이 작품은 미국 심 혼 협회 [H.L.에 특정 0365274B]에 의해 지원 되었다 국립 암 연구소 [Z.W. GI 포자 P50CA150964], 건강의 국가 학회 [사무실의 연구 인프라 공유 계측 그랜트 S10RR031845에 가벼운 현미경 검사 법 케이스 서쪽 예비 대학에서 시설 이미지], [X.G.]를 중국 장학금 위원회. 저자는 슬라이드 스캔 빛 현미경 이미징 핵심 그의 도움에 리처드 리를 감사 합니다.

여기에 설명 된 쥐를 포함 하는 실험의 모든 케이스 서쪽 예비 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었습니다. 2016-0068 프로토콜의 제목 (PI: 화 루)은 "척추 개발에 대체 이전 mRNA 접합의 역할".
참고: 모든 장비, 시 약 및 공급이이 프로토콜에 사용 되는 정보 자료의 테이블에에서 포함 됩니다.
1. 준비 포 르 말린 고정된 파라핀 포함 (FFPE) 섹션
<ol><li>
자 궁 경부 전위에 의해 1 CD1 마우스와 1 C57BL/6J 마우스를 안락사. 조심 스럽게 잘라 오픈 수술가 위, 집게와 두개골. 특 종으로 두뇌를 제거 합니다. 참고: 5 개월 CD1 남성 생쥐와 3 개월 된 C57BL/6J 남성 마우스 사용 되었고 비슷한 결과 보였다.<ol>
<li>PBS와 뇌를 씻어. 전체 뇌 말린 솔루션 50 mL에 넣어 실 온 (RT)에서 10% 포 르 말린을 포함 하는 솔루션으로 30 h 전체 뇌를 해결.</li>
		<li>PBS를 고정 솔루션을 변경 하 고 하룻밤 4 ° c.에 PBS에 뇌를 품 어 탈수 하 고 크 실 렌 그리고 파라핀 표준 절차18를 사용 하 여 두뇌를 포함.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
톰을 사용 하 여 포함 된 조직 5 µ m 섹션으로 잘라. 첫 번째, 그리고 리본으로 45 ° C 물 욕조에 파라핀 리본 RT 물 욕조에 넣어.
	<ol>
<li>주름과 주름 리본에서 사라질 때 즉시 유리 슬라이드에 섹션을 탑재 합니다. 사용 하기 전에 60 ° C에서 1 시간에 대 한 실시간 빵 슬라이드에서 하룻밤 건조 슬라이드에 어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 샘플 전처리
<ol><li>
조직 단면도 deparaffinize 증기 두건에서 이러한 단계를 실시 합니다.
	<ol>
<li>신선한 크 실 렌과 2 100% 에탄올의 250 mL의 250 mL로 두 세척 접시 (그림 1A)를 채우십시오. 다음 표 1에 표시 된 순서 및 보육 시간 세척 요리에서 랙 세척 세척 랙 (그림 1A) 장소에 조직 슬라이드를 삽입 합니다.</li>
		<li>각 인큐베이션 기간 동안 리프트 세척 랙 아래로 3 회 이상 세척 접시에. 각 부 화 후 신속 하 게 밖으로 건조에서 조직 단면도 방지 하기 위해 다음 세척 접시에 세척 랙을 이동 합니다.</li>
		<li>부 화 단계를 완료 한 후 세척 접시에서 슬라이드와 세척 선반을 제거 합니다. 랙 슬라이드는 완전히 건조 될 때까지 또는 5 분 동안 60 ° C 인큐베이터에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>소수 성 장벽 펜 조직 단면도 둘러싼 0.75 "x 0.75" 배리어를 그립니다. 공기 건조 3 분 실시간에 대 한 장벽</li>
	<li>
분할 영역을 pretreat
	<ol>
<li>시 약 및 장비 준비<ol>
<li>교 잡 오븐 (그림 1B)를 켜고 온도를 40 ° C 사용 하기 전에 30 분 설정.</li>
			<li>증류수와 humidifying 종이 (그림 1E)를 완전히 습식 및 습도 제어 트레이 (그림 1D, 왼쪽)에 넣어. 교 잡 오븐에 습도 제어 트레이를 두십시오.</li>
			<li>10 x 대상 검색 시 약 70 mL를 dH2O의 630 mL을 추가 하 여 신선한 1 x 대상 검색 시 약의 700 mL를 준비 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>과산화 수소를 적용 합니다.<ol>
<li>벤치에 deparaffinized 슬라이드를 넣어. 완전히 커버 조직 섹션에 과산화 수소의 5-8 방울을 추가 합니다. 실시간에서 10 분 동안 품 어</li>
			<li>과산화 수소 솔루션을 한 번에 한 슬라이드를 제거 하는 흡수 성 종이의 조각에 슬라이드를 누릅니다. 즉시 세척 랙에 슬라이드를 삽입 하 고 세척 접시 가득 dH2오 랙 이동</li>
			<li>대 한 증류수에 랙을 아래로 이동 하 여 슬라이드를 씻어 3-5 시간. 세척 접시 가득 신선한 증류수 세척 슬라이드 한 번 더 세척 랙을 이동 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>대상 검색 수행<ol>
<li>뜨거운 접시에 1000 mL 유리 비 커를 놓습니다. 비 커에 700 mL 신선한 1 x 대상 검색 시 약의 추가 호 일로 다룹니다. 포 일 덮개 (그림 1C)을 통해 비 커에 온도계를 넣습니다. 핫 플레이트를 켜고 높이 10-15 분에 대 한 설정.</li>
			<li>검색 시 약의 온도 98 ° C에 도달 하면, 가벼운 종 기를 유지 하기 위해 낮은 높이에서 핫 플레이트의 온도 제어를 전환 합니다. 15 분 이상 끓여 야 하지 않습니다.</li>
			<li>한편, 신중 하 게 포 일을 열고 검색 젠 내부 조각와 세척 선반을 넣어. 다시 비 커를 커버 하 고 15 분 동안 품 어.</li>
			<li>세척 접시를 비 커에서 선반을 제거 하려면 사용 하 여 집게 dH2O와 15 린스 200ml 가득한 s.</li>
			<li>포함 하는 100% 신선한 에탄올 세척 접시 랙 이동 그리고 앉아 3 분 슬라이드를 제거 하 고 10 분 동안 60 ° C 배양 기에서 그들을 건조.</li>
		</ol>
</li>
		<li>프로 테아 제 III를 적용<ol>
<li>얼룩 랙 (그림 1D, 오른쪽)에 슬라이드를 놓습니다. 조직 커버 프로 테아 제 3의 5 방울을 추가 합니다. 조심 스럽게 랙 습도 제어 트레이 (그림 1D, 왼쪽)에 넣고 40 ° C 교 잡 오븐으로 트레이 삽입. 30 분 동안 품 어.</li>
