이 원고를의 개발은 국립 과학 재단 EPSCoR 센터 루트 및 Rhizobiome 혁신 상을 OIA-1557417에 지원 됩니다. 데이터 수집 네브래스카 링컨의 대학, 농업 연구 및 개발에서 자금 및 농 무부에서 해치 교부 금에 의해 지원 되었다. 우리는 또한 미국 농 무부-ARS에서 지원 인정 하 고 지원 설정 및 이러한 필드를 관리 하는 미국 농 무부 식품 및 농업에서 농업과 음식 연구 사업 경쟁 보조금 번호 2011-68005-30411에 의해 제공 되었다.

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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+core+root+microbiome+of+sugarcanes+cultivated+under+varying+nitrogen+fertilizer+application.">The core root microbiome of sugarcanes cultivated under varying nitrogen fertilizer application.</a> Environmental Microbiology. 18 (5), 1338-1351 (2016).</li><li>Bulgarelli, D., Schlaeppi, K., Spaepen, S., Ver Loren van Themaat, E., Schulze-Lefert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+functions+of+the+bacterial+microbiota+of+plants.">Structure and functions of the bacterial microbiota of plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 64, 807-838 (2013).</li><li>Peiffer, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+heritability+of+the+maize+rhizosphere+microbiome+under+field+conditions.">Diversity and heritability of the maize rhizosphere microbiome under field conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (16), 6548-6553 (2013).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 원고에 설명 된 방법을 쉽게 토양과 식물 metagenomics의 필드를 입력 하는 과학자를 사용 해야 합니다. 년 동안, 우리는이 원고에서 설명 하는 실험을 실시 이후 우리의 방법을 세련는. 한 변화는 우리가 지금 미리 라벨 튜브 샘플 필드에 외출 하기 전에. 우리의 실험실 바코드 시스템 및 라벨 프린터를 사용합니다. 라벨 프린터는 뿐만 아니라 시간 때 라벨 튜브, 뿐만 아니라 모든 것을 쉽게 추적 하 고 올바르게 식별 인간의 손 쓰기의 vagaries 없이 샘플을 저장 합니다. 또 다른 중요 한 요점은 우리는 다시 가능한 한 빨리 필드에서 그것를 데 려 후 자료를 처리 하려고입니다. 우리는 DNA 분석에 사용 되는 토양 동결, 소독, 뿌리를 고정 필터링 그리고는 rhizosphere 필드에서 반환 된 후 12 ~ 36 시간 이내 동결 하고자 합니다. DNA 추출 절차는 토양을 rhizosphere, 특히 많은 단계로 긴 그래서 우리 DNA 추출 프로토콜에 대 한 시간에 손을 최소화, 도입 될 수 있습니다, 인간의 오류를 감소 하는 로봇 (Kingfisher 플렉스, ThermoFisher) 구입 다른 방법에 일관성을 향상 하 고 토양, 뿌리, 또는 rhizosphere의 일괄 처리 됩니다. 공장 설비 재료를 작업할 때 그것은 공부 또는 "견본"를 루트 종류의 다양 한 루트 형식을 결정 하는 것이 중요. 유지 뿌리 그리고 때 DNA 추출 수행 하는 것이 중요, 96-잘 DNA 추출 접시를 채울 때 샘플 사이의 교차 오염 없이 보장은 냉동된 상태에서 떠난다. 고려해 야 할 또 다른 중요 한 요소는 필드 실험을 디자인 하 고 완전 한를 사용 하 여 무작위로 디자인 가능한 때 사용할 복제의 번호26. 높은 분야 다양성 때문에 그것은 작은 차이 감지 하는 복제의 다 수 필요할 수 있습니다. 마지막으로, 우리의 경험에서 뿌리를 발굴 하는 때 토양은 너무 젖은 하지 있는지 확인이 필수적입니다. 토양 물으로 포화 되는 경우 그것은 작업할 더러운 하지만 그것은 또한 매우 어려운는 rhizosphere를 정의 하 고 뿌리에서 토양을 제거 하.
초기에 이러한 방법을 개발 하는 동안 만들어진 하나의 수정 했다 대신 우리 분야에 더 많은 작업을 쉽게 하기 위해 가스 발전기에 의해 구동 vortexers 업그레이드 rhizosphere 출시를 손으로 튜브를 떨고 표준화의 관점에서 시간과 방식으로 각 튜브 동요 했다. Amplicon 시퀀싱 방법의 한 가지 한계는 결과 분류학 해상도 종종 제한 됩니다 많은 OTUs는 알 수 없는 또는 유일한 알려진 가족 또는 속 수준입니다. 연구의이 분야는 새롭고 개발 방법, 데이터 분석 결과의 해상도 향상 시킬 수 있는 특히 인식 하는 것이 중요 하다 그래서 빠르게 진화 하고있다.
이러한 프로토콜은 박테리아와 archaea, 버섯 하지 공부에 합니다. 확대를 위한 다른 프라이 머를 사용 하 여 동일한 DNA 샘플27,28를 사용 하 여 곰 팡이 사회의 연구에 대 한 허용할 것 이다. 이러한 메서드는 방법 단순화 될 수 있기 때문에 대량의 장비 구매를 필요 하지 않습니다. 우리가 설명 하는 방법 "누구 가", 결정 하는 데 주로 운항 하지만 필드의 기능을 테스트 및 샷건 시퀀싱 방법, 격리를 사용 하 여 해결 될 수 있는 함수에 대 한 중요 한 질문에 신속 하 게 진화 하 고 미생물, 또는 시퀀싱 전체 미생물 게놈입니다.
대표 결과 설명 된 방법을 사용 하 여 식별 될 수 있는 미생물 지역 사회에서 차이 강조 표시 합니다. 데이터 분석22에 베타-다양성 방식을 사용 하 여, 작곡 차이 샘플 종류 사이 표시 했다. 이러한 차이 명확 하 게 endosphere, rhizosphere, 및 토양 고유의 미생물 커뮤니티3을 포함 대부분의 다른 연구에서 관찰 되었습니다. Shannon 다양성 지 풍부 하 고 있는 각 식물 종에서 endosphere, rhizosphere, 및 토양 미생물 종의 균일성을 결정 하기 위해 계산 되었다. 이 연구 및 많은 다른 사람에서 같이, 알파 다양성은 토양는 rhizosphere에서 약간 감소 하 고 endosphere3,,529에서 크게 감소 후에 가장 많습니다. 이러한 결과 여기에 설명 된 메서드는 endosphere, rhizosphere, 및 토양에서 구성 변경 내용을 식별 하는 데 적합 한 나타냅니다.
Proteobacteria 의 지배력은 endosphere 및 토양30,,3132에 대 한 연구에서 일반적인 찾아내는 이다. Endosphere는 일반적으로 Proteobacteria의 더 높은 관계 되는 풍부를 가진 낮은 미생물 종의 다양성이 있다. 이 다시 여기 결과 문학에 있는 다른 발견의 대표는 강조 한다. 이 연구에서 치료 효과가 크게 다른 되었고 그에 대 한 두 가지 주요 이유는 치료에 의해 부과 된 차이 감지에 충분 한 변화를 생성 하기에 충분 되지 않은 고이 샘플링 했다의 끝에 있을 수 있습니다는 성장 계절 때 필드 비슷한 수준으로는 무슨 절 기의 끝에 측정 했다 질소 내려 그릴 충분 한 시간을 했다 수 있습니다. 또 다른 연구에서 시간의 긴 기간 동안 비슷한 수정 속도 사용 하 여, 단지 상대적으로 작은 변화는 미생물의 구성에 측정된33했다. 다른 연구 질소 비료34,35인해 곰 팡이 및 세균 지역 사회에서 변화를 보여왔다.
식물 종의 그들의 microbiomes3,,3236 결정에 역할을 알려지고 미생물 지역 사회 변화에도 작은 차이에서 다른 식물 genotypes 사이 입증 되었습니다가 단일 종37 본이 연구에서는 미생물 지역 사회 구성에 상당한 차이 식물 종 사이 발견 되었다. 모든 샘플 종류에 그것은 switchgrass 가장 뚜렷한 미생물 구성 했지만 종 간의 차이 endosphere에 통계적만 했다 나타났다. Rhizosphere 커뮤니티 구성 수 있습니다 더 많은 복제 분석에 사용할 수 있는 경우 중요 한 되고있다.
결합 된 필드, 실험실, 및 여기에서 설명 하는 분석 프로토콜, rhizosphere, 토양과 뿌리36의 endosphere에 미생물 커뮤니티의 구성 어떻게 다른 요인 영향 공부에 대 한 강력한 방법을 제공 합니다. 많은 농업 분야에서 특히 microbiomes의 지역에서 해야 할 일이 있다. 수익률 토양 미생물에 의해 변경 되는 방법에 대 한 중요 한 질문은 아직 완전히 해명 하. 자르기 회전 영향 토양 미생물, 타이밍은 미생물을 변경 하는 방법, 어떻게 비 생물 적인 긴장을 어떻게에 관한 가장 기본적인 질문에도 미생물, 변경 여부 및 토양 유형에 미생물을 변경할 이러한 요소와 상호 작용 하는 방법 특정 작물 및 미국 지역에서 보편적인 미생물 모든 관련 질문은. 이러한 방법은 존재 및 병원 성 및 유익한 박테리아의 지 속성을 식별 하기 위해 역학 연구도 유용할 것 이다. 이러한 방법에 대 한 또 다른 미래 지평선 DNA 방법 여기에 설명 된 식물 및 미생물 RNA 대사 산물 데이터 통합을 시작 하는 것입니다. 추가 개선 및 더 많은 변수 테스트 추가 이러한 프로토콜의 최적화를 위해 중요할 것 이다.

