Nitya 자이나교는 NIH/NIAID 경력 전환 상 1K22AI116661-01에 의해 지원 되었다.

모든 동물 절차 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 매사 추세 츠 종합 병원에서 준수와의 수행 했다.
주의:이 프로토콜 클래스 3b 레이저 (LG3)의 사용을 포함. LG3 레이저 안전 고글이이 레이저를 작동 하는 경우에 항상 사용 해야 합니다. 적절 한 교육 및 안전 지침 부상의 위험을 피하기 위해 따라야 합니다.
1. 디자인 및 레이저
<ol><li>라이트-발광 다이오드 (LED)를 연결 (405 nm, 19.3 mW, 1400 mA, 섬유 결합) 하는 LED 드라이버를 통해 오는 4 핀 M8 커넥터 케이블 LED에 연결. 조심 스럽게 연결 고정 하는 나사를 조입니다.</li>
	<li>Optogenetics 패치 케이블 LED를 연결 하기 전에 커넥터를 잡고 LED의 최대 개방 거기 있도록 빛은 볼 수 없는 장애물. 필요한 경우 이물질을 제거 하 여 optogenetics 패치 케이블을 삽입 구멍에 불어.</li>
	<li>커넥터 슬리브의 한쪽 끝에는 정을 삽입 하 여 섬유 광섬유 정 optogenetics 패치 케이블을 연결 합니다. 패치 케이블을 커넥터 슬리브의 다른 쪽 끝을 연결 합니다.  연결을 보호 하지만 구부리거나 광섬유를 정 맥에 휴식을 조심 하는 충분 한 압력을 적용 합니다. 참고: 연약한 섬유 광섬유 정 맥으로 덮여 있다 보호 모자 때마다 레이저 사용 되지 않습니다.</li>
	<li>0과 1.2 A. 설정 전류 제한에 지속적인 조정 손잡이와 연속파 (CW) 모드를 설정 하는 LED 드라이버</li>
</ol>2입니다. 결 장에서 세포의 Photoconversion
참고: 남성 및 여성 쥐 intracolonic 405 nm 빛에 드러낸 그들의 출생 후 1-2 일 및 나이의 1 주 전에 희생 되었다.
<ol><li>전원 콘센트에 대 한 액세스와 함께 어두운 위치를 확보. LED 드라이버를 콘센트에 꽂습니다. 참고:이 절차에서에서 수행 됩니다 최소한의 하얀 빛으로 주위 빛에 쥐의 긴 노출 셀의 원치 않는 photoconversion를 발생할 수 있습니다. 레드 빛 대신 사용 됩니다. 주의: 다음 단계는 동물 마 취의 사용을 포함 한다. 마 취의 관리 클래스 II 후드에서 또는 다른 적절 한 청소 시스템을 사용 하 여 일어난다. 현기증, 졸음, 또는 심지어 무 의식 흡입 마 취의 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>4-5 %isoflurane 유도 상자에 100% o 2에 노출에 의해 마우스를 anesthetize. 단단히 꼬 집는 뒷 발 (응답) 하 여 마 취의 적절 한 깊이 확인 합니다. 약 2 %isoflurane 코 콘을 통해 마 취를 유지 합니다. 적절 한 후드 또는 마 취 청소 장치를 사용 하 여 처리기 isoflurane 노출을 방지 합니다.</li>
	<li>위치 1을 사용 하 여 intracolonic 노출에 대 한 마 취 마우스 손을 아저씨는 검지 손가락과 엄지손가락으로 부드럽게 마우스의 뒷면. 복 부를 노출 하는 마우스를 넘겨. 마우스의 핑크 색상을 잃고 시작 하는 경우 또는 호흡 속도 천천히 시작 하는 경우는 그립을 풉니다. 반지와 작은 손가락 사이의 마우스의 꼬리를 보호 합니다.</li>
	<li>다른 한편으로는 정 맥에서 보호 캡을 제거 합니다. 유지 하면서 정 마우스의 중간에 평행의 긴 축 부드럽게 삽입 항문을 통해 섬유 광섬유 정 콜론으로 광섬유의 모든 5 m m 마우스 안에 있습니다. 참고:이 절차는 천천히, 그리고 신중 하지 저 승 벽 구멍을 수행 됩니다. 분은 정의 왜곡 하 고 방도 에이즈 콜론으로 발전.</li>
	<li>안전 고글을 착용 하 고 최대 값 (모든 방법 시계 방향으로) 현재 레이저를 증가. 마우스의 반투명 복 부에 보고 하 여 UV 빛의 존재를 확인 합니다. 참고: LG3 레이저 안전 고글은 극적으로 가시성을 감소. 동료 (입고 보호 장비) 레이저에서 고글을 donning 및 도움이 있다.</li>
	<li>노출 2 분 철수 정 약 1 m m의 총 빛 레이저에 콜론 모든 30의 빛에 노출 luminal 영역을 최대화 하기 위해. 2 분의 끝에, 해제 레이저.</li>