			<li>슬라이드 랙 제거 하 고 다시 오븐에 트레이 넣어. 제거 초과 액체, 한 번에 한 슬라이드에 슬라이드를 누릅니다. 세척 랙에서 슬라이드를 삽입 하 고 장소 세척 접시에서 랙 가득 dH2오 이동에 대 한 슬라이드를 아래로 랙 3-5 시간.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 분 분석 결과
<ol><li>
재료 준비
	<ol>
<li>미리 따뜻한 워시 버퍼 워시 버퍼 x 1을 x dH2O 및 50의 60 mL 20 분 혼합 2.94 L에 40 ° C 인큐베이터에 워시 버퍼 x 50.</li>
		<li>DH2dH2오 믹스의 250 mL에 1 N 수산화 암모늄의 1.43 mL을 추가 하 여 수술 준비 0.02% (w/v) 암모니아 물 100 mL를 컨테이너에 잘 하는 길의 되며 100 mL를 추가 하 여 50% 되며 얼룩 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>프로브와 앰프 0-6 사용 하기 전에 RT 30 분 시 약. 40 ° C 교 잡 오븐에 습도 제어 트레이를 두십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
틱 절차 참고: isoforms를 접합 하는 n f 1 의 식 검사 하 고 exon 23a, 3 다른 분 프로브 exon 23a 포함 isoform, 대상에 대 한 값 (PSI)에 접합 하는 백분율을 계산 하려면 exon 23a 제외 isoform 또는 두 isoforms는 사용된 (그림 2 ). 프로브 adjacently 컷된 직물 단면도에 사용 됩니다. 계산의 정확도 보장 하기 위해, 그것은 3 개의 직물 단면도 처리 됩니다 중요 한 교 잡, 증폭 및 신호 감지 단계에서 정확 하 게 동일.<ol>
<li>교 잡 조사.<ol>
<li>세척 선반에서 슬라이드를 제거 하 고 슬라이드에서 과잉 액체를 누릅니다. 얼룩 랙에서 슬라이드를 놓습니다.</li>
			<li>연필을 사용 하 여 프로브 이름으로 슬라이드를. 3 다른 Nf1 프로브 (그림 2)와 함께 때 교배 수 세 adjacently 컷된 뇌 조직 슬라이드를 넣어. 슬라이드의 순서에서 다음 단계를 실시 합니다.</li>
			<li>프로브는 조직 커버를 4 방울을 추가 합니다. 섹션 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 한 번에 한 슬라이드를 할. 습도 제어 트레이에 얼룩 선반을 놓고 2 시간 동안 40 ° C 오븐에 삽입 합니다.</li>
			<li>씻어 슬라이드 두 번 버퍼를 세척. 각 세척에 대 한 얼룩 요리 워시 버퍼 x 1의 200 mL와 함께 그것에 세척 선반을 배치. 한 번에 종이 타월 한 슬라이드에서 과잉 액체를 누르고 신속 하 게 세척 랙에 삽입 합니다. 대 한 접시에 아래로 슬라이드 랙 이동 실시간 2 분에 대 한 3-5 시간</li>
			<li>두 번째 세척에 대 한 신선한 워시 버퍼를 사용 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>신호의 증폭<ol>
<li>슬라이드에서 초과 워시 버퍼 누르고 얼룩 선반에 넣어. 앰프는 조직 커버를 0 4 방울을 추가 합니다. 습도 제어 트레이에 얼룩 랙 하 고 40 ° c.에 30 분 동안 오븐에 넣고</li>
			<li>씻어 슬라이드 두 번 설명한 것 처럼 버퍼를 세척.</li>
			<li>1-6 다음 순서 및 조건 표 2의 앰프와 함께이 단계를 반복 합니다. 두 번 각 교 잡 단계 후 슬라이드를 씻어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>신호 검출<ol>
<li>슬라이드에서 초과 워시 버퍼 누르고 얼룩 선반에 넣어. 빨리 레드의 120 µ L에 빨리 레드 B의 2 µ L를 추가 microcentrifuge 튜브에서 (1:60 비율). 잘 혼합 하 고 완벽 하 게 커버 조직 섹션에 추가. 참고: 빨간색의 총 볼륨 수와 조직 섹션의 크기를 기반으로 하는 B 믹스 /. 0.75 "x 0.75" 지역, 120 µ L 충분 한 부분입니다. 5 분 이내 믹스를 사용 하 고 직접적인 햇빛 또는 자외선 믹스의 노출을 피하십시오.</li>
			<li>트레이 닫습니다 및 폐기물 컨테이너 솔루션 실시간 제거에서 10 분 동안 품 어 및 즉시 세척 랙 슬라이드 삽입 선반을 두십시오는 수돗물 가득 세척 접시에. 다시 물으로 씻어 신선한 수돗물.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
슬라이드 counterstaining
	<ol>
<li>수도 물에서 세척 랙 제거 하 고 신속 하 게 여분의 물을 제거 하는 흡수 성 종이에 누릅니다. 50% 되며 솔루션 얼룩으로 선반을 넣고 즉시 여러 번 위아래로 랙 이동. 실시간에서 2 분 동안 품 어</li>
		<li>슬라이드 랙 수돗물 접시에 다시 전송 합니다. 선반을 위와 아래로 이동 하 고 슬라이드 뇌 조직 유지 보라색 명확 하 게 될 때까지 신선한 수돗물을 변경 하 여 3-5 회 세척.</li>
		<li>랙 0.02% 암모니아 물을 포함 하는 접시에 이동. 랙 아래로 2-3 회 때까지 이동 조직 푸른색. 슬라이드 3-5 번 얼룩 요리에 신선한 수돗물으로 씻는 다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
샘플의 설치
	<ol>
<li>60 ° C 인큐베이터에 얼룩 요리에서 슬라이드 랙 이동 하 고 슬라이드 완전히 건조 될 때까지 적어도 15 분 동안 품 어.</li>
		<li>슬라이드에 장착 매체의 40 µ L을 놓고 신중 하 게 조직 섹션 24 m m x 50 m m coverslip를 배치 합니다. 실시간에서 30 분 동안 공기 건조 슬라이드</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 데이터 수집 및 분석
참고: 40 X 배율에서 이미지를 스캔 하는 슬라이드 스캐너를 사용 합니다.
<ol><li>
긍정적이 고 부정적인 컨트롤
	<ol>
<li>각 실험에 대 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 (그림 3)을 포함 합니다. 좋은 긍정적인 제어 신호는 20-40 X 확대 punctate 점으로 표시 되어야 합니다.</li>
