이 작품은 기초 과학 연구소 (IBS-R015-D1)에 의해 그리고 기본적인 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 교육부 (2017R1A6A1A03015642)에 의해 자금에 의해 지원 되었다.

모든 수술 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 성균관 대학에 의해 승인 되었다.
1. 샘플 준비
참고: 오토 클레이 브 동물 처리 하기 전에 모든 수술 기구. 수술에 전념 한 방에 모든 수술 성능을 수행 합니다. 수술 실에서 모든 직원에 의해 불 임 수술 가운과 장갑을 항상 착용 되어야 한다.
<ol><li>
조직의 고정
	<ol>
<li>각 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 4 %paraformaldehyde (PFA) PBS에 가득 두 10 mL 주사기를 준비 합니다.</li>
		<li>7 12 주 된 마우스 (C57BL/6J 이나 어느 성별 어떤 마우스 라인) zoletil와 xylazine (1:1, 20 mg/kg 각) 또는 다른 적합 한 마 취 정권 (예를 들어, 80 mg/kg 케 타 민 고 10 mg/kg의 혼합물의 혼합 투여 하 여 anesthetize xylazine)는 복 주사로.</li>
		<li>마우스에는 마 취 (발가락 핀치-응답 방법 사용)의 수술 평면에 도달 했습니다, 일단가 위 피부와 흉 곽을 절단 하 여 마음을 노출 합니다.</li>
		<li>오른쪽 아 트리 움 분출 혈액과 바늘으로 순차적으로 좌 심 실 통해 PBS와 PFA 솔루션 perfuse 작은 위로 싹 둑 (관류 속도 4 mL/min, 볼륨 = = 각 솔루션에 대 한 10 mL). 참고: 마우스 뻣 뻣 한 경우 프로시저가 성공적으로 완료 됩니다. 눈 연 고 또는 살 균의 사용 절차는 터미널로 필요 하지 않습니다. 고정 절차를 건너뛸 수 있습니다. 그러나,이 단계는 구조적 변형 기계적 조직 손상 등 허 혈 성 axonal 붓기를 최소화 하기 위해 권장 됩니다. 에 대 한 자세한 내용은 조직 고정, 게이지, G. J. 그 외 여러분 에 의해 문서를 참조 10
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
두뇌 슬라이스 준비
	<ol>
<li>복 부 흉부와 복 부를 통해 수술가 위로 마우스를 목을 벨.</li>
		<li>두 피와과 완벽 하 게 노출 된 두개골까지 적당 하 게 작은 위를 사용 하 여 제거 합니다.</li>
		<li>전 뼈를 휴식 하 고 두뇌를 손상 않기로 주의 작은 위를 사용 하 여 후 두 뼈에서 화살 봉합을 따라 두개골을 잘라.</li>
		<li>부드럽게는 두개골 및 dura mater 미세 집게를 사용 하 여 순차적으로 제거 합니다.</li>
		<li>뇌를 조직을 손상 하지 않도록 주의 복용, 부드러운 플라스틱 숟가락을 사용 하 여 압축을 풉니다.</li>
		<li>린스 및 4 ° c.에 30 분 동안 4 %PFA 솔루션에서 추출한 뇌를 담가</li>
		<li>vibratome을 사용 하 여 100-150 µ m 섹션으로 고정된 두뇌를 슬라이스. 참고:에 대 한 자세한 내용은 조직 준비, 참조 문서 Segev 외. 11. 후속 절차, 조직 해야 될 슬라이스 섹션으로는 스페이서의 두께 보다 얇은.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
뇌 조각의 장착
	<ol>
<li>각 조직 조각 1 유리 슬라이드와 2 평방 커버 안경 (22 × 22 × 0.17 m m)를 준비 합니다.</li>
		<li>반으로 잘라 사각형 커버 안경 중 하나 (2 개의 직사각형 조각) 유리 커터를 사용 하 여.</li>
		<li>슈퍼 접착제를 사용 하 여 슬라이드 유리에 등분된 커버 안경의 두에 연결. 참고: 두 개의 등분된 안경 사이 공간 조직 조각의 크기 보다 약간 더 큰 수 한다.</li>
		<li>브러쉬 또는 한 피 펫을 사용 하 여 뇌 슬라이스를 수확 하 고 슬라이드 유리는 공백 사이 조직 하다. 알아서 하지 조직 접어.</li>
		<li>조직 표면에 PBS의 100 μ 분배.</li>
		<li>조직 위에 다른 평방 덮개 유리를 두십시오. 이 단계 동안 공기 방울의 포함을 하지 마십시오.</li>