	<li>천천히 마우스에서은 정을 제거 합니다. 빈 따뜻한 케이지 마 취에서 회복 후, 홈 케이지를 마우스를 반환 합니다.</li>
</ol>3입니다. 창 자 세포의 고립
<ol><li>행 크의 균형 소금 솔루션/송아지 혈 청 (HBSS/CS) 버퍼의 1 L, 상피 스트립 버퍼의 200 mL, 500 mL의 세척 미디어, 그리고 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 200 mL를 준비-무료 세척 미디어. 참고: 시 약 볼륨 9의 샘플 크기에 대 한 계산 됩니다.<ol>
<li>HBSS 950 mL에 CS의 50 mL를 추가 하 여 (HBSS; 5 %CS) HBSS/CS 버퍼를 확인 합니다. 얼음에 그것을 저장 합니다.</li>
		<li>CS, 1 M DTT, 0.5 M EDTA의 2 mL 및 1 M HEPES 버퍼의 3 mL 200 µ L의 10ml 185 mL을 추가 하 여 상피 스트립 버퍼 [HBSS, 5 %CS, 1 m m dithiothreitol (DTT); 5 mM EDTA, 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic 산 (HEPES) (pH 7.2-7.5)]를 준비 HBSS의. 37 ° C 물 욕조에 상피 스트립 버퍼를 놓습니다.</li>
		<li>HBSS 494 mL에 CS의 5 mL 및 0.5 M EDTA의 1 mL을 추가 하 여 세척 미디어 (HBSS; 1% CS 1 mM EDTA)를 확인 합니다. 실 온에서 보관 합니다.</li>
		<li>HBSS 195 mL에 2 mL의 CS와 1 m HEPES 3 mL를 추가 하 여 EDTA 무료 세척 미디어 (HBSS; 1% CS 15 mM HEPES)를 준비 합니다. 실 온에서 보관 합니다.</li>
		<li>FACS 버퍼 만들기 [버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1 (pH 7.2 =); 2 %CS] CS의 10 mL PBS의 490 mL에 추가 하 여. 얼음에 그것을 저장 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>60 x 10 m m 문화 접시 안에 70 µ m 셀 스 트레이너를 배치 하 여 조직 컬렉션 접시를 준비 합니다. 접시에 HBSS/CS 버퍼 (HBSS; 5 %CS 버퍼 단계 3.1.1에서에서 만든 및 얼음에 저장 된)의 10 mL를 추가 하 고 얼음에 그것을 배치.</li>
	<li>마우스를 통해 적절 한 마 취의 청소를 사용 하 여 흡입된 isoflurane의 과다를 안락사 (에 약 3 분 노출 > 4% isoflurane 100% O2또는 방 공기에서). 호흡의 명백한 중단 후 반사 운동, 뒷 발을 확고 하 게 곤란 하 여 깊은 고통의 부재를 확인 (집게를 사용 하는 것이 좋습니다). 수술가 위 또는 새로운 면도칼을 사용 하 여 잘린 통해 안락사 확인 합니다. 참고: 자 궁 경부 전위 크기와 동물의 나이 때문에이 단계에 대 한 권장 하지 않습니다. 이러한 방법은 안락사에 AVMA 지침을 2013와 일치 되며 MGH IACUC에 의해 승인.</li>
	<li>복 부를 열고 깨끗 한 집게와가 위를 사용 하 여 콜론을 수확. 마우스의 복 부를 노출 콜론의 1 측에 내장을 반영 합니다. 먼저 그것은 단지 (항문)으로 원심 transecting에 의해 전체 콜론 제거 맹 하. 그런 다음 집게와 콜론을 단단히 잡고, 항문에 요도 통해 잘라가 위를 사용 합니다. 최대한 항문 주변으로 콜론을 잘라. 콜론을 제거 후 비장 수확 (4.1-4.2 아래 단계를 참조). 참고: photoconversion 프로토콜만 신생아의 콜론 (섬유 광섬유 정 5 m m)의 25%를 대상으로, 하는 동안 전체 콜론 셀 격리에 도움이 수확 이다.</li>
	<li>결 장 그리고 건조 종이 타월에 내용을 밀어 집게를 사용 하 여 콜론을 청소. 조직 문화 접시의 커버에 붙여넣기 콜론 잘게 잘라를 다음 페 트리 접시에 셀 스 트레이너를이 붙여넣기를 전송 면도날을 사용 하 여 균질.</li>