		<li>사용 마우스-PPIB-1ZZ 긍정적인 제어로 (Mm). 이 프로브는 일반적인 내부 관리 유전자 PPIB 대상. 부정적인 통제에 대 한 모든 20 셀 배경 20 X 현미경 필드 얼룩을 표시 한 점을 허용 됩니다.</li>
		<li>DapB 1ZZ 프로브를 사용 하 여 부정적인 컨트롤. 이 조사 대상 세균 유전자 dapB. 이러한 제어 프로브 많은 분 분석 실험19에서 사용 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
신호 검출 및 Nf1 exon 23a의 식 패턴으로의 분석
	<ol>
<li>교 잡 신호는 punctate 점으로 표시는, 수동으로 점 들을 계산 합니다. 도트 수 특정 조사에 의해 감지 되는 성적 증명서의 수준으로 상관 된다. 참고 도트 수 또한 ImageJ 또는 SpotStudio 소프트웨어에 의해 분석 될 수 있다.</li>
		<li>3 개의 프로브를 사용 하 여 교배 exon 23a 포함, 엑손 23a 부족 isoforms, 또는 총 Nf1 성적표 (그림 2). 3 개의 프로브를 동시에 사용할 수 없습니다, 3 개의 인접 한 뇌 조직 섹션 사용 하 여 각 프로브에 교배를.<ol>
<li>Exon 23a에 대 한 (PSI)에 접합 하는 %를 계산 하려면 셀과 몇몇 두뇌 지구에서 점 들의 수를 계산 합니다. 관심의 각 지역에 대해 그림 4에 표시 된 대로 여러 하위 영역에서 400 개 이상의 셀을 계산.</li>
			<li>각 3 개의 프로브에 대 한 동일한 하위 영역에서 데이터를 수집 합니다. 셀 당 도트 수로 계산 하는 exon 23a 포함 프로브 PSI / (exon 23a 포함 프로브 + 프로브를 건너뛰는 exon23a 셀 당 도트 수로 셀 당 점의 수) x 100%.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes.">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li><li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing.">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li><li>Cieply, B., Carstens, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+roles+of+alternative+splicing+factors+in+human+disease.">Functional roles of alternative splicing factors in human disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).</li><li>Xiong, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+splicing.+The+human+splicing+code+reveals+new+insights+into+the+genetic+determinants+of+disease.">RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease.</a> Science. 347, 1254806 (2015).</li><li>Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+splice+variants+in+the+5'UTR+of+Gtf2i+expressed+in+the+rat+brain:+alternative+5'UTRs+and+differential+expression+in+the+neuronal+dendrites.">Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites.</a> Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).</li><li>Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+quantification:+in+situ+analysis+of+transcriptome+and+pre-mRNA+alternative+splicing+at+the+nanoscale.">Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li><li>Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamic+acid+decarboxylase+1+alternative+splicing+isoforms:+characterization,+expression+and+quantification+in+the+mouse+brain.">Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain.</a> BMC Neuroscience. 15, 114 (2014).</li><li>Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. 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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+Analysis+in+the+Rat+Central+Nervous+System+and+Peripheral+Lymph+Node+Tissue+Sections.">Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li><li>Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+In+Situ+Hybridization+using+Oligonucleotide+Probes+on+Paraformaldehyde-prefixed+Brain+of+Rats+with+Serotonin+Syndrome.">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li><li>Erben, L., He, M. 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저자는 공개 없다.