미생물 연구 이해 하 고 조작 영양소 사이클링, 유기 물 회전율, 및 개발 또는 토양 병원 균1,2의 저해 등 생태계의 프로세스에 대 한 중요 한 의미를 갖는다. 연구의이 분야는 또한 천연 식물 지역 사회와 agroecosystems의 생산성에 토양 미생물의 영향을 이해 하기 위한 큰 잠재력을 보유 하고있다. 자연 생태계에서 토양 미생물에 초점을 맞춘 많은 연구는, 적은 agroecosystems3공장 rhizosphere 및 endosphere 미생물에 집중 했다. 네브라스카, 농업 농업으로 중요 한 작물 연구에 대 한 중요 한 주제를 재배는 이러한 토양의 연구를 만드는 국가의 큰 부분에 걸쳐 풍경을 지배. 이 방법 종이의 목표는 식물의 뿌리에는 rhizosphere와 endosphere, 그리고 결국 미생물 지역 사회를 수정 하는 방법을 확인 하려면 agroecosystems에 미생물을 설명 하는 프로토콜의 표준 세트와 연구자를 제공 하기 이러한 미생물 토양 건강 및 공장 생산성에서 재생 하는 기능을 이해 합니다.
여기에 제시 된 방법4,5 에서이 종이 어떤 미생물 학습 겨냥은 독점적으로 내부 루트 및 루트 밖에 즉시 미생물에서 서로 어떻게 다른 사람에 의해 사용 되는 방법에서 약간 차이가 있는 rhizosphere입니다. 이 연구에 사용 하는 amplicon 시퀀싱 DNA 샘플에서 발견 미생물 taxa 고 커뮤니티 샘플 형식 또는 치료에 따라 변경 하는 방법을 결정 하는 조사를 허용 합니다. 이 프로토콜 Lundberg 외 에서 사용 하는 매우 비슷한 프로토콜의 주요 차이점 중 하나 6 그 대신 쥡니다,이 프로토콜 사용 하 여 표면 살 균 표 백제와 에탄올 뿌리에서는 rhizosphere를 제거 하는. 다른 사람 또한 효과적으로 표면 살 균 사용7,8,,910. 이러한 메서드는 하지만 약간 다른 다른 방법 보다 더 유리한 있습니다. 이러한 메서드는 충분 한 사람들이 함께 그것은 endosphere, rhizosphere, 및 토양으로 분할 될 때 약 450 샘플까지 추가 하루 150 필드 플롯을 처리할 수 있기 때문에 특히 큰 필드 실험에 적합 합니다. 이 원고 분야에서 샘플, 실험실에서 자료 처리 하 고 추출 하 고, DNA 시퀀싱 하는 데 사용 하는 방법을 자세히 설명 하 고 결과 시퀀싱 데이터를 분석 하는 단계에 대 한 간략 한 개요를 제공 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit</td>
			<td>Qiagen/MoBio</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>Extraction kit for soil and rhizosphere</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit</td>
			<td>Qiagen/MoBio</td>
			<td>13496-4</td>
			<td>Extraction kit for roots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Handle Digging shovel, 101 cm L</td>
			<td>Fiskars</td>
			<td>9669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid Tiller, 40 cm L</td>
			<td>Truper</td>
			<td>34316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ziploc Bags, 17.7 cm x 19.5 cm</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooler</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash pan</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic bucket</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves (work and lab)</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 cm diameter Soil sieve #8, 2360 &#956;m mesh size</td>
			<td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td>
			<td>US8-8FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 cm diameter Soil Sieve #4, 4750 &#956;m mesh size</td>
			<td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td>
			<td>US8-4FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>portable generator</td>
			<td>Honda brand works well</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainers 100 &#956;m mesh size</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silwet L-77</td>
			<td>Lehman Seeds</td>
			<td>VIS-30</td>
			<td>Surfactant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaves</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drying Oven</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>CLOROX - household strength</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice pellets</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11 cm precision fine point tweezers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>17456209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 cm Straight point specimen forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13.5 cm Pruning Scissors</td>
			<td>Fiskars</td>
			<td>9921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL tube</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL PP conical tube</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>C15B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL PP conical tube</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>C50B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Millipore-sigma</td>
			<td>Milli-Q Integral, Q-POD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32854</td>
			<td>For DNA quantification of removed samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantiFluor dsDNA System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2670</td>
			<td>For DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Black with Clear Flat Bottom Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pPNA PCR Blocker</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>PP01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPNA PCR Blocker</td>
			<td>PNA Bio</td>
			<td>MP01-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genomic DNA from Microbial Mock Community B (Even Low Concentration) v5.1L, for 16s rRNA Gene sequencing</td>
			<td>BEI Resources</td>
			<td>HM782D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive 8 well-strips for plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89134-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel beads, 3.2 mm dia</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Assay block (DNA extraction plate for the Qiagen/MoBio Dneasy PowerPlant HTP Kit)</td>
			<td>CoStar</td>
			<td>3959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antistatic PP weighing funnel, size small for soil/rhizosphere</td>
			<td>TWD Tradewinds, INC</td>
			<td>ASWF1SPK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antistatic PP weighing funnel, size x-small for root/leaf</td>
			<td>TWD Tradewinds, INC</td>
			<td>ASWFXSCS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie 2 Digital Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex adapter for 50 mL tubes</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-H506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar (100 mL) and pestle</td>
			<td>Any</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal micro-spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80071-672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable antistatic microspatulas</td>
			<td>VWR</td>
			<td>231-0106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown Paper bag 2# (10.95 cm x 6.19 cm x 20 cm)</td>
			<td>Duro</td>
			<td>18402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5424 Centrifuge for 2 mL tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge for 96-well plate</td>
			<td>Sigma4-16S</td>
			<td>81510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge rotor for 50 mL tubes</td>
			<td>Sigma4-16S</td>
			<td>12269 - Biosafe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi DNA polymerase</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass experiments

