섹션에 각 슬라이드 및 장소 coverslips에 장착 시 약 1-2 방울을 놓습니다. 공기 방울의 모든 트래핑을 하지 마십시오. 공기 건조 5 분 이상에 대 한 슬라이드. 참고: 빠른 레드 기판은 알코올에 민감한. 알코올에 슬라이드를 탈수 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
시각화
	<ol>
<li>표준 명시 야 현미경 슬라이드를 관찰 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bolha, L., Ravnik-Glava&#269;, M., Glava&#269;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs:+Biogenesis,+Function,+and+a+Role+as+Possible+Cancer+Biomarkers.">Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers.</a> International Journal of Genomics. 2017, 6218353 (2017).</li><li>Yamada, A., Yu, P., Lin, W., Okugawa, Y., Boland, C. R., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RNA-Sequencing+approach+for+the+identification+of+novel+long+non-coding+RNA+biomarkers+in+colorectal+cancer.">A RNA-Sequencing approach for the identification of novel long non-coding RNA biomarkers in colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 8 (1), 575 (2018).</li><li>Erben, L., He, M. 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모든 저자는 고급 셀 진단, 주식 회사에 의해 고용 되어

이 보고서에서 소설 틱 분석 결과 프로토콜 및 응용 세부 사항에서 토론 되었다. 분석 결과 exon 접합, 짧은 대상과 높은 동종 시퀀스 및 조직 컨텍스트에서 점 돌연변이의 직접적인 시각화 수 있습니다. 분석 결과 RNAscope 기술5 기반 이며 따라서 단일 분자 검출 가능 합니다. 그러나, 때문에 고급 증폭 시스템 신호 감지할 수 있습니다 조금 한 더블 Z 쌍이 들어 있는 프로브 또는 그냥 50 뉴클레오티드의 대상 서식 파일 길이. 프로브 길이에서 단일 더블 Z로 짧은 있을 수 있습니다, 때문에 exon 접합, 짧은 대상과 높은 동종 시퀀스, 점 돌연변이 (표 1)의 검출에 대 한 수 있습니다.
분석 결과의 성공적인 성능에 대 한 여러 기술 권장 있다. 첫째, 조직 16-32 h10에 대 한 상 온에서 신선한 10% 중립 버퍼링 말린 (NBF)에 고정 되어야 한다. Underfixation (< 16 h) 또는 overfixation (> 32 h) 분석 결과의 성능에 악영향을 줄 것 이다 고 추가 최적화 필요할 수 있습니다. 둘째, 강력한 프로브 교 잡 및 신호 증폭에 필요한 온도 습도의 최적 제어를 보장 하기 위해 처리 시스템 및 교 잡 오븐 슬라이드 사용 해야 프로토콜 단계 5 2.3 (protease 전처리, 프로브 교 잡, 신호 증폭, 및 신호 감지). 셋째, 초과 잔여 버퍼 프로토콜을 통해 각 단계 전에 제대로 decanted (하지만 너무 많은 조직 섹션 건조 되도록) 해야 합니다. 슬라이드 밖으로 건조, 중요 한 일반적인 신호 개발할 것입니다. 넷째, 조직의 종류에 따라 전처리 최적화 할 수 있습니다. 잘못 된 프로 테아 제를 사용 하 여 또는 시간의 차선의 길이 대 한 발생할 수 있는 아래-또는 오버-digestion 그리고 신호에 부정적인 영향을 미칠 것 이다. 마지막으로, 그것은 항상 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 테스트 프로브와 함께 실행 하는 것이 중요입니다. 네거티브 제어 프로브는 샘플에서 RNA 품질을 테스트 조사 결과 해석에 대 한 최적의 그 배경 신호, 그리고 긍정적인 통제 조사 분석 결과 올바르게 완료 되었습니다 확인 합니다. 경우의 긍정적인 제어 프로브 신호 샘플에서 RNA 품질 높습니다 차선 및 신호 테스트 프로브 볼 수 없습니다 수 있습니다.
수동 분석 결과 이외에 자동화 된 stainers에 분석 결과 수행 하는 능력은 또한 시연된 (그림 6). 이 자동화 된 분 분석 결과 수익률 높은 신호 대 잡음 비율 및 표 1;와 같이 동일한 응용 프로그램에 대 한 적용 그러나, 자동화 된 분석 결과의 혜택 분석 결과 조건, 간 사용자 가변성 및 실습 시간의 최소화의 표준화를 포함 하 고 신뢰할 수 있는 방식으로 조직 샘플의 높은 처리량 검열에 대 한 수당.
Immunohistochemistry (IHC)와 qRT-PCR FFPE 임상 표본에서 결합 이체 (특히 EGFRvIII)의 검출에 대 한 허용, 이러한 기술은 필요한 특이성 부족 수 고는 결합의 공간 해상도에 대 한 통찰력을 제공 하지 않습니다. 변형 식, 각각11,12. 이 프로토콜에 분석 결과의 주요 장점은 형태학 상 조직 컨텍스트를 유지 하면서 스플라이스 연결의 그것의 높게 과민 하 고 특정 시각화 이다. 여기, 분석 결과 능력을 정확 하 게 METΔ14, EGFRvIII 등 여러 스플라이스 변종에 대 한 독특한 exon 접합 대상 시연 (그림 3과 6) 했다. 또한, 분석 결과 전립선 암, 뇌, ErbB4의 여러 개의 isoforms 및 원형 RNA Cdr1as 마우스 뇌3,,1314의 녹아웃의 확인 스플라이스 변종 아칸소-v 7을 감지 하 보였다.
이 분 분석 결과 의해 짧은 대상 시퀀스 검출 CDR3 시퀀스 Jurkat 세포 (그림 3)에서 파생 된의 탐지에 의해 증명으로 짧은 길이, 50 뉴클레오티드 RNA 시퀀스의 시각화에 대 한 수 있습니다. 분석 결과 또한 Revêchon 외와 같이 매우 다른 가족 구성원 또는 종, 동종은 유전자 시퀀스를 검색할 수 있습니다., 누가 마우스 피하 흰색 adipose 조직15에서 표현 하는 인간의 progerin를 검출 하기 위하여 짧은 대상 분석 결과 사용. 또한, 작은 nucleolar RNA (snoRNA), CRISPR 중재 하는 유전자, 편집과 전조 예측에 관한 발견 현장에 짧은 대상 분석 결과 함께 될 수 있습니다. 더 최근에, 푸 외 IHC 표현 사전-미르 mir125b16망막에 정확한 셀을 식별 하기 위해이 분 분석 결과 결합.
종양에 프로 파일링 하는 돌연변이 종양의 진행을 공부 하 고 표적으로 한 치료를 개발 중요 합니다. 돌연변이 프로 파일링 하는 것은 높은 처리량 시퀀싱을 통해 달성 될 수 있다,이 기술은 intratumoral 이종 또는 링크 유전 변경 세포 형태학17,18로 다루는 완전히 수 없습니다. 점 돌연변이이 분 분석 결과 사용 하 여 검색 셀 라인 (그림 5)에서 EGFR L858R와 KRA G12A 단일 염기 변이의 탐지에 의해 검증으로 단일 기본 해상도에서 RNA 대상 시퀀스의 구별에 대 한 수 있습니다. 또한, 베이커 외. 대 장 암18에서 BRAF, KRA, 및 PIK3CA oncogenes에 여러 돌연변이 대상으로 점 돌연변이 분석 결과 사용 합니다. 그들은 식별 하 고 공간적으로 종양 세포, 궁극적으로 그들은 내 종양이 질에 어떻게 공헌 하는지 보여주는의 드문 돌연변이 subclones를 지도 했다.
요약 하자면, 전문화 된 RNA 분 분석 결과 개발 되었습니다. 이 방법론은 스플라이스 이체, 짧은 시퀀스, 그리고 제자리에변이의 탐지에 대 한 수 있습니다. 그것은 민감한, 정량, 구체적이 고 적응력이 성능 모두 수동 방법으로 자동화 된 stainers 에입니다.