이 통신 마우스 뇌 섹션에서 식 패턴으로 검사 BaseScope RNA의 사용을 보고 합니다. 그것은 그 반대로 감각 엑손-엑손 접합 프로브 exon 포함 하 고 견고 하 게 하 고 특히 isoforms를 건너뛰는 50 뉴클레오티드 대상 보다 짧은 시연입니다. 또한, 결과 신호 대체 exon의 PSI를 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다.
몇 가지 유사 절차에서 테스트 되었습니다. 예를 들어 냉동된 조직 단면도 cryostat 단면에 의해 생성 된 테스트 되었고이 분 프로토콜에 사용 하기 위해 성공 표시. 그러나이 경우에,, deparaffinization 단계 2.1에 PBS 가진 10 월의 5 분 동안 세척로 변경 되었습니다. 또한, ACD에서 제공 하는 교 잡 오븐을 사용 하 여 매우 편리 하다, 비록 immunohistochemistry 사용 트레이 얼룩이 지는 슬라이드와 함께 하는 40 ° C에서 설정 간단한 인큐베이터를 사용 하 여 비교 결과 제공 합니다. 중요 한 것은 젖은 필터 서류 절차를 통해를 포함 하 여 상자에 수 분을 유지.
이 절차에는 한계가 있다. 현재, 그것은 다 색 라벨 같은 조직 슬라이드에 수행 가능입니다. 따라서, 다른 프로브 adjacently 컷, 다른 섹션에만 사용할 수 있습니다. PSI 정확한 값을 얻기 위해 프로브 교 잡의 외피 시간 신호 증폭 및 탐지는 되도록 모든 조직 섹션 같은 중요 하다. 미래에 구현 하는 멀티 컬러 프로브를 사용 하 여 동일한 조직 슬라이드에 RNAscope 절차에서 사용 될 것입니다 매우 바람직한.
이 보고서에 설명 된 RNA 분 양적 분석 식 패턴에서 제자리에서하는 강력한 새로운 도구를 제공 합니다. 이 기술은 많은 양자 택일 exons 연구에 적용할 수 있습니다. 최근 보고서에서 신경 세포와 세포 해상도20oligodendrocytes isoforms 접합 4 ErbB4의 차동 식 패턴을 검사 하 성공적으로 사용 되었다. 이 고 다른 여러 보고서에 표시 된, immunochemistry 함께 BaseScope RNA의 지역화 및 차동 표현된 접합 isoforms6,20의 기능 연구에 대 한 강력한 접근 될 것입니다.