식물 및 토양 미생물 연구 이해 역할 미생물 농업 생산성에서 재생에 대 한 점점 더 중요 한 되 고 있다. 이 논문의 목적은 빠르게 토양, rhizosphere, 및 endosphere 복제 된 현장 실험의 샘플 유형, 치료, 및 식물 유전자 미생물 지역 사회에서 발생할 수 있는 변경 내용을 분석 하는 방법에 정보를 제공 하도록. 이러한 메서드를 보여 주기 위해 사용 하는 실험 웜 시즌 잔디 2, 순수를 포함 하는 복제 필드 플롯의 구성 (Panicum virgatum 및 Andropogon gerardii) 및 낮은 다양성 잔디 혼합물 (A. gerardii, Sorghastrum nutans, 및 Bouteloua curtipendula). 간단히, 식물 발굴, 다양 한 뿌리는 잘라 고 인산 염 버퍼에 배치 다음 동요는 rhizosphere를 수집 하. 뿌리는 얼음 및 표면 소독 표 백제와 에탄올 (EtOH) 실험실에 주어진 다. rhizosphere 필터링 하 고 원심 분리에 의해 집중. 루트 볼 주위에서 발굴된 토양 비닐 봉지에 배치 하 고 토양의 작은 금액을 DNA 추출에 대 한 촬영은 연구실로 가져. DNA는 뿌리, 토양, 및 rhizosphere에서 추출 하 고 16S rRNA 유전자의 v 4 영역에 대 한 뇌관으로 증폭. Amplicons 시퀀싱, 다음 오픈 액세스 생물 정보학 도구와 분석. 이러한 방법을 연구원 미생물 지역 사회 성과 구성 샘플 유형, 치료, 인해 다릅니다 어떻게 테스트 하 고 유전자를 식물. 통계 모델과 함께 이러한 방법을 사용 하 여, 대표적인 결과 입증 뿌리, rhizosphere, 및 토양 미생물 지역 사회에 중요 한 차이가 있다. 여기에 제시 하는 방법 단계 필드 샘플을 수집, 분리, 추출, 계량, 증폭, 및 DNA 시퀀싱 하는 방법에 대 한의 완전 한 세트를 제공 하 고 미생물 지역 사회 성과 복제 필드 재판에서 조성 분석.