		<li>후속 이미징 세션 동안 먼지에 의해 PBS의 증발 및 오염을 방지 하기 위해 매니큐어 (또는 또는 적당 한 접착제)를 사용 하 여 덮개 유리 주위 인감. 참고:는 실험이이 단계에서 일시 중지 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 보정
<ol><li>현미경 적어도 1 시간에 전환 하기 전에 레이저의 열 안정화 수 있도록 영상 소스 ( 재료의 표참조). 다음, 소프트웨어 스펙트럼 스캔 ( 재료의 표참조)를 설정 하 고 GUI (그림 3a). 의 정상 취득 버튼을 클릭
</li>
	<li>백색-빛 레이저 (WLL) 및 광 전 증폭 관 관 (PMT) (그림 3a)에 대 한 소프트웨어 셔터를 켭니다.</li>
	<li>획득 모드에서 드롭-다운 목록에 xyΛ 모드 를 선택한 다음 레이저 입력된 모드는 일정 한 힘을 일정 % 에서 자동으로 변경 된다. 자동 SP 움직임의 확인란 선택을 취소 합니다. 다음, 470-670 nm와 4 스펙트럼 스텝 크기 입력된 레이저의 스펙트럼 창 설정 Λ에 nm-여기 람다 스캔 설정 (그림 3b).</li>
	<li>두 번 클릭 하거나 막대를 이동 하면 조정 스펙트럼 범위 (그림 3c) 450-690을 PMT의 스펙트럼 범위를 설정 합니다. 참고:이 스펙트럼 범위 입력 소스의 완전 한 대역폭을 포함 해야 합니다.</li>
	<li>적당 하 게 높은 수 가늠 구멍으로 물 침수 대물 렌즈 선택 (NA > 0.7) AOBS 구성 및 라이브 스캔 버튼을 활성화 하려면 PMT와 레이저 파워에 어떤 가치를 부여 하 고. AOBS 구성 (그림 3)에서 반사를 확인 하 여 광학 경로 전환 합니다.</li>
	<li>참조 미러 마운트 ( 재료의 표참조) 현미경 스테이지. 미러 표면 목표 렌즈에 대 한 직면 한다. 그렇지 않으면 미러 현미경 무대에 넣어 쉽게, 플랫 플레이트 (예: 슬라이드 유리)에 미러 본드.</li>
	<li>거울 표면에 초점 비행기를 정렬할 현미경 단계를 제어 합니다.</li>
	<li>PMT 이득 및 레이저 전력 검출기의 동적 범위를 고려 하 고 조정 하 고 일정 한 힘을 일정 % 에서 레이저 입력된 모드를 변경 합니다. 참고: 일반적으로 PMT 500 (V)의 고 0.1%의 상대 레이저 파워 570에 사용 된다 nm.</li>
	<li>파장 범위에 걸쳐 채도 없음 확인 의사 색상 모드에서 확인 합니다. 채도 관찰 되는 경우 낮은 레이저 파워 (그림 3a).</li>
	<li>람다 검색 인수를 실행 합니다.</li>
	<li>무대에서 미러를 제거 하 고 어두운 참조 (즉, 어두운 오프셋)를 얻기 위하여 샘플 없이 동일한 수집을 반복 합니다.</li>
	<li>Multistacked TIF 형식에 데이터를 저장 합니다.</li>
</ol>3. SpeRe 이미지 수집
<ol><li>탑재 된 조직 현미경 스테이지에 배치 합니다. 대물 렌즈의 초점면에 조직을 맞추려면 대략 눈 조각을 통해 넓은 필드 형광 모드를 사용 합니다.</li>
	<li>라이브 검색 에, 조직에 대 한 관심의 영역에 초점 비행기를 정렬할 현미경 단계 제어할. 커버 슬립에서 배경 잡음을 방지 하려면 유리-조직 인터페이스에서 적어도 15 μ m 깊이의 대상 영역을 선택 합니다.</li>
	<li>취득 단계 2.1-2.10에서에서 설명한 대로 동일한 절차를 사용 하 여 대상 지역에 대 한 스펙트럼 이미지 스택.</li>
	<li>Multistacked TIF 형식에는 조직 및 어두운 오프셋에 대 한 데이터를 저장 합니다. 참고:는 실험이이 단계에서 일시 중지 될 수 있습니다.</li>
</ol>4. 이미지 처리 및 분석
<ol><li>ImageJ에서 참조 거울과 뇌 조직에 대 한 스펙트럼 데이터 (multistacked TIF)를 엽니다.</li>
	<li>열린된 이미지 스택을 ROIs (관심 지역) 선택-참조 거울과 뇌 조직에 대 한 축 삭 섬유의 세그먼트에 대 한 중앙 지역.</li>
	<li>실행 이미지 → 스택 → 선택한 ROIs에 대 한 원시 스펙트럼을 취득 ImageJ 메뉴에서 플롯 z 축 프로필 .</li>
	<li>어두운 오프셋된 데이터, 참조 거울 하 고는 다른 뇌 조직에 대 한에 대 한 하나를 엽니다.</li>
	<li>실행 이미지 → 스택 → 어두운 오프셋에 대 한 스펙트럼을 취득 ImageJ 메뉴에서 플롯 z 축 프로필 .</li>
	<li>복사 및 붙여넣기 옵션을 사용 하 여 모든 인수 스펙트럼을 저장 합니다. 참고: SpeRe 이미징, 꺼짐-축 광학 착오를 최소화 하기 위해 중앙 이미지 필드의 사용은 권장 됩니다. 축 삭 섬유는 구조적으로 그들의 길이 따라 다른 유형의 수 있습니다. 따라서, 작은 축 삭 세그먼트에 ROI를 선택 하면, 일반적으로 부분 볼륨 유물을 최소화 하기 위해 < 5 µ m 것이 좋습니다.</li>