Microarrays, 다음-gen RNA 시퀀싱 (RNAseq) 등 높은 처리량 transcriptomic 기술 등 다양 한 질병에 대 한 진단, 예 후, 그리고 예측 임상 가치와 RNA 마커의 발견 향상 기 하 급수적으로 암1,2. 이러한 바이오 마커의 정밀 의학에서의 사용을, 높은 있다 RNA 생체 조직의 컨텍스트 내에서 임상 샘플을 측정할 수 있는 표준화 된 하 고 강력한 기술에 대 한 필요. 널리 설립 RNAseq 등 양적 RT-PCR 분석 실험 갈기 바인딩 가능 하 게 매우 민감한 유전자 표현, 하는 동안 필요한 조직 균질 및 RNA 격리 의미 vivo에서 세포 형 특이성의 손실 및 형태학 정보3. 기존의 현장에서 RNA 검출 방법론 부족 감도 특이성 희귀 또는 낮은 표현 RNA 생체 조직 컨텍스트4내에서 안정적으로 측정 하는 데 필요한.
상업 현장에서 교 잡 (ISH) 분석 결과 (예., RNAscope 분석 결과)은 이러한 태 클은 한 기술 도전과 300 보다 큰 단일 RNA 분자의 높게 과민 하 고 특정 시각화를 해줍니다 컨텍스트 내에서 조직 형태학의 뉴클레오티드 이러한 유형의 분석 결과 약 6-20 더블 Z 프로브 쌍 함께 고급 하이브리드 기반 신호 증폭5의 독특한 oligonucleotide 조사 디자인을 사용 합니다.
이 연구는 특수 RNA 분 분석 결과를, BaseScope, 짧은 단일 뉴클레오티드 해상도 50 뉴클레오티드 RNA 대상 시퀀스를 검색할 수 있는 이전에 디자인 상업 기술 보완에 대해 설명 합니다. 이 분석 결과 transcriptome의 복잡 한 복잡성을 해결 하 고 exon 접합, 짧은 대상 시퀀스, 그리고 조금 한 더블 Z 프로브 쌍을 사용 하 여 조직 컨텍스트 (표 1)에서 점 돌연변이의 정확한 탐지를 위해 적용 가능 하다. 이 보고서는 완전 한 분석 결과 프로토콜과 결합 이체, T 세포 수용 체 클론 CDR3 시퀀스의 검출에 사용 및 고 FFPE에 단일 염기 돌연변이 세포 선 및 종양 조직.

<table><tbody><tr><td>HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V)</td><td>ACD</td><td>310010 or 310013 (HybEZ&amp;trade;), 321710 or 321720 (HybEZ&amp;trade; II)</td><td></td></tr><tr><td>HybEZ Humidity Control Tray (with lid)</td><td>ACD</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017</td><td>ACD</td><td>310017</td><td></td></tr><tr><td>HybEZ Humidifying Paper</td><td>ACD</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required)&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratory&amp;nbsp;</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Slides (required)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>10% neutral-buffered formalin (NBF)&amp;nbsp;</td><td>MLS</td><td>/</td><td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. 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visualizing genetic variants, short targets, and point mutations in the morphological tissue context with an rna in situ hybridization assay