이 원고에 제시 하는 대표적인 결과 필드 사이트 미드 근처 대학 네브라스카 링컨 농업 연구 부문 농장에서 2012 년에 설립, 실험, 사이트 니 전에 옥수수-콩 순환으로 관리 했다 . 세 가지 유형의 토양에 위치한 연구 사이트 하지만 측정된 토양 속성의 모든 변경 사항을 부과 하는 치료로 인해 마치 데이터 분석.
분야 사이트 2, 순수 포함, 큰 bluestem, indiangrass (S. nutans), 그리고 '버트' sideoats grama (낮은 다양성 잔디 혼합물 뿐만 아니라 switchgrass (P. virgatum 이력서 자유)와 큰 bluestem (A. gerardii)의 의미 B. curtipendula)입니다. 3 따뜻한 시즌 잔디 플롯 세 번 복제 된 완전 한 무작위 블록 디자인에 있었다. 3 다른 잔디 플롯으로 중첩 되었고 56 (N1) 112kg (N2) N 하는 2 개의 질소 (N) 수정 처리 적용된 요소-1 했다. 성장 시기의 끝에 미생물 샘플링 시 음모에서 포함 된 토양 8.0 ± 1.1 (평균 ± SD) ppm 질산염 함께 수정 112kg N 하-1 과 6.8 ± 0.7 (평균 + SD) 음모에 ppm 질산염 함께 수정 56 kg N 하-1. 음모는 일년에 한 번을 수정 된 했다. 음모는 주요 플롯 (8000 m2) 및 N 치료로 지정 되었다 웜 시즌 잔디 분할 플롯 (4000 m2) 했다. 큰 bluestem '보 난 자'와 '금광'의 50: 50 혼합으로 시드 되었습니다 그리고 Indiangrass '스카우트'와 '전사'의 50: 50 혼합으로 시드 되었습니다. 음모는 2012 년에 설치 했다 그리고 첫 번째 N 응용 프로그램 2013의 봄.
토양 및 루트 샘플링은 2014 년 9 월 15 일에 실시 되었다. 3 복제 (그림 1)과 분할 플롯 무작위 디자인으로 설정 된 필드에 아래 설명 된 작업 실시 됐다. Endosphere에 대 한 샘플은 다음과 같이 모든 평균 시퀀싱 깊이: 4871 ± 5711 (평균 ± SD), rhizosphere: 40726 ± 14684, 토양: 38184 ± 9043. 설명, 방법을 사용 하 여 이러한 실험에 변화의 가장 큰 소스 중 하나 미생물 지역 사회 발견 샘플 형식 (그림 2) 사이에서 차이가 있습니다. 이 대표적인 데이터 세트에서 rhizosphere 및 토양 서로 구성 (그림 2A) endosphere 보다 더 비슷한 것으로 나타납니다. 그러나, 거기 또한 매우 중요 한 했다 (p = 0.001) rhizosphere와 (그림 2B) 토양 미생물 지역 사회 구성에 차이. 샘플 형식에 의해 분석 이러한 실험에서 차지 하 고 총 변화 26% 이었다.
알파 다양성 분석 미생물 지역 사회는 endosphere에서 낮은 토양와 rhizosphere (그림 3) 샘플 다양성에는 나타났다. 어떤 구획에 잔디 종 간의 다양성에만 큰 차이가 큰 bluestem의 endosphere 샘플 및 switchgrass, switchgrass 데 상당히 높은 미생물 종 다양성 (그림 3)와 함께 사이 했다. 관계 되는 풍부 분석 (그림 4) Proteobacteria Actinobacteria 뒤에 모든 샘플 종류에서의 지배를 강조 표시 합니다. 토양 및 rhizosphere는 또한에 의해 지배 Acidobacteria 와 Chloroflexi 는 endosphere Bacteriodetes의 더 큰 상대 풍부 했다 반면.
이 실험에서 두 개의 서로 다른 양의 N 비료 식물 성장 했다 고 우리 치료 효과 있었습니다 여부를 확인 하기 위해 데이터를 분석 하는 따라서. 치료 효과 총 변이의 12%를 차지 하지만 안 수에서 두 치료는 다른 (그림 5) 보지 크게 다른 아니었다. 이 이러한 데이터 집합 보다는 육안 검사 또는 질적 판단에 대 한 통계 분석의 중요성을 강조 한다.
식물 조직 및 토양의 미생물에서 식물 영향 차이 안 수의 제한 된 메서드를 사용 하 여 시각화 했다. 통계적 인 차이 사용 하 여 PERMANOVA 분석은 크게 다른 미생물 커뮤니티 구성 샘플 사이에서 종, 등의 특정 변수 결과 여부 테스트를 결정 했다. 모든 샘플 종류 함께 분석 했다 때 매우 중요 한 차이 때문에 식물 종 (그림 6) 미생물 지역 사회 구성에서 발견 되었다. 이 실험에서 변형 식물 종에 의해의 양은 6.7% 이었다. 마지막으로, 각 샘플 형식 샘플 종류의 운전 하 고 있을 중요 한 식물 종 효과 결정 하기 위해 개별적으로 분석 했다. endosphere에서 서만 거기 있 었 어 매우 중요 한 차이 (p = 0.001) (그림 7) 다른 식물 종의 미생물 커뮤니티 구성 사이. 다른 샘플 형식에서는 종 효과 개별적으로 분석 하면 중요 한 되지 않았습니다. Endosphere, 종 인 백분율 변화 했다 rhizosphere (18%) 및 토양 (15%)에서 낮은 반면 27%, 이었다. 이 더 각 조직 유형을 개별적으로 분석의 중요성을 강조 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig1.jpg"> 그림 1: 실험 분야 디자인의 예. 대학 네브라스카 링컨 동부 네브라스카 연구와 미드, 네브라스카 근처 센터에 위치한 필드 사이트의 3 중에서 완전 한 무작위 블록 디자인을 설명 하는 실험 분야 디자인 전체 사이트 설명에 대 한 결과 섹션을 참조. N 1은 낮은 (56 kg N 하-1 요소) 및 N2 (112 k N g 하-1 요소) 적용 된 높은 질소 비율 이다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57932/57932fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig2.jpg"> 그림 2: endosphere, rhizosphere, 및 2014에 다년생 잔디 샘플링에서 토양을 포함 하 여 다른 샘플 형식에서 미생물 구성 비교 베타 다양성 분석. 분석 브 레이 커티스 호환성 매트릭스를 생성 하 QIIME1.9.1에 파이썬 스크립트를 사용 하 여 실행 되었다. 주 좌표 분석 (PCoA) 브 레이 커티스 호환성 매트릭스에 따라 RStudio에서 구상 되었다. PCoA1과 PCoA2 PCoA 분석에 의해 설명 하는 첫 번째와 두 번째로 큰 분산을 나타냅니다. PERMANOVA 통계 분석 샘플 형식 간의 중요성을 결정 하기 위해 수행 하 고 p 값 오른쪽 상단 모서리에 표시 됩니다. 