</ol>5. 기준선 보정 및 SpeRe 신호 분석
<ol><li>뇌 조직과 참조 거울의 스펙트럼에서 오프셋된 스펙트럼을 뺍니다.</li>
	<li>스펙트럼의 최대 강도 분할 하 여 각 스펙트럼을 정상화.</li>
	<li>참조 거울의 정규화 된 스펙트럼에 의해 축 삭의 정규화 된 스펙트럼을 분할 하 고 정규화 된 스펙트럼에서 DC 오프셋을 뺍니다.</li>
	<li>피팅 한 정현파를 인수 스펙트럼 wavenumber 주파수 측정 곡선 ( 재료의 표참조), 그리고 다음 복용 상호 여 주기 인수 wavenumber를 변환할.</li>
	<li>그림 4c에서 방정식을 사용 하 여 축 삭 직경 wavenumber 주기를 변환 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+and+low-angle+x-ray+diffraction+studies+of+the+nerve+myelin+sheath.">Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath.</a> Journal of Cell Biology. 3, (1957).</li><li>Blaurock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spaces+between+membrane+bilayers+within+PNS+myelin+as+characterized+by+X-ray+diffraction.">The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction.</a> Brain Research. 210, 383-387 (1981).</li><li>Shim, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).</li><li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+nanoscopy+of+actin+dynamics+in+synapses+deep+inside+living+brain+slices.">STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices.</a> Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).</li><li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy.">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5, 155-157 (2008).</li><li>Peters, A., Sethares, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+there+remyelination+during+aging+of+the+primate+central+nervous+system?.">Is there remyelination during aging of the primate central nervous system?.</a> Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).</li><li>De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+properties+of+the+myelin+sheath.">Anisotropic properties of the myelin sheath.</a> Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+nanoscale+optical+metrology+on+myelinated+axons+in+vivo.">Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 1832 (2017).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> JoVE. (112), e54024 (2016).</li><li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14, 593-599 (2017).</li><li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).</li></ol>