정밀 의학 생체의 정확한 탐지에 매우 의존 때문에, RNA 생체에서 현장에서 임상 표본에서 측정 표준화 하 고 강력한 기술 위한 증가 필요가 있다. 갈기 바인딩 분석 RNAseq 같은 양적 RT-PCR 가능 하 게 매우 민감한 유전자 표현 하는 동안 그들은 또한 RNA 추출 필요 하 고 따라서 형태학 조직 컨텍스트 내에서 귀중 한 식 분석을 방지 합니다. 현장에서 교 잡 (ISH) 분석 결과 여기에 설명 된 짧은 단일 뉴클레오티드 해상도 단일 세포 수준에서 50 뉴클레오티드 RNA 대상 시퀀스를 검색할 수 있습니다. 이 분석 결과 이전 개발된 상업 분석 결과를 보완 하 고 스플라이스 변종, 짧은 목표와 조직 내의 점 돌연변이의 과민 하 고 특정 위치에서 검색을 수 있습니다. 이 프로토콜에서 프로브 2 개의 임상으로 중요 한 결합 이체, EGFRvIII 및 METΔ14에 대 한 독특한 exon 접합을 대상으로 설계 되었다. 짧은 대상 시퀀스의 탐지는 T 세포 수용 체 α와 β Jurkat T-셀 라인의 CDR3 시퀀스의 특정 감지에 의해 시연 했다. 자동화 된 얼룩을 사용 하 여 셀 라인에서 EGFR L858R와 KRA G12A 단일 염기 변이의 시각화를 통해 단일 뉴클레오티드 해상도 (점 돌연변이) RNA 대상 시퀀스의 구별에 대 일 분 분석 결과의 유틸리티는 또한 표시 플랫폼입니다. 요약 하자면, 프로토콜 결합 이체, 짧은 시퀀스, 그리고 돌연변이 제자리에 수동 성능에 대 한 자동화 된 stainers에의 탐지를 가능 하 게 전문화 된 RNA 분 분석 결과를 보여줍니다.