그림에 각 기호는 각 샘플에 대 한 전체 미생물 지역 사회를 나타냅니다. (A) Endosphere, rhizosphere 및 토양 샘플 형식 함께 분석 했다. 모든 87 샘플 샘플 당 486 시퀀스에 올라가기 했다. (B) Rhizosphere 및 토양 샘플 함께 분석 했다. 모든 59 샘플 8231 시퀀스 올라가기 했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57932/57932fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig3.jpg"> 그림 3: endosphere, rhizosphere 및 토양에 각 종족에 대 한 논 지를 사용 하 여 알파 다양성 분석. 분석은 QIIME1.9.1에 파이썬 스크립트를 사용 하 여 실행 되었다. 진공은 endosphere, rhizosphere, 및 토양 샘플 형식 샘플 당 486, 17154 및 8231 시퀀스와 각각에 대 한 수행 되었다. 상자 표시 25 그리고 75 백분위 (첫 번째 및 세 번째 quartiles). 상자 안에 가로줄 중간값과 빨간색을 나타냅니다 플러스 평균을 보여 줍니다. 수염 outliers (이 검은 점 들으로 표시 됩니다) 그 보다 1.5 배 interquartile 범위를 제외 하는 데이터의 범위를 표시 (n = 6 sideoats grama 섞는다 어디를 제외 하 고 각 샘플에 대 한 n = 5). 섀 넌 인덱스는 endosphere에 있는 모든 5 종의 rhizosphere와 토양 보다 낮은 했다. 비 파라메트릭 Wilcoxon 순위 합계 테스트 종 사이 의미를 결정 하는 데 사용 했다 하 고 큰 차이가 종 상자 위에 표시 했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57932/57932fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig4.jpg"> 그림 4: endosphere, rhizosphere, 및 토양에 있는 문 수준에 관계 되는 풍부. 샘플 다른 샘플 종류 중에서 미생물 문의의 풍부를 비교 분석 했다 (n = 각 샘플 형식에 대 한 29). 분석은 OTU 테이블에서 QIIME1.9.1에 파이썬 스크립트를 사용 하 여 실행 되었다. 원형 차트 내부 다양 한 색상은 문의 나타냅니다. 백분율은 각 문 각 샘플 형식에의 관계 되는 풍부를 나타냅니다. 문 정보 했다 Ribosomal 데이터베이스 프로젝트 분류자 (RDP)25를 사용 하 여 주석 처리 됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57932/57932fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig5.jpg"> 그림 5: 모든 샘플 형식 간의 제약 요인으로 치료를 사용 하 여 분석. 주 좌표 (모자) 분석의 정식 분석 치료 사이 미생물 지역 사회 구성에 차이가 있었는지 확인 하기 위해 수행 되었다. 치료를 위해 각 N, n = 42 n 1에 대 한 (56 k N g 하-1) 및 n n 2에 대 한 = 45 (112kg N 하-1). 브 레이 커티스 호환성 매트릭스는 QIIME1.9.1에 파이썬 스크립트를 사용 하 여 생성 되었습니다. 브 레이 커티스 호환성 매트릭스에 따라 모자 분석 RStudio에서 요인으로 치료를 제한 하 여 이루어졌다. PERMANOVA 분석 치료 차이 했다 중요 한, p 값은 오른쪽 상단에 표시 됩니다 있는지 확인 위해 수행 되었습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57932/57932fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig6.jpg"> 그림 6: 모든 샘플 형식 간의 제약 요인으로 식물을 사용 하 여 분석. 분석은 모든 샘플 종류에서 식물 종 사이 미생물 지역 사회 구성에 차이가 있었는지 확인 하기 위해 실시 됐다. 주 좌표 조정 및 모든 샘플 형식 (endosphere, rhizosphere, 및 토양)의 모자 분석 수행 되었다 브 레이 커티스 호환성 매트릭스를 사용 하 여. 브 레이 커티스 호환성 매트릭스 QIIME1.9.1에 파이썬 스크립트를 사용 하 여 생성 되었습니다. 브 레이 커티스 호환성 매트릭스에 따라 모자 분석 RStudio에서 요인으로 제약 하는 식물 종에 의해 이루어졌다. PERMANOVA 통계 분석 식물 종 사이 의미를 결정 하기 위해 수행 하 고 P 값 오른쪽 상단 모서리에 표시 됩니다. 각 기호는 그림에 그 샘플에 대 한 전체 미생물 지역 사회를 나타냅니다. n = n 을 제외한 모든 샘플 종류에 각 종족에 대 한 18 = 15 sideoats grama 믹스에 대 한. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57932/57932fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig7.jpg"> 그림 7: 종을 사용 하 여 제약 요인으로 각 샘플 유형에 개별적으로 모자 분석의 예. 주 좌표 조정 및 각 샘플 형식 (endosphere, rhizosphere, 및 토양)의 모자 분석 브 레이 커티스 호환성 매트릭스를 사용 하 여. 각 샘플 종류 486, 17154, 및 endosphere, rhizosphere 및 토양에서 각각 샘플 당 8231 읽기에 올라가기는. 종은 안 수를 제한 하는 요인으로 사용 되었다. PERMANOVA 통계 분석 각 샘플 유형에서 식물 종 사이 의미를 결정 하기 위해 수행 하 고 p 값 오른쪽 상단 모서리에 표시 됩니다. 그림에서 각 기호는 각 샘플에 대 한 전체 미생물 지역 사회를 나타냅니다. 샘플 크기는 n = 29 각 샘플 유형, n = sideoats grama 믹스를 제외한 각 샘플 형식에 각 식물 종에 대 한 6 (n = 5). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57932/57932fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