	<li>깨끗 한 8 m m 긴 자기 저 어 바는 여과기를 추가 하 고 9 위치 자력 접시에 접시를 놓고. 800 rpm에 자석 볶음 바 속도 설정 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 셀을 품 어. 버퍼를 삭제 하 고 HBSS/cs (는 HBSS; 5 %CS 버퍼 단계 3.1.1에서에서 만든 및 얼음에 저장 된) 10 mL를 사용 하 여 세척을 반복 합니다. 세척 후에 버퍼를 삭제 합니다.</li>
	<li>셀 스 트레이너를 prewarmed 상피 스트립 버퍼 (는 HBSS, 5 %CS, 1mm DTT; 5 mM EDTA, 15 mM HEPES [pH 7.2-7.5] 버퍼 하 단계 3.1.2에서 37 ° C 물 욕조에 저장)의 10 mL를 추가 하 여 상피 세포를 분리 하 고 800 rpm는 3에서 30 분 저 어 7 ° C 인큐베이터입니다. 보육의 끝에, 깨끗 한 15 mL 튜브에 상피 분수에서 풍성 하 게 하는 버퍼를 전송 합니다. 참고: 상피와 관련 된 셀 (장 상피 세포 및 장 상피 세포)는 발표는 버퍼에 그대로 lamina propria 에 셀11단계 동안 셀 스 트레이너에서 남아 있는 동안.<ol>
<li>실 온에서 5 분 동안 700 x g에서 농축된 장 상피 분수 (IELs) 원심 삭제는 상쾌한 고 FACS 버퍼의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 3.15 단계에서 사용 하기 위해 얼음에 그것을 저장 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>셀 스 트레이너 2 내 lamina propria 분수를 씻어 HBSS/CS와 x. 이렇게 하려면 셀 스 트레이너를 HBSS/CS 솔루션 (HBSS, 얼음에 저장 된 단계 3.1.1에서에서 만들어진 5 %CS 버퍼) 10 mL를 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 5 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 각 세척 후 버퍼를 삭제.</li>
	<li>샘플 2 세척 세척 미디어에 x. 셀 스 트레이너를 세척 미디어 (HBSS; 1% CS 1 mM EDTA 버퍼를 단계 3.1.3에서 실내 온도에 저장) 10 mL를 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 15 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 각 세척 후 버퍼를 삭제.<ol>
<li>사용 후 세척 미디어, 단계 3.14에서에서 사용에 대 한 얼음에 저장 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>샘플 2 세척 HBSS x/CS. 셀 스 트레이너를 HBSS/CS 버퍼 (HBSS; 5 %CS 버퍼 단계 3.1.1에서에서 만든 얼음에 저장 되어 있는)의 10 mL를 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 5 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 각 세척 후 버퍼를 삭제.</li>
	<li>EDTA 무료 워시 버퍼에서 조직 품 어. 셀 스 트레이너를 EDTA 무료 워시 버퍼 (HBSS; 1% CS 15 mM HEPES 버퍼를 단계 3.1.4에서 실내 온도에 저장)의 10 mL를 추가 하 고 교 반 하지 않고 실 온에서 10 분 동안 접시를 품 어. 이 단계의 끝에 버퍼를 삭제 합니다.</li>
	<li>워시 샘플 2 x HBSS/CS 효소 솔루션을 준비 하 고. HBSS/cs (HBSS; 5 %CS 버퍼 단계 3.1.1 얼음에 저장 된에서) 10 mL를 추가할 셀 스 트레이너를 버퍼링 하 고 37 ° C 배양 기에서 10 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 각 세척 후 버퍼를 삭제.<ol>