현장에서 교 잡 시험 워크플로: 흐름과 그림 1 에 표시 된 4 개의 부분으로 구성 됩니다: permeabilization 셀 이나 조직 대상 검색 및 효소 솔루션, 대상 RNA, 프로브의 교 잡의 신호 증폭, 및 신호의 시각화. 신호 수 있습니다 또한 측정할 수 디지털 이미징 소프트웨어 시스템을 사용 하 여 또는 반 양적으로 셀 당 도트 수에 따라. 그림 2 에 설명 된 수동 절차 또한 완전히 상업적인 자동 염색 시스템에 자동 되었습니다.
Exon 접합 탐지 (EGFRvIII 스플라이스 변형)에 대 한 대표적인 얼룩: EGFRvIII constitutively 활성 종양 신호7로 이어지는 exons 7, 2의 프레임에 게놈 삭제에서 발생 하는 상피 성장 인자 수용 체의 변종 이다 . 분석 결과 FFPE 세포종 (GBM) 종양 샘플에서 EGFRvIII 상태를 식별 하기 위해 사용 되었다. 단일 이중 Z 프로브 중 WT를 검출 하기 위하여 exon 연결 되도록 설계 되었습니다 돌연변이, 또는 두 사본 (그림 3A). EGFRvIII 전용 프로브 스팬 1과 8 (E1/E8) exons의 동안 WT EGFR 프로브 exons 1과 2 (E1/E2) 또는 exons 7과 8 (E7/E8)의 접속점 스팬. 8, 9 (E8/E9) exons의 교차점에 걸쳐 일반적인 프로브도 총 EGFR (WT와 EGFRvIII 증명서)를 검출 하 사용 되었다. 모든 감지기 했다 다음 FFPE GBM 샘플에서 EGFR 상태를 결정 하는 데 사용 됩니다. 그림 3B 에 표시 된 두 개의 대표적인 예는 더 큰 연구에서 촬영 됐다. EGFR 상태는 독립적인 방법, RT-PCR에 의해 확인 되었다. 두 WT 프로브는 두 샘플 WT EGFR (그림 3B) 익스프레스 나타내는 두 샘플에서 신호를 감지. 그러나, 돌연변이 프로브만 EGFRvIII + 샘플,이 샘플은 실제로 EGFRvIII 변종 (그림 3B, 왼쪽된 패널)에 대 한 긍정적인 확인 신호 감지를 보여주었다. 반대로, 돌연변이 프로브 EGFRvIII-샘플 (그림 3B, 오른쪽 패널)에서 신호를 검색 하지 못했습니다. 함께 찍은, 이러한 결과 exon 접합 분석 결과 GBM FFPE 종양 샘플에서 EGFRvIII 상태를 확인할 수 있습니다 보여 줍니다.
짧은 목표를 위해 얼룩이 지기 대표: CDR3, 또는 보완 결정 지역 3, T-세포 수용 체에 높은 변수 도메인입니다. 일반적으로, CDR3 시퀀스는 아주 짧은; 예를 들어 Jurkat T-셀 라인에서 CDR3 α와 β 시퀀스는 길이, 51 및 48 뉴클레오티드 각각 (그림 4A). Jurkat 세포, CDR3 센스 조사에에서 표현 된 특정 CDR 시퀀스를 식별 하 α와 β Jurkat T 세포에 표현 되는 생성 된, 감각 CDR3 조사 이외에 α와 β로 부정적인 제어 프로브. 모든 프로브 다음 분석 결과 함께 준비 하는 FFPE Jurkat 세포에서 테스트 되었습니다. 관찰 되었다 강력한 얼룩 방지 감지 프로브 두 CDR3에 대 한 α 및 β Jurkat 세포에 감지 프로브 반면 감지 더 작은 신호 (그림 4B). 이러한 결과 T 세포 수용 체의 클론에 대 한 매우 다양 하지만 짧은 CDR 시퀀스 간의 분별 짧은 대상 분석 결과 수를 보여 줍니다.
대표 지점 돌연변이 EGFR L858R에 대 한 얼룩: 점 돌연변이 프로브 종양 컨텍스트에서 단일 염기 변이 및 작은 삽입 또는 삭제 (INDELs) 검출 하기 위하여 개발 되었다. 그림 5A 는 제자리에서 점 돌연변이 EGFR L858R의 감지 능력을 보여 줍니다 (2573T > G). 2 프로브 설계 되었습니다: 하나는 L858R 검출 돌연변이 EGFR 시퀀스와 EGFR L858 WT 시퀀스를 감지. 두 프로브 두 FFPE 준비 셀 라인에서 테스트 되었습니다:만 표현 하는 EGFR L858 WT; H2229 그리고는 EGFR L858R 돌연변이 heterozygous H1975. L858R 돌연변이 프로브만 H1975 셀 라인 H2229 셀 라인에만 신호를 감지. 그러나, WT 프로브 두 셀 라인에서 신호를 감지합니다. 