저자 선언 경쟁 금융 관심사: 제이 권 및 M. 최는 특허 출원 중인 기술이이 문서에서 설명의 발명가.

SpeRe는 새로운 라벨 무료 이미징 형식 스펙트럼 간섭계는 처음으로 라이브 myelinated 축 삭에서 나노 정보 제공에 따라 이다. 현재 수집 프로토콜에서 축 삭 직경에 대 한 공간적 해상도 10의 순서의 이다 nm. 또한, SpeRe 크기 순서 낮은 빛 복용량 다른 슈퍼 해상도 microscopies;에 비해 활용 따라서, phototoxicity 및 photobleaching에서 무료입니다. SpeRe myelinated 축 삭의 나노 역학 공부에 대 한 새로운 길을 제공할 것 이다.
여기에 설명 된 프로토콜 acousto-광학 및 포인트 검출기 (즉, PMT)에 의해 중재 스펙트럼 검색 기반으로 합니다. 이 방식은 스펙트럼 이미지 보기의 전체 필드의 획득에 유리 합니다. 그러나, 시간 해상도 일반적으로 우리의 현재 구성 > 15 s 스펙트럼 검사에 의해 제한 됩니다. 대 안으로 서, 작은 보기 필드9의 실시간 관찰 수 있도록 고속 분 광 기를 통합할 수 있습니다. 이 시스템은 PMT는 분 광 기와 화이트 빛 레이저를 추가 하 여 전환 하 여 기존의 confocal 시스템에서 단순히 건설 있습니다. 수집 소프트웨어, 검 류 계 위치는 분 광 기의 실행 동기화 할 필요가 없습니다. 단일 지점 측정의 경우 시간적 해상도 최근 초고속 spectroscopes에 대 한 > 10 kHz를 될 수 있는 분 광 기의 프레임 속도 의해 결정 됩니다. 이 하위 밀리초 시간 해상도 myelinated 축 삭 비보의 생리 적인 역학의 대부분을 관찰에 대 한 충분 해야 합니다. SpeRe 기반으로 빛의 반사; 그러므로, 감지 된 빛 입력된 빛으로 동일한 파장을 있습니다. 형광 스펙트럼 변화 (즉, Stokes shift);를 포함 하는 반면, 따라서, 감지 된 빛은 입력된 빛에서 괴기 하 게 분리할 수 이다. 이 기능은 (에서 같이 그림 4) SpeRe의 동시 취득 및 동일한 견본에 형광에 대 한 도움이 됩니다. 입력된 빛의 흡수는 fluorophore SpeRe 측정에 영향을 미칠 수 있습니다 하지만 일반적인 형광 얼룩에서 흡수 사소 저 (< 1%).
메모의, SpeRe는 제한 된 각도 감지 범위에만 거의 영상 평면에 평행 축 삭을 감지할 수 있다. SpeRe의이 각도 제한 ± 13.5 ° 9입니다. 관심의 특정 방향에 얻기 위해 샘플을 기울이면 수 있습니다. Zebrafish 태아 같은 투명 한 표본, 경우 전체 체적 인수는 견본을 회전 하 여 가능한 수 있습니다. 추가 실용적인 한계는 coverslip 샘플에 강한 백 반사 그림 5;와 같이 높은 배경 신호 생성으로 이어지는 생산 이 표면 지역 피해 야 한다 하는 것이 좋습니다. 가시 광선에 따라 SpeRe는 뇌 조직에서 ~ 20 µ m의 1/e 감쇠 길이가 있다. 일반적인 조직 침투 깊이 대 한 신뢰할 수 있는 스펙트럼 정보 획득 ~ 100 µ m. 깊이 영상으로 제한 가능 이상 입력된 소스를 사용 하는 경우. 결국, SpeRe의 유효성 검사는 회절 제한 된 형광 현미경 검사 법에 비교 하 여 표시 됩니다. 이것은 분명히 하지 되었습니다 나노 정밀도 (그림 4)을 평가 하기 위한 충분 한. 상호 빛-전자 현미경 및 확장 현미경 등 최근 기술, 나노 정권13,14에서 SpeRe를 검사 하는 방법을 제공할 것입니다.