필드에서 식물 뿌리의 발굴 뿐만 아니라 endosphere, rhizosphere, 및 토양 샘플의 처리는 DNA 추출 및 데이터 분석 방법 등 자세하게에서 설명 되어 있습니다. 이 문서는 토양, endosphere, rhizosphere microbiomes의 연구에 대 한 이러한 기법을 사용 하 여 다른 실험실을 사용 하도록 설계 되었습니다.

절연 및 토양, Rhizosphere, 및 다년생 잔디 실험에 뿌리에서 미생물 커뮤니티의 분석

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

isolation-analysis-microbial-communities-soil-rhizosphere-roots

Research

JoVE Journal

Environment

54.4K 조회수.  University of Nebraska-Lincoln. 필드에서 식물 뿌리의 발굴 뿐만 아니라 endosphere, rhizosphere, 및 토양 샘플의 처리는 DNA 추출 및 데이터 분석 방법 등 자세하게에서 설명 되어 있습니다. 이 문서는 토양, endosphere, rhizosphere microbiomes의 연구에 대 한 이러한 기법을 사용 하 여 다른 실험실을 사용 하도록 설계 되었습니다.

비디오: Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Technique for Studying Arthropod and Microbial Communities within Tree Tissues

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms. Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear young, feed, or hide from natural enemies or harsh environmental conditions outside of the tree. Organisms that persist within the phloem habitat are difficult to observe given their location under bark. We provide a technique to preserve intact phloem and prepare it for experimentation with invertebrates and microorganisms. The apparatus is called a &#8216;phloem sandwich&#8217; and allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms. This technique has resulted in a better understanding of the feeding behaviors, life-history traits, reproduction, development, and interactions of organisms within tree phloem. The strengths of this technique include the use of inexpensive materials, variability in sandwich size, flexibility to re-open the sandwich or introduce multiple organisms through drilled holes, and the preservation and maintenance of phloem integrity. The phloem sandwich is an excellent educational tool for scientific discovery in both K-12 science courses and university research laboratories.

We provide a technique to preserve intact tree phloem and prepare it for observation. We create an apparatus called a phloem sandwich that allows for the introduction and observation of arthropods, microbes, and other organisms that inhabit phloem tissues.

나무 조직 내에서 절지 동물과 미생물 군집 유학을위한 기술

Phloem tissues of pine are habitats for many thousands of organisms.  Arthropods and microbes use phloem and cambium tissues to seek mates, lay eggs, rear ...

연구

환경과학

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes and soil organic matter formation to small-scale stable-isotope biomarker probing. Coupling multiple stable isotopes such as 13C with 15N, 18O or&#160;2H has the potential to reveal even more information about complex stoichiometric relationships during biogeochemical transformations. Isotope labeled plant material has been used in various studies of litter decomposition and soil organic matter formation1-4. From these and other studies, however, it has become apparent that structural components of plant material behave differently than metabolic components (i.e. leachable low molecular weight compounds) in terms of microbial utilization and long-term carbon storage5-7. The ability to study structural and metabolic components separately provides a powerful new tool for advancing the forefront of ecosystem biogeochemical studies. Here we describe a method for producing 13C and 15N labeled plant material that is either uniformly labeled throughout the plant or differentially labeled in structural and metabolic plant components.
Here, we present the construction and operation of a continuous 13C and 15N labeling chamber that can be modified to meet various research needs. Uniformly labeled plant material is produced by continuous labeling from seedling to harvest, while differential labeling is achieved by removing the growing plants from the chamber weeks prior to harvest. Representative results from growing Andropogon gerardii Kaw demonstrate the system&#39;s ability to efficiently label plant material at the targeted levels. Through this method we have produced plant material with a 4.4 atom%13C and 6.7 atom%15N uniform plant label, or material that is differentially labeled by up to 1.29 atom%13C and 0.56 atom%15N in its metabolic and structural components (hot water extractable and hot water residual components, respectively). Challenges lie in maintaining proper temperature, humidity, CO2 concentration,&#160;and light levels in an airtight 13C-CO2 atmosphere for successful plant production. This chamber description represents a useful research tool to effectively produce uniformly or differentially multi-isotope labeled plant material for use in experiments on ecosystem biogeochemical cycling.