마찬가지로, 제자리에서 점 돌연변이 KRA G12A의 탐지를 시각화 그림 5B (35 G > C). 2 프로브 KRA G12A 산 및 KRA G12 WT 시퀀스를 감지 하도록 설계 되었고 HuT78 셀 라인 (이 표현 하는 KRA G12 WT)와 (는 KRA G12A 돌연변이 heterozygous) SW116 셀 라인에서 테스트. KRA G12 WT 프로브 두 셀 라인에서 신호를 감지 하는 동안 KRA G12A 프로브만 SW116 셀 라인에 신호 감지. 함께 찍은, 이러한 데이터는 세포 및 조직 맥락에서 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 검출에서 점 돌연변이 분석 결과의 기술적 능력을 보여 줍니다.
대표 자동 제자리에 분석 결과 대 한 얼룩: 자동화 된 분석 실험 허용 샘플의 더 많은 수 더 안정적으로 실행 되도록 간 사용자 가변성 및 실습 시간을 최소화 하 고 일관 되 게 재현할 결과 생성 합니다. 따라서, 분석 결과의 자동된 버전은 개발 되었다. 이 분석 결과 함께 자동화 된 얼룩이 보여, 스플라이스 변종 METΔ14의 탐지는 시험 되었다. 이 이체는 사전-mRNA 접합, 제정 활성화, 메트로 수용 체8,9의 종양 변환 하는 동안 생략 되 고 메트로 유전자에서 exon 14의 결과. 특히 METΔ14 변종 감지, 2 개의 exon 접합 프로브 설계 되었습니다: exons 13 및 15 (E13/E15) METΔ14 변형 사본을 감지 하의 걸쳐와 exons 14 및 15 (E14/E15) WT 만난 감지 하의 걸쳐 대 본 (그림 6A)입니다. 두 프로브 다음 2 FFPE 준비 셀 라인에서 테스트 되었습니다: METΔ14 변종 표현, H596 및 A549, WT 만난 유전자 표현. 두 프로브 E13/E15 프로브만 H596 세포와만 (그림 6B 와 6 C) A549 세포에서 신호를 감지 E14/E15 프로브에 신호를 감지 상호 배타적 표현 패턴을 보였다. 마지막으로, dapB에 대 한 조사 (그림 6B 와 6 C) 배경 신호를 나타내는 아무 신호를 보여주었다. 전반적으로,이 데이터는 메트로 변형 METΔ14에 현장에서 자동된 BaseScope 분석 결과 활용 하 여 특정 검색을 보여 줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig1.jpg"> 그림 1 : 분석 결과 워크플로. 워크플로 4 주요 단계로 구성 됩니다: 전처리 permeabilize 세포 또는 조직, 대상 RNA, 교 잡 조사를 증폭, 신호 및 명시 또는 형광 현미경 시각화 하 여 탐지 신호. 개별 점 디지털 이미지 분석 플랫폼을 사용 하 여 측정할 수 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58097/58097fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig2.jpg"> 그림 2 : 수동 분석 결과 프로토콜의 그림. 전체 분석 결과 9 h. 전처리 보육 시간에 대하여 조직 전처리 권고에 대 한 사용자 설명서의 부록 A를 참조 하는 것이 좋습니다 그래서 번 조직 유형에 따라 다를 수 있습니다에 완료할 수 있습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58097/58097fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig3.jpg"> 그림 3 : 엑손 접합 탐지의 대표 이미지. (A) 표시 여기는 EGFR WT 및 EGFRvIII 내용은 exon 기구 EGFR WT 또는 EGFRvIII 교차점에 걸쳐져 더블 Z exon 접합 프로브를 묘사 하는 회로도. (B)는 exon 접합 분석 결과 긍정적인 제어 프로브, POLR2A, 및 부정적인 제어 프로브, dapB 뿐만 아니라 (A)에 나열 된 프로브를 사용 하 여 두 FFPE 세포종 샘플에서 수행 되었다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58097/58097fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig4.jpg"> 그림 4 : 짧은 대상의 대표 이미지 시퀀스 검색. (A) 표시 여기는 Jurkat 세포 CDR3 시퀀스. 