대안 접합 (AS)는 사전 mRNA 성숙 하는 동안 발생 하는 일반적인 과정입니다. 이 과정에서는 exon 차동 성숙한 mRNA에 포함 될 수 있습니다. 따라서, AS, 통해 한 유전자 생성할 수 있습니다 많은 mRNAs 다른 단백질 제품에 대 한 코드. 그것은 추정 인간 유전자의 92-94% 대체 접합1,2를 받 다. 비정상적인 대안 접합 패턴에서 결과 유전자 변이 루 경화 증, 암3,4, myotonic 영양 장애 등 질병의 많은 수에 연결 되었습니다. 따라서 조사 하 고 인간의 질병의 새로운 치료법을 찾을 하려고 대체 접합 규제 메커니즘 이해 결정적 이다.
마찬가지로 종종 셀 형식 관련 패션에서 통제 된다. 그것은 생물 학적 시스템에서 특정 유전자의 AS 식 패턴을 결정 하는 것이 중요입니다. 그러나,이 세포, 심장, 뇌 등의 다양 한 종류를 포함 하는 복잡 한 기관 공부 때 복잡 한 됩니다. 이 경우에, 분석 결과 시스템의 이상적인 선택 RNA 제자리에서 교 잡 (ISH) 티슈를 사용 하 여 특정 유전자의 AS 식 패턴 동시에 많은 세포 유형에서 검출 될 수 있다 그래서 섹션입니다. 실제로, exon 전용 프로브 대체 exon5,,67의 식 수준을 평가 하기 위해 사용 되었습니다. 그러나,이 방법은 아니다 적합 패턴 분석으로 다음과 같은 이유로. 첫째, 기존의 틱 방법 일반적으로 사용 하는 프로브 300 이상 혈압, 척추 내부 exons (하지 첫 번째 또는 마지막 exon)의 평균 크기는 170 뉴클레오티드8,9. 둘째, 내부 양자 택일 exon의 접합 패턴을 검사 하는 exon 전용 프로브를 사용 하는 경우 조사에 의해 감지만 mRNA isoform는 exon를 감지할 수 없습니다 없이 mRNA isoform 동안 exon를 포함 하 이다. 따라서, 양자 택일 exon (PSI) 값에 접합 %의 계산 복잡 하다. 또한, 기존의 형광 틱 종종 결합 분 immunostaining, 검출 효율 및 견고성을 감소 시키는. 예를 들어 스트레스 유발 조사 연구에서 isoform acetylcholinesterase (통증)의 스위칭 접합 mRNA, digoxigenin 분 탐침에 통합 했다 및 안티-digoxigenin 항 체를 사용 하 여 감지. 또는, biotin 표시 된 프로브는 알칼리 성 인산 가수분해 효소/streptavidin 공액 및 알칼리 성 인산 가수분해 효소10기판에 의해 검색 되었습니다. 어느 방법 탐지의 감도 증가 어떤 확대 전략을 사용 합니다. 결과적으로, 그것은 낮은 수준에서 표현 되는 mRNA 사본 검색 도전 이다. 따라서, 간단 하 고 더 강력한 분 분석 결과 시스템은 식 패턴에서 제자리에분석 필요 합니다.
BaseScope는 RNAscope, 잘 설립의 플랫폼에 따라 최근 개발 하 고 널리 이용 되는 분 분석 결과 시스템. 두 분석 결과 시스템 탐지11,12의 감도 증가 하는 특정 대상 증폭 기술을 사용 합니다. 어떻게 구별 하나에서 다른 짧은 BaseScope에 대 한 50 뉴클레오티드 및 RNAscope에 대 한 300-1000 뉴클레오티드는 대상 시퀀스의 길이입니다. 따라서, 디자인 조사 대상 엑손-엑손 접합 특정 대체 mRNA isoforms를 감지 하는 것이 가능 하다. 현재 연구에서 프로시저 neurofibromatosis 식 패턴 입력 1 (Nf1) exon 23a, 같은 실험실13,,1415 에 광범위 하 게 공부 하는 대안 exon 검사 설립 , 16 , 17, 마우스 뇌 섹션에서. 결과 BaseScope는 Nf1 exon 23a 제자리의 식 패턴을 공부 하는 이상적인 시스템을 보여 줍니다. 이 분석 결과 시스템 많은 양자 택일 exons의 표현 패턴 분석에 적응 될 수 있는, 그것은 다른 이름으로의 연구에 강력한 새로운 도구 대표