<li>효소 솔루션 준비 (씻고 EDTA 무료 버퍼; 0.1 mg/mL DNase 나; 167 mg/mL 콜라) 두 번째 세척 기간 동안: 9 밀리 그램을 추가 DNase의 나, EDTA 무료의 90 mL을 동결 건조 된 콜라의 15 mg 세척 버퍼. 실 온에서 솔루션을 저장 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Lamina propria 분수 lamina propria 림프 톨 (LPLs)을 얻기 위해 셀 여과기에 포함 된 소화. 효소 솔루션의 10 mL를 추가 (EDTA 무료 워시 버퍼; 0.1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL 콜라 버퍼 3.12.1 단계에서 만든 및 실내 온도에 저장) 셀 스 트레이너를 37 ° C 배양 기에서 45 분 800 rpm에서 그것을 저 어. 참고: LPLs 효소 소화 후 솔루션으로 해제 됩니다.<ol>
<li>셀을 포함 하는 효소 솔루션을 수집 하 고 50 mL 원뿔 관으로 새로운 셀 스 트레이너를 통해 필터링.</li>
	</ol></li>
	<li>효소 솔루션에서 콜라 활동을 차단 하는 필터링 된 셀에 차가운 세척 미디어 (는 HBSS; 1% CS 1 mM EDTA 버퍼링 단계 3.1.3에서에서 만들어지고 저장 단계 3.9.1에서에서 얼음에) 20 mL를 추가 합니다. 실 온에서 6 분 700 x g에서 튜브 원심 삭제는 상쾌한 고 resuspend FACS 버퍼의 1 mL에 LPLs를 포함 하는 펠 릿.</li>
	<li>(3.7.1 단계)에서 IEL과 (3.14 단계)에서 LPL 분수 결합 하 고 흐름 cytometric 분석에 대 한 형광 활용 된 항 체와 그들을 얼룩 (단계 5 참조). 참고: IEL와 LPL 분수 수 있습니다 얼룩이 질 별도로 구획 정보를 원하는 경우.</li>
</ol>4입니다. 비장에서 세포의 고립
<ol><li>Microcentrifuge 튜브에 FACS 버퍼의 500 µ L을 추가 하 여 컬렉션 튜브를 준비 합니다. 얼음에 그것을 저장 합니다.</li>
	<li>콜론 (3.4 단계)를 제거한 후 전체 비장을 수확 하 고 컬렉션 튜브에 배치 합니다. 얼음에 조직을 저장 합니다.</li>
	<li>실내 온도 상쾌한 떨어져 aspirate에서 5 분에 대 한 300 x g [마이크로 원심 분리기]에서 샘플 약 1 분 원심 분리기에 대 한 microcentrifuge 튜브에 비장 균질 전기 조직 균질 화기를 사용 하 여.</li>
	<li>삼투성 세포에 의해 세포 죽음을 시작 하려면 염화 염화 칼륨 (ACK) 세포의 용 해 버퍼의 500 µ L에서 샘플을 resuspending 하 여 적혈구 세포를 수행 합니다. 실 온에서 1-2 분을 품 어 다음 FACS 버퍼의 725 µ L에서 resuspend을 샘플을 수 있습니다.</li>
	<li>실내 온도 상쾌한 떨어져 aspirate에서 5 분에 대 한 300 x g [마이크로 원심 분리기]에서 샘플 원심 FACS 버퍼의 500 µ L에 펠 릿을 resuspend 하 고 새로운 microcentrifuge 튜브로 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 필터링. 새로운 microcentrifuge 튜브 전체 샘플 전송 및 흐름 cytometric 분석에 대 한 형광 활용 된 항 체와 얼룩 (단계 5 참조).</li>
</ol>5. Dendra-r+ 세포를 사용 하 여 흐름 Cytometry 식별
<ol><li>실내 온도 상쾌한 떨어져 aspirate에서 5 분에 대 한 300 x g [마이크로 원심 분리기]에서 IEL/LPL, 비장 샘플 원심</li>
	<li>믹스를 얼룩이 지는 항 체의 100 µ L에 산 탄을 resuspend. 샘플 당 FACS 버퍼의 100 µ L를 붙일 활용 된 안티 CD45 항 체의 1 µ L을 추가 하 여 혼합을 얼룩이 지는 항 체를 준비 합니다. 참고: 적정 항 체 사용 실험 전에 cytometry 최적 농도 결정 하기 위해 채도 바인딩 발생 합니다 중요 하다.</li>
	<li>(어두운 곳)에 얼음에 35 분 샘플을 품 어.</li>
	<li>FACS 버퍼의 300 µ L에서 샘플을 resuspend 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g [마이크로 원심 분리기]에서 원심. 발음은 상쾌한 고 FACS 버퍼의 325 µ L에서 샘플을 resuspend. 교류 cytometer에 샘플을 분석 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