블랙에 시퀀스 측면에 서 일반적인 순서 이며 빨간색에서 순서는 CDR3α 또는 CDR3β에. 단일 이중 Z 짧은 대상 시퀀스 프로브가이 시퀀스에 대 한 설계 되었습니다. (B) 짧은 대상 분석 결과 Jurkat 세포 (a), 시퀀스를 대상으로 하는 안티 감각 또는 감각 프로브를 사용 하는 FFPE 셀 펠 릿으로 준비에 수행한 그리고 dapB 부정적인 제어로 사용 되었다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58097/58097fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig5.jpg"> 그림 5 : 점 돌연변이 탐지의 대표 이미지. (A) 분석 결과 H2229 세포 (EGFR L858 homozygous)와 H1975 세포 (EGFR L858R 돌연변이 heterozygous) EGFR L858 WT 시퀀스 또는 EGFR L858R를 대상으로 단일 더블 Z 포인트 돌연변이 프로브를 사용 하는 FFPE 셀 펠 릿으로 준비에서 수행 되었다 변이 된 시퀀스입니다. (B) 점 돌연변이 분석 결과 HuT78 셀 (KRA G12A homozygous) 및 SW116 셀 (KRA G12A 돌연변이 heterozygous) KRA G12 WT 시퀀스를 대상으로 하는 단일 더블 Z 포인트 돌연변이 프로브를 사용 하는 FFPE 셀 펠 릿으로 준비에 수행 되었다 또는 KRA G12A 돌연변이 시퀀스입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58097/58097fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58097/58097fig6.jpg"> 그림 6 : 엑손 접합 분석 결과 함께 자동화 된 얼룩의 대표 이미지. (A) 표시 여기 만난 WT 및 METΔ14 성적표와 만난 WT 또는 METΔ14 교차점에 걸쳐져 단일 더블 Z exon 접합 프로브를 묘사 하는 회로도 exon 조직입니다. (B) (C) 자동화 된 exon 접합 분석 결과 부정적인 제어 프로브 dapB 뿐만 아니라 H596 셀 (METΔ14 표현)와 A549 세포 (만난 WT 표현) (A)에 나열 된 프로브를 사용 하는 FFPE 셀 펠 릿으로 준비에 수행 되었다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58097/58097fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Exon 접합</td>
			<td>짧은 시퀀스</td>
			<td>점 돌연변이</td>
		</tr>
<tr>
<td>변형/isoform를 결합</td>
			<td>50 및 300 nt 사이 시퀀스</td>
			<td>점 돌연변이</td>
		</tr>
<tr>
<td>원형 RNA (circRNA)</td>
			<td>높은 동종 시퀀스</td>
			<td>짧은 indel</td>
		</tr>
<tr>
<td>유전자 융해</td>
			<td>TCR 클론 CDR3 시퀀스</td>
			<td>편집 진</td>
		</tr>
<tr>
<td>유전자 녹아웃 (KO)</td>
			<td>사전-미르</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>작은 nucleolar RNA (snoRNA)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>편집 진</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 응용 프로그램은 제자리에서 분석 결과. 이 분석 결과의 응용 프로그램에 대 한 3 주요 종류가 있다: 엑손 접합, 짧은 대상 시퀀스, 그리고 점 돌연변이. 각 열에 나열 된 각 범주에 대 한 몇 가지 특정 응용 프로그램 예입니다.