포유류 신 경계에서 수 초 다층된 막 덮개와 축 삭 섬유 enwrapping 여 빠른 신경 전도 및 axonal 무결성 제공 합니다. 그것의 다층된 구조 번갈아 나노 박막-필름 플라즈마 세포 막의 구성의 구성 (~ 5 nm), cytosol (~ 3 nm), 및 세포 외 공간 (~ 7 nm)1,2. 광학 현미경 검사 법, 최근 슈퍼 해상도 현미경을 포함 하 여 광학 회절3,,45로 인해 부족 한 해상도 인해 나노 myelin 역학을 관찰을 위한 적합 하지 않습니다. 전자 현미경은 myelin nanostructure의 좋은 정보를 제공할 수 있습니다, 그것은 화학 고정 및 ultrasectioning6,7 매우 침략 샘플 준비 인 생활 생물 학적 시스템와 호환 . 최근까지, 거기 되었습니다 아무 기술 나노 역학 myelinated 축 삭 제자리의 관찰에 적용.
Schain 외. 이전 myelinated 축 삭 다채로운 빛 반사율8전시 보고. 채택 하 여 반사 된 빛의 분 광 분석, 우리는 새로운 이미징 형식 스펙트럼 셋 (SpeRe)9라는 myelinated 축 삭의 나노 이미징에 대 한 고안 했다. SpeRe 박막 간섭 myelin 칼 집 (그림 1)의 다층된 구조에서 발생을 기반으로 합니다. 다양 한 축 삭에 광학 시뮬레이션에 의해 우리는 밝혀 그 반사율 스펙트럼 wavenumber 및 그것의 주기 주기 기능 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq1.jpg">)은 축 삭 직경 (d)에 반비례 한다. 이 간단한 관계 (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq2.jpg">) SpeRe 데이터에서 축 삭 직경의 손쉬운 정량화를 제공 합니다. 이 활용 하 여, 우리가 우리의 이전 보고서에서 온화한 외상 성 뇌 손상에서 불 룩 유행 축 삭을 밝혔다.
SpeRe 시스템 confocal 현미경 검사 법에 따라 특수 레이저 소스 구성 되어 있으며 필터 (그림 2). 입력된 소스 화이트 라이트 레이저, 광대역 스펙트럼 출력 적외선 영역 표시를 제공 하는. 스펙트럼 검사에 대 한 시스템은 갖추고 두 acousto 광학 장치: 반영 선택한 지도 대 한 입력된 광대역 소스와 acousto 파이버 빔 스플리터 (AOBS)에서 선택 된 파장을 제공 하는 acousto 광학 가변 필터 (AOTF) 검출기의 파장 Hyperspectral confocal 현미경 검사 법에 대 한 소프트웨어 ( 재료의 표참조) 순차적으로 다양 한 입력된 파장에서 반사율 이미지를 수집 하는 사용자 정의 스펙트럼 스캔 옵션을 제공 합니다. 또한, 색수차 수 있습니다 비판적으로 간섭 스펙트럼 측정; 따라서,는 apochromat 렌즈의 사용을 권장 합니다.
메모의 화이트 라이트 레이저 고르지 스펙트럼 출력을 생성 하 고 광학 구성 요소 스펙트럼 프로필에도 영향을 줍니다. 따라서, 인수 스펙트럼 후속 정량 분석에 대 한 보정 필요. 보호은 거울은 일반적으로 전체 표시 영역 위로 거의 일정 한 반사율 (> 97%)을 제공 하는 참조로 사용 됩니다. 인수 스펙트럼 다음 미러에서 참조 스펙트럼으로 나누어집니다.
스펙트럼 검사에 대 한 스펙트럼 스텝 크기 결정 수집 속도; 따라서, 그것은 최적화가 필요 합니다. 더 큰 축 삭은 더 높은 스펙트럼 기간, 그것은 스펙트럼 샘플링을 세밀 하 게 필요 합니다. 예를 들어 가장 큰 생리 축 삭 중 10 µ m의 직경을 가진 축 삭 스펙트럼의 기간이 ~ 8 nm. 나이 키스 트 샘플링 조건을 적용 하 여 우리 고용 스펙트럼 샘플링 간격 4 nm 마우스 신경 조직에서 모든 생리 축 삭을 커버. 이 방법은 일반적으로 전체 스펙트럼 검사에 대 한 몇 초 동안 걸리며 따라서 적합 하지 않습니다 vivo에서 응용 프로그램 (예: 호흡 및 심장 박동) 생리 모션 안정적 스펙트럼 수집을 방해. 우리는 이전 배열 분석기 (수집 속도 ≈ 픽셀 당 30 밀리초)를 사용 하 여 각 지점에 대 한 전체 스펙트럼을 확보 하도록 설계 된 사용자 지정된 수직 현미경 계측 하 여이 문제를 해결.
이 보고서에서 우리는 상업 hyperspectral 현미경에서 실행 될 수 있는 고정된 뇌 조각에 SpeRe 이미징에 상세한 프로토콜을 설명 ( 재료의 표참조). 따라서, 프로토콜 광 계측에 전문성 없이 경험 하 여 완료할 수 있습니다. 우리는 또한 잠재적인 문제 및 수집 및 SpeRe 데이터의 분석에 대 한 문제 해결을 커버.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass cutter</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apochromat objective 40&#215;, NA 1.1</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>15506357</td>
			<td>Water-immersion type</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromyelin Green</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>F34651</td>
			<td>Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 TCS microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Refer to the &#34;Configuration of microscope&#34; in Introduction Section for details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS-X</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirror</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PF10-03-P01</td>
			<td>Coated with protected silver.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-136</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Biosolution</td>
			<td>BP031a</td>
			<td>4% v/v in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3306</td>
			<td>Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass</td>
			<td>Muto Pure Chemicals</td>
			<td>5116-20F</td>
			<td>Thickness: ~1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>Henkel</td>
			<td>Loctite 406</td>
			<td>Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Brainetree Scientific</td>
			<td>BS-8000 DUAL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White-light laser</td>
			<td>NKT photonics</td>
			<td>EXB-6</td>
			<td>EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spectral reflectometric microscopy on myelinated axons in situ

포유류 신 경계에서 수 초 다층된 소용돌이에 축 삭 섬유 enwrapping 여 전기 절연을 제공 합니다. 그것의 높은 조직 subcellular 아키텍처에 의해 영감을, 우리 최근 전례 없는 레이블 없는 나노 이미징 라이브 myelinated 축 삭 제자리의 가능 하 게 스펙트럼 셋 (SpeRe) 라는 새로운 이미징 적임 개발. 기본 원리는 다층된 subcellular 구조의 반사율 스펙트럼을 분석 하 여 nanostructural 정보를 얻을 것입니다. 이 문서에서는, 우리는 화이트 라이트 레이저와 가변 필터 상업 confocal 현미경 시스템을 사용 하 여 신경 조직의 기본 SpeRe 이미징 수행 하기 위한 자세한 단계별 프로토콜을 설명 합니다. 샘플 준비, 스펙트럼 데이터 및 nanostructural 정보를 얻기 위해 처리 하는 이미지의 취득의 절차 설명 합니다.