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>241000ACD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidity Control Tray (with lid)</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain Rack</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1160049SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imperial III General Purpose Incubator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td>302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Scanner</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SCN400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pretreatment kit</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>322381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2000899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease III*</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2000901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Target Retrieval</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2002555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaseScope Detection Reagent Kit</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>332910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 0</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 1</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 2</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 3</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 4</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>16229B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 5-RED</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>16229C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP 6-RED</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast RED-A</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>2001821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast RED-B</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>16230F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X Wash Buffer</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Control Probe- Mouse DapB-1ZZ</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>701021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive Control Probe- Mouse (Mm)-PPIB-1ZZ</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>701081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control slide-mouse 3T3 cell pellet</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidifying Paper</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Rack</td>
			<td>American Master Tech Scientific</td>
			<td>9837976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Washing Dishes</td>
			<td>American Master Tech Scientific</td>
			<td>LWS20WH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Vector Laboratory</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass, 24 x 50 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12--545-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>002689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol (EtOH)</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formalde solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF94-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin I</td>
			<td>American Master Tech Scientific</td>
			<td>17012359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>173942</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of alternative pre-mrna splicing in mouse brain sections using rna in situ hybridization assay

대안 접합 (AS)는 인간 유전자의 90% 이상에서 발생합니다. 양자 택일로 접합된 한 exon의 표현 패턴 셀 형식 관련 패션에서 자주 통제 된다. 패턴은 일반적으로 RT-PCR 및 RNA-seq 분석 식으로 RNA 샘플을 사용 하 여 셀의 인구에서 고립. 현장에서 시험의 특정 생물 학적 구조에 대 한 식 패턴으로는 RNA 제자리에서 교 잡 (ISH) exon 전용 프로브를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 그러나 양자 택일 exons는 일반적으로 너무 exon 전용 프로브 디자인 때문에,의 사용이 제한 되었습니다. 이 보고서에서 BaseScope, 짧은 센스 oligonucleotides RNA 분에를 사용 하 여 최근에 개발 된 기술을 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서 식 패턴으로 분석 설명 되어 있습니다. Exon 23a neurofibromatosis 유형 1 (Nf1)의 짧은 엑손-엑손 접합 프로브 마우스 뇌 섹션에 RNA 분 분석에 높은 특이성을 가진 강력한 교 잡 신호를 전시 설명 하기 위해 예제로 사용 됩니다. 더 중요 한 것은, exon 포함 및 건너뛰는 특정 프로브와 감지 신호 안정적으로 마우스 뇌의 다른 해 부 영역에 Nf1 exon 23a 식의 값에 접합 하는 퍼센트 계산을 사용할 수 있습니다. 실험 프로토콜 및 분석에 대 한 계산 방법 선물 된다. 결과 BaseScope 식 패턴에서 제자리에로 평가 하는 강력한 새로운 도구를 제공 합니다 나타냅니다.