상호 작용 하 고 결 장에서 microbiota에 의해 영향을 하는 셀의 특성을 확인 하 고 중요 하 고 어떻게 막 microenvironment에서 정보는 시체의 나머지 부분에 릴레이의 이해를 촉진 한다. 창 자 관련 셀 마이그레이션 공부에 대 한 한 가지 방법은 그들의 조직을 추적 패턴12,13함수를 받는 쥐로 입양 전송 다음 창 자 관련 된 세포의 필요 합니다. 이 접근은 제한으로 전송 된 특정 셀 종류만을 추적할 수 있습니다. 또한, 조직 및 정화 과정에서 세포의 고립에서 발생 하는 아티팩트 vivo에서 철새 프로세스를 방해 수 있습니다. 더 많은 최근 내 시경 photoconversion 프로토콜 창 자 세포가 마우스를 사용 하 여 라벨을 보고14이었다. 이 연구는 성인 쥐에 백혈구는 소장에서의 광범위 한 매매 발견.
우리의 보고서 레이블 셀 신생아 쥐의 콜론에 메서드를 설명 하 고 비장 등 장 외 사이트에 그들의 이동 추적. 팜과excised 마우스 photoconvertible 그린 형광 Dendra2 단백질은 돌이킬 전환 정품 인증 시 빨간색 형광 UV 빛에 의해 표현 하는 편. 신생아 쥐의 콜론의 405 nm 빛에 노출 표시 모두 CD45+ 조 혈 및 CD45neg 비 조 혈 세포. CD45++ Dendra2-레드 셀 비장에 발견 된 photoconversion, 조 혈 모 세포의 여분 장 마이그레이션 나타내는 후 3 ~ 5 일.
이 분석 결과 대 한 속도 제한 단계는 저 승 지역 405 nm 빛에 노출 되는의 일부분 이다. 신생아 콜론의 취약성 및의 자의 존재 임에도 불구 하 고 최소한의이 이른 나이에 삽입할 수 있는 섬유 광섬유 정 맥의 길이 제한 합니다. 이전 실험에서 더 이상 정 수 없습니다 성공적으로 삽입 5 m m 이상.  윤활제는 레이저 광선의 변수 빛 굴절 될 위험이 피할 했다. 정 맥의 바깥쪽 움직임 모든 30의 레이저 빛에 노출 저 승 영역을 극대화 하는 데 도움이. 중요 한 것은, 큰 나 값으로 정 (NA = 0.5) 콜론에 빛의 넓은 콘을 생성 하는 데 사용 되었다.
이 프로토콜 신생아 (주 0-2)에 대 한 표준화는 팜과excised 새끼. 콘텐츠 및 쥐의 결 장의 길이에 변화를 주어, 기술 이전 새끼를 사용 하는 경우 그에 따라 최적화 되어야 할 것 이다. 주로, 섬유 광섬유 정 맥의 삽입 길이 photoconversion의 총 기간을 수정 해야 합니다.
결 장에서 세포의 철새 행동 이해에이 접근은 흐름 cytometric 분석에 의해 촉진 된다. 멀티 파라미터 cytometry를 더 사용할 수 있습니다 식별 하 고 형 이주 면역 세포는 CD45 내+ 세포 부분 집합. Dendra2-r+ 세포 유전자 식 프로 파일링 또는 proteomics 분석 같은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 FACS에 의해 정렬할 수 있습니다. 이 연구에서는 콜론 하위 집합 조 혈 세포의 이해로 이동 하는 동안 메서드는 두뇌와 피부를 포함 하 여 추가 조직 사이트에서 세포 이동 공부에 적응 수 있습니다.