프로토콜에 따라 고정된 뇌 조각 exogenous 얼룩, myelin 타겟팅 fluorophore과 준비 ( 재료의 표참조). SpeRe 이미징 confocal 형광 이미징 (그림 4a)와 함께에서 상업 hyperspectral confocal 현미경을 사용 하 여 두뇌 조각에서 수행 되었다. SpeRe, 5 µW / µ m2 ~ 1 µs의 픽셀 드웰 타임을 입력된 광 강도 설정 되었습니다. 이 빛 복용량은 순서의 크기는 기존의 형광 confocal 현미경 검사 법12보다 낮은. 그것은 걸립니다 ~ 17 이상의 스펙트럼 스캔 s 4의 간격으로 470-670 nm nm (51 이미지).
SpeRe 신호는 광 반사의 형상에 의해 예상 대로 myelinated 축 삭의 중앙에 따라 지역화 됩니다. 축 삭 세그먼트의 반사율 스펙트럼에서 wavenumber 주기 얻은,이 이후에 축 삭 직경 (그림 4b, c) 변환 되었습니다. SpeRe에서 측정 한 지름 형광 기반 측정 (그림 4 d)와 좋은 계약에 발견 되었다. 잔여 사소한 오류 회절 제한 된 해상도 형광 기반 메서드 또는 불완전의 형상에서 유래 수 SpeRe에 대 한 모델.
SpeRe 영상 광 반사에 따라, 따라서 실리 카 기반 coverslip 중요 한 배경 잡음을 도입할 수 있습니다. 우리의 광섬유 설정에서 배경 잡음 때 상당한는 coverslip에서 이미징 깊이 미만 5 µ m 이지만 이미징 깊이 15 µ m (그림 5) 보다 크면 피 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57965/57965fig1.jpg"> 그림 1 : SpeRe의 원리. Myelinated 축 삭 다층된 박막 구조를 하고있다. 사건 빛은 부분적으로 반영에서 인터페이스, 프레넬의 법률에 의해 설명 된 대로. 이 반영 빛 파도 방해 따라서, 결과 반사 된 빛은 nanostructural 정보를 인코딩합니다. 스펙트럼 셋 (SpeRe) myelinated 축 삭에서 반사 된 빛 여 nanostructural 정보를 가져옵니다. 이 그림은 권, J. 그 외 여러분 에서 재 인 쇄 되었습니다. 9 <a href="/files/ftp_upload/57965/57965fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57965/57965fig2.jpg"> 그림 2 : SpeRe 시스템의 레이아웃. SpeRe 시스템은 반사율 confocal 현미경을 기반으로 합니다. 스펙트럼 검사에 대 한 세 가지 추가 구성 요소 여기 경로 따라 필요한: (1) supercontinuum 레이저, (2) acousto-광학 가변 필터 (AOTF), 및 (3) acousto 파이버 빔 스플리터 (AOBS). 광대역 레이저 소스는 괴기 하 게 좁은 대역폭으로 선택한 파장을 전송 하는 AOTF에 의해 필터링 됩니다. AOBS 빔 스플리터 빛 여기 샘플 가이드를 선택 된 파장에 대 한 역할을 합니다. 빛이 galvanometric 스캐너와 대물 렌즈를 통해 샘플에 사건 다음. 샘플에서 반사 된 빛은 descanned, 공간 confocal pinhole에 의해 필터링 및 광 전 증폭 관 관 (PMT)에 의해 수집 된. <a href="/files/ftp_upload/57965/57965fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57965/57965fig3.jpg"> 그림 3 : 소프트웨어 설치. (한) 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI). 주 창에서는 주로 5 하위 패널: 이미징 설치, 레이저, 광섬유 설치, 감지기 설치, 설정과 이미지 뷰어. (b) 영상 모드를 선택 하려면 드롭-다운 메뉴. SpeRe, xyλ 선택 됩니다. (c) 검출기의 스펙트럼 창 조정 패널. (d) acousto 파이버 빔 스플리터 (AOBS) 설정 패널. 검출기에 반사 된 빛을 안내 하는 '반사율' 선택 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57965/57965fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57965/57965fig4.jpg"> 그림 4 : 뇌 조직에 SpeRe. (한) A SpeRe 이미지를 murine 뇌 조직의 수 초 (fluoromyelin)의 형광 counterstaining와 스테인드. (b) A 대표 반사율 스펙트럼 흰색 점선된 상자에서 얻은 시내 (a). (c) 스펙트럼 주기에서 축 삭 직경 추정 하는 시뮬레이션된 참조 커브. 파란색 별표 (b)에서 얻은 데이터 요소입니다. (d) 형광 강도 박스형된 지역에서의 횡단 프로 파일에 (a). 형광 신호를 사용 하 여 추정 myelin 외부 직경은 ~ 760 nm, SpeRe 측정 잘 동의. 잔여 오류는 형광 기반 측정의 회절 오류에서 알만 합니다. Scalebar, 5 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57965/57965fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57965/57965fig5.jpg"> 그림 5 : 커버 슬립의 효과. (a, b) 반사율 이미지 같은 가로 위치에서 뇌 조직의 조직 coverslip 인터페이스에서 다른 깊이에 인수: 3 µ m (a) 및 15 µ m (b). Scalebar, 10 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57965/57965fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

제자리에 Myelinated 축 삭에 스펙트럼 Reflectometric 현미경

여기, 우리는 레이블 없는 나노 이미징 기술 스펙트럼 셋에 기반을 사용 하 여 고정된 뇌 조각에 myelinated 축 삭 이미징을 위한 단계별 프로토콜 제시.