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

This method explains how to build and operate a continuous 13C and 15N isotope labeling chamber for uniform or differential plant tissue labeling. Representative results from metabolic and structural labeling of Andropogon gerardii are discussed.

연속의 설계 및 운영<sup&gt; 13</sup&gt; C 및<sup&gt; 15</sup통일 또는 차등을위한&gt; N 레이블 상공 회의소, 대사 및 구조, 식물 동위 원소 라벨링

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals is often not well understood. Here we demonstrate an integrated field lysimetry and porewater sampling method for evaluating the mobility of chemicals applied to soils and established vegetation. Lysimeters, open columns made of metal or plastic, are driven into bareground or vegetated soils. Porewater samplers, which are commercially available and use vacuum to collect percolating soil water, are installed at predetermined depths within the lysimeters. At prearranged times following chemical application to experimental plots, porewater is collected, and lysimeters, containing soil and vegetation, are exhumed. By analyzing chemical concentrations in the lysimeter soil, vegetation, and porewater, downward leaching rates, soil retention capacities, and plant uptake for the chemical of interest may be quantified. Because field lysimetry and porewater sampling are conducted under natural environmental conditions and with minimal soil disturbance, derived results project real-case scenarios and provide valuable information for chemical management. As chemicals are increasingly applied to land worldwide, the described techniques may be utilized to determine whether applied chemicals pose adverse effects to human health or the environment.

Field lysimetry and porewater sampling allow researchers to evaluate the fate of chemicals applied to soils and established vegetation. The goal of this protocol is to demonstrate how to install required instrumentation and collect samples for chemical analysis during integrated field lysimetry and porewater sampling experiments.

통합 필드 Lysimetry 및 Porewater 샘플링 토양에서 화학 이동성의 평가 및 설립 식물

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to two families: Steinernematidae and Heterorhabditidae. Until now, more than 70 species have been described in the Steinernematidae and there are about 20 species in the Heterorhabditidae. The nematodes have a mutualistic partnership with Enterobacteriaceae bacteria and together they act as a potent insecticidal complex that kills a wide range of insect species.
Herein, we focus on the most common techniques considered for collecting EPN from soil. The second part of this presentation focuses on the insect-baiting technique, a widely used approach for the isolation of EPN from soil samples, and the modified White trap technique which is used for the recovery of these nematodes from infected insects. These methods and techniques are key steps for the successful establishment of EPN cultures in the laboratory and also form the basis for other bioassays that consider these nematodes as model organisms for research in other biological disciplines. The techniques shown in this presentation correspond to those performed and/or designed by members of S. P. Stock laboratory as well as those described by various authors.

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Entomopathogenic nematodes are soil-inhabiting roundworms that parasitize a wide range of insects. We demonstrate sampling methods used for the isolation of these nematodes from the soil using two techniques: the insect baiting and the modified White trap, for the recovery of nematodes from soil samples and infected insect cadavers, respectively.

토양 샘플링과 곤충 병원성 선충의 분리 (Steine​​rnematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

추출 및 토양의 미생물 인지질 지방산의 분석

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial communities, a relatively precise but effort-intensive technique to assay microbial community composition is phospholipid fatty acid (PLFA) analysis. PLFA was developed to analyze phospholipid biomarkers, which can be used as indicators of microbial biomass and the composition of broad functional groups of fungi and bacteria. It has commonly been used to compare soils under alternative plant communities, ecology, and management regimes. The PLFA method has been shown to be sensitive to detecting shifts in microbial community composition.
An alternative method, fatty acid methyl ester extraction and analysis (MIDI-FA) was developed for rapid extraction of total lipids, without separation of the phospholipid fraction, from pure cultures as a microbial identification technique. This method is rapid but is less suited for soil samples because it lacks an initial step separating soil particles and begins instead with a saponification reaction that likely produces artifacts from the background organic matter in the soil. 
This article describes a method that increases throughput while balancing effort and accuracy for extraction of lipids from the cell membranes of microorganisms for use in characterizing both total lipids and the relative abundance of indicator lipids to determine soil microbial community structure in studies with many samples. The method combines the accuracy achieved through PLFA profiling by extracting and concentrating soil lipids as a first step, and a reduction in effort by saponifying the organic material extracted and processing with the MIDI-FA method as a second step.

The article describes a method that increases throughput while balancing effort and accuracy for extraction of lipids from the cell membranes of microorganisms for use in characterizing both total lipids and the relative abundance of indicator lipids to determine soil microbial community structure in studies with many samples.

많은 샘플을 이용한 실험에서 토양 미생물을 특성화하기위한 지질 추출 및 분석 방법

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA sequences identified using computer software. Nanopore DNA sequencing is a flexible technique that allows for rapid microbial genome sequencing to identify bacterial and viral species, to characterize bacterial strains, and to detect genetic mutations that confer resistance to antibiotics. The advantages of nanopore sequencing (NS) for life sciences include its low complexity, reduced cost, and rapid real-time sequencing of purified genomic DNA, PCR amplicons, cDNA samples, or RNA. NS is an example of "strand sequencing" which involves sequencing DNA by guiding a single stranded DNA molecule through a nanopore that is inserted into a synthetic polymer membrane. The membrane has an electrical current applied across it, so as the individual bases pass through the nanopore the electrical current is disrupted to varying degrees by the four nucleotide bases. The identification of each nucleotide occurs by detecting the characteristic modulation of the electrical current by the different bases as they pass through the nanopore. The NS system consists of a handheld, USB powered portable device and a disposable flow cell that contains a nanopore array. The portable device plugs into a standard laptop computer that reads and records the DNA sequence using computer software.

Nanopore technology for sequencing biomolecules has wide applications in the life sciences, including identification of pathogens, food safety monitoring, genomic analysis, metagenomic environmental monitoring, and characterization of bacterial antibiotic resistance. In this article, the procedure for metagenomic soil DNA sequencing for species identification using the nanopore sequencing technology is demonstrated.