BaseScope 분 3 마우스 종자를 사용 하 여 실시 되었다: CD1 야생 타입 마우스, C57BL/6J 야생 타입 마우스 및 C57BL/6J 배경, 어떤 exon에 23a의 결과로 모든 셀 형식에 포함 되어 있는 n f 123aIN/23aIN 돌연변이 쥐 스플라이스 사이트 설계 변이14,15.
첫 번째 단계로 분 분석 결과 시스템 제공 하는 회사 시 약을 사용 하 여 테스트 되었습니다: 슬라이드 3T3 세포, 그리고 부정과 긍정을 흉내만 프로브. 그림 3에서 보듯이, 부정적인 컨트롤 프로브, 많은 punctate 점 긍정적인 제어 프로브를 사용 하는 경우 검색 하는 동안 사용 된 때 신호 감지 되었습니다.
다음, 분 실시 되었다 마우스 뇌 섹션 및 n f 1를 사용 하 여-엑손 23a를 포함 하는 n f 1 성적을 감지 하도록 설계 된 특정 프로브 건너 exon 23a 또는 두 isoforms (그림 2). 이 프로브는 특정 엑손-엑손 접합 대상. 두 개의 두뇌 영역 Nf1 exon 23a의 AS 식 패턴 검사 선정 되었다: 피 질과 해 마 CA3 (그림 4). 각 지역, 수 세 하위 영역에 대 한 그림 4에 표시 된 대로 셀 및 점 번호를 기록 합니다. 각 지역에 대해 약 400 세포 총에서 계산 하 고 점/셀 비율을 계산 하는 데 사용 했다. Nf1 exon 23a의 AS 식 패턴 PSI로 계산 됩니다.
분 신호 3으로 얻은 n f 1 피 질에 프로브와 CD1 쥐의 해 마는 그림 5A에 나와-5 층 와 표 3. C57BL/6J에서 피 질 지역 n f 1+ + 및 n f 123aIN/23aIN 마우스는 또한 분석된 (그림 6).
이러한 실험의 결과 몇 가지 결론에 지도 했다. 첫째, 신호, 점/셀, 엑손 23a 포함 및 건너뛰는 관련 프로브 같음 3 프로브는 와 함께 때 교배 제안 두 isoforms (표 3) 하 교배 시키는 조사에 의해 감지 하 여 감지로 표시 합 N f 1 비슷한 효율 성적표. 둘째, 피 질, 10%, 엑손 23a의 PSI 값은 이전에 보고 된 RT-PCR 결과, 총 RNA 격리 및 RT-PCR 분석14,15C57BL/6J 마우스 뇌에서 피 했다 해 부와 일치. 이 결과 BaseScope 분 조직 섹션에서 성적 수준에 뿐만 아니라 식 패턴으로 양적 분석을 사용할 수 있습니다 제안 합니다. 셋째,에 모든 Nf1 성적표 포함 exon 23a14,15, n f 123aIN/23aIN 돌연변이 뇌 조직으로 얻은 결과 보였다 신호 때 포함 전용의 고 N f 1 총 프로브 사용 되었다 고 건너뛰는 전용 프로브 사용 되었다 때 신호 (그림 6), exon 포함을 대상으로 하거나 건너뛰는 두 프로브는 매우 구체적인 것을 나타내는.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57889/57889fig1.jpg"> 그림 1: 장비 사용 분. (A) 접시를 세척 하 고 랙 세척. (B) 교 잡 오븐. (C) 검색 비 커, 핫 플레이트 세트를 대상. (D) 습도 및 트레이 제어 랙 얼룩. (E) 습도 제어 트레이 안에 빨간 화살촉으로 표시 종이가 습. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57889/57889fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57889/57889fig2.jpg"> 그림 2: 프로브 Nf1 exon 23a 식 패턴으로 검색 하는 데 사용. 모든 프로브에의 한 ZZ 쌍 oligonucleotide 포함. 포함-관련 조사 (레드) 대상 exons의 23a와 24, 건너뛰는 관련 조사 (녹색)을 대상으로 23, 24, exons의 접합 및 Nf1 총 조사 (블루) exons 26, 27의 대상. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57889/57889fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57889/57889fig3.jpg"> 그림 3: 틱은 음수 (A-B)와 긍정적인 (C D) 컨트롤 3T3 세포를 사용 하 여. 3T3 세포를 포함 하는 컨트롤 슬라이드 2 (샘플 전처리) 및 프로토콜에서 (분 절차) 3 단계 처리 했다. 긍정적인 신호는 빨간색 화살표로 표시 된 빨간색 punctate 점으로 표시 됩니다. B와 D의 이미지 확대 된 A와 C, 각각. 눈금 막대 = 20 µ m (A와 C); 5 μ (B와 D) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57889/57889fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57889/57889fig4.jpg"> 그림 4: 마우스 뇌 코로나 섹션의 그림. 빨간 상자 피 질과 해 마 CA3 영역에 셀 및 신호 수의 계산에 대 한 선택 영역을 나타냅니다. 눈금 막대 = 1 m m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57889/57889fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57889/57889fig5.jpg"> 그림 5: RNA 분 신호 n f 1를 사용 하 여 검출-특정 프로브와 마우스 뇌 섹션. CD1 두뇌 프로토콜에 1-4 단계를 통해 처리 되었습니다. 빨간 punctate 점 긍정적인 나타냅니다 때 신호 3 n f 1-특정 프로브 ( 그림 3참조)이 사용 됩니다. 피 질 (A C)과 마 (D-F) 표시 됩니다. Nf1 총 조사는 A에서 사용 되었다와 D, B와 e, 포함 전용 프로브 및 C와 F. 규모 바에서 건너뛰는 전용 프로브 = 40 µ m (A-C); 400 µ m (D-F) <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57889/57889fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57889/57889fig6.jpg"> 그림 6: RNA 분 신호 감지 n f 1+ + 및 n f 123aIN/23aIN 뇌 섹션. 두 마우스 긴장 C57BL/6J 배경에 있습니다. 두뇌는 프로토콜에서 1-4 단계를 통해 처리 되었습니다. A-C. N f 1+ + 피 질. D-F. N f 123aIN/23aIN 피 질. N f 1 총 조사는 A에서 사용 되었다와 D, B와 e, 포함 전용 프로브 및 C와 F. 규모 바에서 건너뛰는 전용 프로브 = 40 µ m. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57889/57889fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>외피의 순서</td>
			<td>TT 접시에 화학 물질</td>
			<td>시간</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>크 실 렌의 250 mL</td>
			<td>5 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>크 실 렌의 250 mL</td>
			<td>5 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>100% 에탄올의 250 mL</td>
			<td>2 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>100% 에탄올의 250 mL</td>
			<td>2 분</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 단계 2.1.1의 인큐베이션 절차.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>AMP 솔루션</td>
			<td>보육 시간</td>
			<td>부 화 온도</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 앰프</td>
			<td>15 분</td>
			<td>40 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>AMP 2</td>
			<td>30 분</td>
			<td>40 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>앰프 3</td>
			<td>30 분</td>
			<td>40 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>앰프 4</td>
			<td>15 분</td>
			<td>40 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>앰프 5-레드</td>
			<td>30 분</td>
			<td>실내 온도</td>
		</tr>
<tr>
<td>앰프 6-레드</td>
			<td>15 분</td>
			<td>실내 온도</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 신호 단계 3.2.2의 확대 절차.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>지역</td>
			<td>건너뛰기</td>
			<td>포함</td>
			<td>건너뛰는 + 포함</td>
			<td>총</td>
			<td>PSI</td>
		</tr>
<tr>
<td>피 질</td>
			<td>2.9±0.1</td>
			<td>0.32±0.03</td>
			<td>3.21</td>
			<td>3.22</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>CA3</td>
			<td>5.37±0.2</td>
			<td>0.2±0.04</td>
			<td>5.56</td>
			<td>5.65</td>
			<td>3.71</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: RNA 분 결과 그림 5에 표시 된 이미지에서 계산. 점/셀에 표시 된 숫자, 피 질과 CA3에 세 개의 하위 영역에 포함 되어 있는 400 개 이상의 셀을 사용 하 여 계산 되었다 (그림 4). 표준 오류 포함 되어 있습니다.