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

7.3K 조회수.  Sungkyunkwan University. 여기, 우리는 레이블 없는 나노 이미징 기술 스펙트럼 셋에 기반을 사용 하 여 고정된 뇌 조각에 myelinated 축 삭 이미징을 위한 단계별 프로토콜 제시.

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In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different neurological diseases. Defects in this essential process can have detrimental effects on neuronal functioning and development. We have developed a dissection protocol that is designed to expose the Drosophila larval segmental nerves to view axonal transport in real time. We have adapted this protocol for live imaging from the one published by Hurd and Saxton (1996) used for immunolocalizatin of larval segmental nerves. Careful dissection and proper buffer conditions are critical for maximizing the lifespan of the dissected larvae. When properly done, dissected larvae have shown robust vesicle transport for 2-3 hours under physiological conditions. We use the UAS-GAL4 method 1 to express GFP-tagged APP or synaptotagmin vesicles within a single axon or many axons in larval segmental nerves by using different neuronal GAL4 drivers. Other fluorescently tagged markers, for example mitochrondria (MitoTracker) or lysosomes (LysoTracker), can be also applied to the larvae before viewing. GFP-vesicle movement and particle movement can be viewed simultaneously using separate wavelengths.

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

This protocol discusses the live dissection of Drosophila larvae for the purpose of imaging the movement of GFP tagged axonal vesicles on microtubule tracks.

Drosophila 애벌레 Segmental Axons 이내 시냅틱 Vesicles의 생체내 시각화에

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

연구

신경과학

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Rhizotomy 후 도설 루트 Axons의 라이브 영상

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences. For instance, addiction to nicotine via tobacco smoking is a leading cause of premature death worldwide (World Health Organization) and is likely caused by an alteration of ion channel distribution in the brain1. Chronic nicotine exposure in both rodents and humans results in increased numbers of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in brain tissue1-3. Similarly, alterations in the glutamatergic GluN1 or GluA1 channels have been implicated in triggering sensitization to other addictive drugs such as cocaine, amphetamines and opiates4-6.

Consequently, the ability to map and quantify distribution and expression patterns of specific ion channels is critically important to understanding the mechanisms of addiction. The study of brain region-specific effects of individual drugs was advanced by the advent of techniques such as radioactive ligands. However, the low spatial resolution of radioactive ligand binding prevents the ability to quantify ligand-gated ion channels in specific subtypes of neurons. 

Genetically encoded fluorescent reporters, such as green fluorescent protein (GFP) and its many color variants, have revolutionized the field of biology7.By genetically tagging a fluorescent reporter to an endogenous protein one can visualize proteins in vivo7-10. One advantage of fluorescently tagging proteins with a probe is the elimination of antibody use, which have issues of nonspecificity and accessibility to the target protein. We have used this strategy to fluorescently label nAChRs, which enabled the study of receptor assembly using F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) in transfected cultured cells11.More recently, we have used the knock-in approach to engineer mice with yellow fluorescent protein tagged &alpha;4 nAChR subunits (&alpha;4YFP), enabling precise quantification of the receptor ex vivo at submicrometer resolution in CNS neurons via spectral confocal microscopy12. The targeted fluorescent knock-in mutation is incorporated in the endogenous locus and under control of its native promoter, producing normal levels of expression and regulation of the receptor when compared to untagged receptors in wildtype mice. This knock-in approach can be extended to fluorescently tag other ion channels and offers a powerful approach of visualizing and quantifying receptors in the CNS.

In this paper we describe a methodology to quantify changes in nAChR expression in specific CNS neurons after exposure to chronic nicotine. Our methods include mini-osmotic pump implantation, intracardiac perfusion fixation, imaging and analysis of fluorescently tagged nicotinic receptor subunits from &alpha;4YFP knock-in mice (Fig. 1). We have optimized the fixation technique to minimize autofluorescence from fixed brain tissue.We describe in detail our imaging methodology using a spectral confocal microscope in conjunction with a linear spectral unmixing algorithm to subtract autofluoresent signal in order to accurately obtain &alpha;4YFP fluorescence signal. Finally, we show results of chronic nicotine-induced upregulation of &alpha;4YFP receptors in the medial perforant path of the hippocampus.