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Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

여기, 우리는 현장에서 교 잡 분석 결과 시퀀스를 단일 세포 수준에서 단일 뉴클레오티드 해상도 50 뉴클레오티드의 짧은의 과민 하 고 특정 검색을 가능 하 게 설명 합니다. 수동으로 또는 자동으로 수행할 수 있습니다, 분석 결과, 결합 이체, 짧은 시퀀스, 그리고 조직 컨텍스트 내에서 돌연변이의 시각화를 설정할 수 있습니다.

유전자 변형, 짧은 목표, 및 교 잡 시험 현장에서 RNA와 형태학 상 조직 맥락에서 점 돌연변이 시각화

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

visualizing-genetic-variants-short-targets-point-mutations

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

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비디오: Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

연구

유전학

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein and RNA multiplexing by leveraging photo-cleavable oligo-tagged antibodies and probes, respectively. Oligos are cleaved and quantified from specific regions across the tissue to elucidate the underlying biology. Here, the study demonstrates that automated custom antibody visualization protocols can be utilized to guide ROI selection in conjunction with spatial proteomics assays. This specific method did not show acceptable performance with spatial transcriptomics assays. The protocol describes the development of a 3-plex immunofluorescent (IF) assay for marker visualization on an automated platform, using tyramide signal amplification (TSA) to amplify the fluorescent signal from a given protein target and increase the antibody pool to choose from. The visualization protocol was automated using a thoroughly validated 3-plex assay to ensure quality and reproducibility. In addition, the exchange of DAPI for SYTO dyes was evaluated to allow imaging of TSA-based IF assays on the spatial profiling platform. Additionally, we tested the ability of selecting small ROIs using the spatial transcriptomics assay to allow the investigation of highly-specific areas of interest (e.g., areas enriched for a given cell type). ROIs of 50 &#181;m and 300 &#181;m diameter were collected, which corresponds to approximately 15 cells and 100 cells, respectively. Samples were made into libraries and sequenced to investigate the capability to detect signals from small ROIs and profile-specific regions of the tissue. We determined that spatial proteomics technologies highly benefit from automated, standardized protocols to guide ROI selection. While this automated visualization protocol was not compatible with spatial transcriptomics assays, we were able to test and confirm that specific cell populations can successfully be detected even in small ROIs with the standard manual visualization protocol.

Here, we describe a protocol for fine-tuning regions of interest (ROIs) for Spatial Omics technologies to better characterize the tumor microenvironment and identify specific cell populations. For proteomics assays, automated customized protocols can guide ROI selection, while transcriptomics assays can be fine-tuned utilizing ROIs as small as 50 &#181;m.