포유류 위장 항만 호스트1과 공생 관계에 존재 하는 박테리아의 종의 수백. 면역 세포 로컬 환경에 이러한 미생물과 평화공존을 적용 하 고 병원 체 침입에 대 한 보호벽을 설치. 따라서, 면역 세포와는 microbiota 간의 양방향 상호 작용은 숙주 면역 체계를 교육 하 고 병원 체를 면역 반응에 대 한 임계값을 설정 하는 공생 공동체 확립을 중요 합니다. 미생물 또는 dysbiosis, 구성, 수에서 변경 면역 항상성 교란 및 면역 중재 질병 타입-1 당뇨병 및 IBD2,3 로 이어지는 장 염증을 억제 하는 규제 회로 교란 .
기간 출생은 장내 미생물 지역 사회 동시에 면역 체계를 구축 하기 시작 하는 독특한 발달 창 후에 즉시4성숙. 출생 후 microbiota 안정, 자연스럽 게 발생 하는 지역 사회 구성 및 자주5의 변화 되지 않습니다. 면역 세포는 microbiota와 상호 작용 하는 두 가지 해 부 위치 내장-에서 lamina propria 와6장 상피에서 상주 합니다. 수많은 종류의 면역 세포 (수지상 세포, monocytes, 대 식 세포 등) 골수성 세포 뿐만 아니라 림프 톨 (T 세포, B 세포, 타고 난 림프 세포 등)을 포함 한 소장에 있습니다. 이러한 세포, 조 혈 모 세포로 알려진 다양 한 장 벽을 유지 하 고 항상성 유지 기능을 수행 합니다.
그들의 규정 하는 기능 장의 사이트에서 뿐만 아니라 점 막의 면역 세포 조직의 면역7,,89규제 미생물 메시지 여분 장 사이트를 반입할 수 있습니다. 성장 연구 관심 분야 이며 그들의 기능을 조사 하기 위해 장 조직을 마이그레이션할 면역 세포를 식별 하는 방법에 대 한 필요성을 강조. 여기 보고 프로토콜 레이블 셀에 photoconvertible 형광 단백질은 악용 상용 마우스 모델을 이용 한다. 팜과excised 쥐 편은 레스터 전환 활성화 시 빨간색 형광 자외선 (UV) 빛10녹색 형광 Dendra2 단백질을 표현 한다. 섬유 광섬유 정을 사용 하 여 신생아 쥐의 콜론에 405 nm 빛을 제공 하는에서 유래 했거나 콜론 통해 통과할 photoconverted 조 혈 모 세포는 비장에서 찾을 수 있습니다 설명 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:873px;" width="874">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:873px;">Laser</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:259px;">Light Emitting Diode (LED)</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">M405FP1</td>
			<td style="width:247px;">CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:259px;">LED driver</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">LEDD1B</td>
			<td style="width:247px;">Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:259px;">Optogenetics patch cable</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">M87L01</td>
			<td style="width:247px;">1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&#38;pn=M87L01#11454</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:259px;">Fiber optic cannula</td>
			<td style="width:201px;">Doric lenses&#160;</td>
			<td style="width:167px;">MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td>
			<td style="width:247px;">5 mm long cannula with an outer diameter of 500 &#181;m and an inner diameter of 480 &#181;m. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">Power supply</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">KPS101</td>
			<td style="width:247px;">Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:259px;">LG3 laser safety goggles&#160;</td>
			<td style="width:201px;">THORLABS</td>
			<td style="width:167px;">LG3</td>
			<td style="width:247px;">Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&#38;pn=LG3#2523</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Red light&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>74327-10</td>
			<td style="width:247px;">15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:873px;">Intestinal cell isolation</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:259px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:201px;">Patterson Veterinary</td>
			<td style="width:167px;">07-893-1389</td>
			<td style="width:247px;">CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.&#160; https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:259px;">1X HBSS</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td style="width:167px;">14025076</td>
			<td style="width:247px;">Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&#38;searchTerm=14025076&#38;searchType=RAPID&#38;matchedCatNo=14025076</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Calf Serum</td>
			<td style="width:201px;">Hyclone AZM</td>
			<td style="width:167px;">197696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:259px;">EDTA</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:167px;">15575020</td>
			<td style="width:247px;">0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:259px;">DTT</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">10197777001</td>
			<td style="width:247px;">CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:259px;">HEPES</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td style="width:167px;">15630080</td>
			<td style="width:247px;">1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:259px;">Petri dish</td>
			<td style="width:201px;">Corning</td>
			<td style="width:167px;">353004</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&#38;searchTerm=08772F&#38;searchType=RAPID&#38;matchedCatNo=08772F</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">70 micron cell strainer</td>
			<td style="width:201px;">Falcon</td>
			<td style="width:167px;">352350</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:259px;">Micro magnetic stir bar</td>
			<td style="width:201px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:167px;">1451364</td>
			<td style="width:247px;">Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:259px;">Magnetic stir plate</td>
			<td style="width:201px;">Corning Laboratory Stirrers</td>
			<td style="width:167px;">440826</td>
			<td style="width:247px;">https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&#38;persist=true&#38;ip=no&#38;gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:259px;">Collagenase</td>
			<td style="width:201px;">Roche</td>
			<td style="width:167px;">5401020001</td>
			<td style="width:247px;">https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&#38;region=US&#38;gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">DNase I</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">10104159001</td>
			<td style="width:247px;">https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">1X PBS</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td style="width:167px;">20012-027</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:259px;">Pipet aid</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:167px;">14387165</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">10 mL serological pipet</td>
			<td style="width:201px;">Falcon</td>
			<td style="width:167px;">357530</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">25 mL serological pipet</td>
			<td style="width:201px;">Falcon</td>
			<td style="width:167px;">357515</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:167px;">339651</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:259px;">50 mL conical centrifuge tube</td>
			<td style="width:201px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:167px;">339653</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:873px;">Single cell suspension</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:201px;">Seal-Rite</td>
			<td style="width:167px;">1615-5500</td>
			<td style="width:247px;">Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:259px;">Tissue homogenizer&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Kimble</td>
			<td>K7495400000</td>
			<td style="width:247px;">Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:259px;">Homogenizer tips&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Kimble</td>
			<td style="width:167px;">7495210590</td>
			<td style="width:247px;">Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td style="width:167px;">A10492-01</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:259px;">40 micron cell strainer</td>
			<td style="width:201px;">Falcon</td>
			<td style="width:167px;">08-771-1</td>
			<td style="width:247px;">https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:873px;">Antibodies</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:259px;">BV786 anti-mouse CD45&#160;</td>
			<td style="width:201px;">BD</td>
			<td style="width:167px;">564225</td>
			<td style="width:247px;">Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Live/Dead</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34962</td>
			<td style="width:247px;">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Other</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Razor blades</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td style="width:247px;">Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo photolabeling of cells in the colon to assess migratory potential of hematopoietic cells in neonatal mice