We have developed a novel technique of quantifying nicotinic acetylcholine receptor changes within subcellular regions of specific subtypes of CNS neurons to better understand the mechanisms of nicotine addiction by using a combination of approaches including fluorescent protein tagging of the receptor using the knock-in approach and spectral confocal imaging.

만성 니코틴 관리와 마우스 노크 인의 Fluorescently 태그를 Nicotinic 수용체의 분광 공촛점 이미징

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons

The development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out axons to innervate specific targets, which in humans are often more than 100 cm away from the soma of the neuron. Neuronal survival during development depends on target-derived growth factors but also on the support of Schwann cells (SCs). To this end SC ensheath axons from the region of the neuronal soma (or the transition from central to peripheral nervous system) to the synapse or neuromuscular junction. Schwann cells are derivatives of the neural crest and migrate as precursors along emerging axons until the entire axon is covered with SCs. This shows the importance of SC migration for the development of the peripheral nervous system and underlines the necessity to investigate this process. In order to analyze SC development, a setup is needed which next to the SCs also includes their physiological substrate for migration, the axon. Due to intrauterine development in vivo time-lapse imaging, however, is not feasible in placental vertebrates like mouse (mus musculus). To circumvent this, we adapted the superior cervical ganglion (SCG) explant technique. Upon treatment with nerve growth factor (NGF) SCG explants extend axons, followed by SC precursors migrating along the axons from the ganglion to the periphery. The beauty of this system is that the SC are derived from a pool of endogenous SC and that they migrate along their own physiological axons which are growing at the same time. This system is especially intriguing, because the SC development along axons can be analyzed by time-lapse imaging, opening further possibilities to gain insights into SC migration.

Here we describe a Schwann cell (SC) migration assay in which SCs are able to develop along extending axons.

성장 Axons 함께 손쥐 Schwann 세포 개발 분석

The  development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out  axons to innervate specific targets, which in humans are often more than ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

소뇌 축삭의 레이저 Nanosurgery<em&gt; 생체</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

니코틴 유도 칼슘 신호 전달 및 복부 해마 축삭을 따라 신경 전달 물질 방출의 라이브 영상

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin (5-hydroxytryptamine; 5-HT) syndrome. This hypothesis can be tested using in situ hybridization to detect the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a. In the past, such procedures, utilizing radioactive riboprobe, were difficult because of the complicated workflow that needs several days to perform and the added difficulty that the technique required the use of fresh frozen tissues maintained in an RNase-free environment. Recently, the development of short oligonucleotide probes has simplified in situ hybridization procedures and allowed the use of paraformaldehyde-prefixed brain sections, which are more widely available in laboratories. Here, we describe a detailed protocol using non-radioactive oligonucleotide probes on the prefixed brain tissues. Hybridization probes used for this study include dapB (a bacterial gene coding for dihydrodipicolinate reductase), ppiB (a housekeeping gene coding for peptidylprolyl isomerase B), and htr2a (a serotonin gene coding for 5-HT2A receptors). This method is relatively simply, cheap, reproducible and requires less than two days to complete.

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

This protocol describes a rapid and simplified in situ hybridization method ideal forparaformaldehyde-prefixed brain, thus reducing the need for prolonged complex steps while using fresh frozen tissues. The method is validated using the identification of the serotonin 5-HT2A receptor gene htr2a in rats.

빠른<em&gt; 현장에서</em세로토닌 증후군 쥐의 파라 포름 알데히드 - 접두사 뇌에 올리고 뉴클레오티드 프로브를 사용하여&gt; 하이브리드

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular recording has historically been a common technique used to study sensitivities of individual photoreceptor cells to different light stimuli that is still being used today. However, there remains a dearth of detailed methodology in the literature for researchers wishing to replicate intracellular recording experiments in the eye. Here we present the insect as a model for examining eye physiology more generally. Insect photoreceptor cells are located near the surface of the eye and are therefore easy to reach, and many of the mechanisms involved in vision are conserved across animal phyla. We describe the basic procedure for in vivo intracellular recording of photoreceptor cells in the eye of a butterfly, with the goal of making this technique more accessible to researchers with little prior experience in electrophysiology. We introduce the basic equipment needed, how to prepare a live butterfly for recording, how to insert a glass microelectrode into a single cell, and finally the recording procedure itself. We also explain the basic analysis of raw response data for determining spectral sensitivity of individual cell types. Although our protocol focuses on determining spectral sensitivity, other stimuli (e.g., polarized light) and variations of the method are applicable to this setup.

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

The electrophysiological technique of intracellular recording is demonstrated and used to determine spectral sensitivities of single photoreceptor cells in the compound eye of a butterfly.

에서 곤충 모델에서 시각 세포 스펙트럼 감도의 결정<em&gt; 생체</em&gt; 세포 내 녹음

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...