조직에서 단백질 및 RNA 발현의 공간 프로파일링: 가상 미세 해부를 미세 조정하는 접근 방식

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

암 연구학

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

생화학

인간 골육종 세포에서 Long Non-coding RNA 국소화를 위한 FISH

RNA Fluorescence In Situ Hybridization for Long Non-Coding RNA Localization in Human Osteosarcoma Cells

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition (EMT), migration, infiltration, and autophagy of cancer cells. Localization detection of lncRNAs in cells can provide insight into their functions. By designing the lncRNA-specific antisense chain sequence followed by labeling with fluorescent dyes, RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) can be applied to detect the cellular localization of lncRNAs. Together with the development of microscopy, the RNA FISH techniques now even allow for visualization of the poorly expressed lncRNAs. This method can not only detect the localization of lncRNAs alone, but also detect the colocalization of other RNAs, DNA, or proteins by using double-color or multicolor immunofluorescence. Here, we have included the detailed experimental operation procedure and precautions of RNA FISH by using lncRNA small nucleolar RNA host gene 6 (SNHG6) in human osteosarcoma cells (143B) as an example, to provide a reference for researchers who want to perform RNA FISH experiments, especially lncRNA FISH.

저자 스포트라이트: 골육종 세포에서 lncRNA-SNHG6를 찾기 위한 RNA FISH 

The present protocol describes a method of RNA fluorescence in situ hybridization to localize the lncRNAs in human osteosarcoma cells.

인간 골육종 세포에서 긴 비코딩 RNA 국소화를 위한 RNA Fluorescence In Situ Hybridization

The important roles of long non-coding RNAs (lncRNAs) in cancer have been studied, such as regulating the proliferation, epithelial-mesenchymal transition ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

신경과학

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

생물학

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. Each of these features can be accomplished with in situ hybridization to mRNAs within cells. Here we present a radioactive in situ hybridization method modified from Clayton et al. (1988)1 that has been working successfully in our lab for many years, especially for adult vertebrate brains2-5. The long complementary RNA (cRNA) probes to the target sequence allows for detection of low abundance transcripts6,7. Incorporation of radioactive nucleotides into the cRNA probes allows for further detection sensitivity of low abundance transcripts and quantitative analyses, either by light sensitive x-ray film or emulsion coated over the tissue. These detection methods provide a long-term record of target gene expression. Compared with non-radioactive probe methods, such as DIG-labeling, the radioactive probe hybridization method does not require multiple amplification steps using HRP-antibodies and/or TSA kit to detect low abundance transcripts. Therefore, this method provides a linear relation between signal intensity and targeted mRNA amounts for quantitative analysis. It allows processing 100-200 slides simultaneously. It works well for different developmental stages of embryos. Most developmental studies of gene expression use whole embryos and non-radioactive approaches8,9, in part because embryonic tissue is more fragile than adult tissue, with less cohesion between cells, making it difficult to see boundaries between cell populations with tissue sections. In contrast, our radioactive approach, due to the larger range of sensitivity, is able to obtain higher contrast in resolution of gene expression between tissue regions, making it easier to see boundaries between populations. Using this method, researchers could reveal the possible significance of a newly identified gene, and further predict the function of the gene of interest.

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

This protocol is successfully used to quantitatively detect levels and spatial patterns of mRNA expression in multiple tissue types across vertebrate species. The method can detect low abundance transcripts and allows processing of hundreds of slides simultaneously. We present this protocol using expression profiling of avian embryonic brain formation as an example.

방사성 현장에서</em조직에서 다양한 유전자 발현 패턴을 검출> 하이브리드화

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

유전자 변형, 짧은 목표, 및 교 잡 시험 현장에서 RNA와 형태학 상 조직 맥락에서 점 돌연변이 시각화

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인간 골육종 세포에서 긴 비코딩 RNA 국소화를 위한 RNA Fluorescence In Situ Hybridization

인간 골육종 세포에서 긴 비코딩 RNA 국소화를 위한 RNA Fluorescence In Situ Hybridization

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고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출

식물의 성적 증명서의 정확한 현지화에 대한 원위치 하이브리드화에서

방사성 현장에서 하이브리드화

전체 마운트 RNA 형광