장의 세균 지역 사회는 인생에서 일찍 고 면역 전지 개발 및 기능에 영향을 미칠. 신생아 microbiota 항생제 사용과 다이어트, 면역 및 염증 성 질병에 자화 율에 미치는 영향을 포함 하 여 수많은 외부 영향을 받기 쉽습니다. 장애 선 동적인 장 질병 (IBD) 등 내장에 면역 세포의 대규모 유입에 의해 특징. 그러나, 면역 세포는 microbiota에 의해 조절 또한 여분 장 사이트에 면역 반응에 영향을 창 자에서 이주 수 있습니다. 따라서, 식별 하 고 원심 사이트에 창 자에서 미생물 메시지를 전달 수 있습니다 셀을 특성화 하는 필요가 있다. 여기, 우리 신생아 쥐에 vivo에서 마이그레이션 후 장 외 사이트에 그들의 식별을 가능 하 게의 콜론에 레이블 셀 하는 방법을 설명 합니다.

광섬유 케이블은 2 일 오래 된 팜과excised 쥐의 콜론에 405 nm 빛을 전달 하기 위해 사용 되었다. 이전 실험에서 30 s 노출 최소 세포 (그림 1A) 독성 결 장 세포의 최대 photoconversion에 게 결정 했다. 따라서, 콜론의 다른 세그먼트의 순차 30 s 노출 프로토콜에 설명 된 대로 실시 했다. 레이저 노출에 따라 쥐 즉시 안락사 했다, 그리고 셀의 photoconversion 결정 했다. 총 결 장 조직의 단일 셀 준비 했다 형광 활용 된 안티 CD45 항 체로 얼룩진 고 흐름 cytometric 분석 photoconversion를 검출 하기 위하여 수행 되었다. 비전향 Dendra2-그린 (Dendra-g) 각각 490 553 nm에서 여기 및 방출 맥시 마는 단백질과 photoconverted Dendra2-레드 (Dendra-r) 단백질 507 573 nm에서 여기 및 방출 맥시 마는 반면 FITC 채널에서 검출 될 수 있다 각각의 교류 cytometer PE 채널에 검출 될 수 있습니다. 레스터 빨간 형태로 전환, 일단 Dendra2은 높은 photostable 및 장기 추적 응용 프로그램에 유용.
Dendra-r+ 셀 unlasered 마우스 (그림 1B 왼쪽)에서 발견 되었다. 그러나, 405 nm 빛 노출 귀착되 었 다 CD45neg CD45에 뚜렷한 Dendra-r+ 세포 인구+ 세포 구획 (그림 1B 오른쪽). 저 승 photoconversion 프로토콜 장 외 사이트에서 셀의 배경 라벨에 한 경우, 우리가 수확 spleens 새로 photoconverted 쥐에서 확인 하려면 (T = 0) cytometry에 의해 Dendra-r+ 세포에 대 한 분석 및. Dendra-r+ 셀 CD45neg 또는 CD45에서 발견 된+ 세포 구획그림 1(C), 내 저 승 레이저 빔 photolabel 셀 비장에 충분히 침투 하지 않았다 제안. 따라서, 비장에는 마이그레이션에 대 한 시간 후 감지 Dendra-r+ 셀 (T = 3d, 5d) 콜론에서 유래 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57929/57929fig1.jpg"> 그림 1 : Vivo에서 저 승 조직 photoconversion. 2 일 오래 된 팜과excised 새끼에서 콜론의 세포 30에 대 한 내 저 승 405 nm 빛에 드러낸 s 설명. photoconversion와 셀 라벨 절차 후 즉시 결정 되었다 (T = 0) 저 승 조직과 비장의 단일 셀 준비의 흐름 cytometric 분석에 의해. (A)이 대표적인 흐름 cytometric 점 줄거리의 CD45 식을 보여 줍니다 (x-축) 살고 죽은 염료의 얼룩이 지 고 (y-축) 제어와 레이저 마우스의 콜론에서 단일 셀 준비에. 패널 B 와 C 는 Dendra2-그린 단백질의 표현을 표시 하는 대표적인 흐름 cytometric 점 플롯 오버레이 (Dendra2-g, 수평 축)와 Dendra2-레드 단백질 (Dendra2-r, 수직 축) 제어 unexposed에 CD45 노출+ (조 혈) 및 CD45neg (조 혈 비) 셀 (B)에 결 장 및 (C)는 비장. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57929/57929fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
비장에 철새 셀을 식별 하는 전형적인 photoconversion 실험에서 데이터는 그림 2에 표시 됩니다. 2 일 오래 된 팜과excised 쥐의 콜론에 셀의 photoconversion는 그림 1과 같이 수행 되었다. 마우스는 노출 후 3 ~ 5 일 안락사 했다 고 비장에 Dendra-r+ 세포의 존재는 cytometry에 의해 결정 되었다. CD45neg 셀 하위 집합, CD45neg 셀은 주로 상피 보기과 일치에 Dendra-r+ 셀 및 내장의 다른 구조 세포가 있었습니다. 일부 CD45+ 조 혈 모 세포 표현 Dendra-r, 그들은 결에 photoconverted 되어 졌고 비장을 마이그레이션 제안.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57929/57929fig2.jpg"> 그림 2 : CD45+ 조 혈 모 세포는 비장에 결에서 마이그레이션할. 신생아 (주 0-2) 팜과excised 쥐 내 저 승 노출 photoconvert Dendra2 단백질에 405 nm 빛에 노출 되었다. 대표적인 교류 cytometry 플롯 표시 Dendra2-그린 단백질의 표현 (Dendra2-g, 수평 축)와 Dendra2-레드 단백질 (Dendra2-r, 수직 축) CD45neg 에 CD45+ unexposed 5 일 된 쥐의 비장 세포와 3 ~ 5 일에서 분석 하는 쥐를 노출 (T = 3d, 5d)는 photoconversion 후. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57929/57929fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