Metagenomic 토양 분석 Nanopore DNA 시퀀싱

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling in soils, to pathogen competition, plant growth promotion, and cross-kingdom signaling. Furthermore, siderophores are also of commercial interest in bioleaching and bioweathering of metal-bearing minerals and ores. A rapid, cost effective, and robust means of quantitatively assessing siderophore production in complex samples is key to identifying important aspects of the ecological ramifications of siderophore activity, including, novel siderophore producing microbes. The method presented here was developed to assess siderophore activity of in-tact microbiome communities, in environmental samples, such as soil or plant tissues. The samples were homogenized and diluted in a modified M9 medium (without Fe), and enrichment cultures were incubated for 3 days. Siderophore production was assessed in samples at 24, 48, and 72 hours (h) using a novel 96-well microplate CAS (Chrome azurol sulphonate)-Fe agar assay, an adaptation of the traditionally tedious and time-consuming colorimetric method of assessing siderophore activity, performed on individual cultivated microbial isolates. We applied our method to 4 different genotypes/Lines of wheat (Triticum aestivum L.), including Lewjain, Madsen, and PI561725, and PI561727 commonly grown in the inland Pacific Northwest. Siderophore production was clearly impacted by the genotype of wheat, and in the specific types of plant tissues observed. We successfully used our method to rapidly screen for the influence of plant genotype on siderophore production, a key function in terrestrial and aquatic ecosystems. We produced many technical replicates, yielding very reliable statistical differences in soils and within plant tissues. Importantly, the results show the proposed method can be used to rapidly examine siderophore production in complex samples with a high degree of reliability, in a manner that allows communities to be preserved for later work to identify taxa and functional genes.

We present a protocol for rapid screening of environmental samples for siderophore potential contributing to micronutrient bioavailability and turnover in terrestrial systems.

환경 샘플에서 높은 처리량 Siderophore 심사: 식물 조직, 대량 토양, 및 Rhizosphere 토양

Siderophores (low-molecular weight metal chelating compounds) are important in various ecological phenomenon ranging from iron (Fe) biogeochemical cycling ...

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. A stable isotope approach is necessary to follow and quantify the fate of fertilizer derived N (FDN) through the soil-crop system. The purpose of this paper is to describe a small-plot research&#160;design utilizing non-confined 15N enriched microplots for multiple soil and plant sampling events over two growing seasons and provide sample collection, handling, and processing protocols for total 15N analysis. The methods were demonstrated using a replicated study from south-central Minnesota planted to corn (Zea mays L.). Each treatment consisted of six corn rows (76 cm row-spacing) 15.2 m long with a microplot (2.4 m by 3.8 m) embedded at one end. Fertilizer-grade urea was applied at 135 kg N&#8729;ha-1 at planting, while the microplot received urea enriched to 5 atom % 15N. Soil and plant samples were taken several times throughout the growing season, taking care to minimize cross-contamination by using separate tools and physically separating unenriched and enriched samples during all procedures. Soil and plant samples were dried, ground to pass through a 2 mm screen, and then ground to a flour-like consistency using a roller jar mill. Tracer studies require additional planning, sample processing time and manual labor, and incur higher costs for 15N enriched materials and sample analysis than traditional N studies. However, using the mass balance approach, tracer studies with multiple in-season sampling events allow the researcher to estimate FDN distribution through the soil-crop system and estimate unaccounted-for FDN from the system.

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

A microplot design for 15N tracer research is described to accommodate multiple in-season plant and soil sampling events. Soil and plant sample collection and processing procedures, including grinding and weighing protocols, for 15N analysis are put forth.

15개의질소 분석을 위한 마이크로플롯 설계 및 식물 및 토양 샘플 준비

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. ...

Two-Dimensional Visualization and Quantification of Labile, Inorganic Plant Nutrients and Contaminants in Soil

We describe a method for two-dimensional (2D) visualization and quantification of the distribution of labile (i.e., reversibly adsorbed) inorganic nutrient (e.g., P, Fe, Mn) and contaminant (e.g., As, Cd, Pb) solute species in the soil adjacent to plant roots (the &#8216;rhizosphere&#8217;) at sub-millimeter (~100 &#181;m) spatial resolution. The method combines sink-based solute sampling by the diffusive gradients in thin films (DGT) technique with spatially resolved chemical analysis by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS). The DGT technique is based on thin hydrogels with homogeneously distributed analyte-selective binding phases. The variety of available binding phases allows for the preparation of different DGT gel types following simple gel fabrication procedures. For DGT gel deployment in the rhizosphere, plants are grown in flat, transparent growth containers (rhizotrons), which enable minimal invasive access to a soil-grown root system. After a pre-growth period, DGT gels are applied to selected regions of interest for in situ solute sampling in the rhizosphere. Afterwards, DGT gels are retrieved and prepared for subsequent chemical analysis of the bound solutes using LA-ICP-MS line-scan imaging. Application of internal normalization using 13C and external calibration using matrix-matched gel standards further allows for the quantification of the 2D solute fluxes. This method is unique in its capability to generate quantitative, sub-mm scale 2D images of multi-element solute fluxes in soil-plant environments, exceeding the achievable spatial resolution of other methods for measuring solute gradients in the rhizosphere substantially. We present the application and evaluation of the method for imaging multiple cationic and anionic solute species in the rhizosphere of terrestrial plants and highlight the possibility of combining this method with complementary solute imaging techniques.

This protocol presents a workflow for sub-mm 2D visualization of multiple labile inorganic nutrient and contaminant solute species using diffusive gradients in thin films (DGT) combined with mass spectrometry imaging. Solute sampling and high-resolution chemical analysis are described in detail for quantitative mapping of solutes in the rhizosphere of terrestrial plants.