여기에 설명 된 프로토콜 여분 장 사이트에 결에서 이주 하는 면역 세포를 특별히 식별 하 신생아 쥐에 photolabeling 접근을 사용 합니다. 이 전략은 초기 생활에 호스트-미생물 상호작용 연구에 유용할 것 이다.

Vivo에서 Photolabeling 신생아 쥐에 있는 조 혈 모 세포의 이동성 잠재력을 평가 하는 콜론에 셀의

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

in-vivo-photolabeling-cells-colon-to-assess-migratory-potential

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

5.7K 조회수.  Massachusetts General Hospital. 여기에 설명 된 프로토콜 여분 장 사이트에 결에서 이주 하는 면역 세포를 특별히 식별 하 신생아 쥐에 photolabeling 접근을 사용 합니다. 이 전략은 초기 생활에 호스트-미생물 상호작용 연구에 유용할 것 이다.

비디오: In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

같은 자폐증과 정신 분열증과 같은 일반적인 장애에 드 노보 변이를 식별하는 전략

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

연구

의학

Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

C57BL/6J 마우스의 Stromal 셀 및 암종 세포 이식 내유

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

세포 추적을위한 생체 19 F MRI에서

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

자궁 원격 측정은 마우스 수축 압력을 측정하는<em&gt; 생체</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

말 건 병증에 골수 중간 엽 줄기 세포를 레이블 테크네튬 99m의 생체 ​​이미징 및 추적에서

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

동계 쥐 흑색 종 세포의 주입은 폐에서 그들의 전이성 잠재력을 확인하는 방법

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

인간 종양 이종 이식에서 마우스 세포의 고갈은 크게 대상 세포의 다운 스트림 분석을 향상

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a wide variety of disorders including metabolic diseases, premature aging syndromes, and neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD). Maintenance of mitochondrial health depends on mitochondrial biogenesis and the efficient clearance of dysfunctional mitochondria through mitophagy. Experimental methods to accurately detect autophagy/mitophagy, especially in animal models, have been challenging to develop. Recent progress towards the understanding of the molecular mechanisms of mitophagy has enabled the development of novel mitophagy detection techniques. Here, we introduce several versatile techniques to monitor mitophagy in human cells, Caenorhabditis elegans (e.g., Rosella and DCT-1/ LGG-1 strains), and mice (mt-Keima). A combination of these mitophagy detection techniques, including cross-species evaluation, will improve the accuracy of mitophagy measurements and lead to a better understanding of the role of mitophagy in health and disease.

In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice

Mitophagy, the process of clearing damaged mitochondria, is necessary for mitochondrial homeostasis and health maintenance. This article presents some of the latest mitophagy detection methods in human cells, Caenorhabditis elegans, and mice.

생체 외에서 그리고 Vivo에서 인간 세포, C. 선 충, 쥐에서 Mitophagy의 검출

Mitochondria are the powerhouses of cells and produce cellular energy in the form of ATP. Mitochondrial dysfunction contributes to biological aging and a ...