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Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

현장에서 교 잡 (ISH) 사용 하는 프로토콜 짧은 센스 oligonucleotides 마우스 뇌 섹션에 대체 이전 mRNA 접합 패턴을 감지 하는 설명 되어 있습니다.

대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

quantitative-analysis-alternative-pre-mrna-splicing-mouse-brain

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Genetics

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Unit 1

Transcription: DNA to RNA

SCIENTISTS IN ACTION

8.8K 조회수.  Case Western Reserve University. 현장에서 교 잡 (ISH) 사용 하는 프로토콜 짧은 센스 oligonucleotides 마우스 뇌 섹션에 대체 이전 mRNA 접합 패턴을 감지 하는 설명 되어 있습니다.

비디오: Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which specifically binds the pre-mRNA target and an effector domain. Previously, we have taken advantage of the unique RNA binding mode of the PUF domain in human Pumilio 1 to generate a programmable RNA binding scaffold, which was used to engineer various artificial RBPs to manipulate RNA metabolism. Here, a detailed protocol is described to construct Engineered Splicing Factors (ESFs) that are specifically designed to modulate the alternative splicing of target genes. The protocol includes how to design and construct a customized PUF scaffold for a specific RNA target, how to construct an ESF expression plasmid by fusing a designer PUF domain and an effector domain, and how to use ESFs to manipulate the splicing of target genes. In the representative results of this method, we have also described the common assays of ESF activities using splicing reporters, the application of ESF in cultured human cells, and the subsequent effect of splicing changes. By following the detailed protocols in this report, it is possible to design and generate ESFs for the regulation of different types of Alternative Splicing (AS), providing a new strategy to study splicing regulation and the function of different splicing isoforms. Moreover, by fusing different functional domains with a designed PUF domain, researchers can engineer artificial factors that target specific RNAs to manipulate various steps of RNA processing.

This report describes a bioengineering method to design and construct novel Artificial Splicing Factors (ASFs) that specifically modulate the splicing of target genes in mammalian cells. This method can be further expanded to engineer various artificial factors to manipulate other aspects of RNA metabolism.

인공 요소 엔지니어 것은 특히 인간 세포에서의 스 플라이 싱을 조작 할

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

연구

유전학

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these diseases, do not exist in isolation when they colonize the vector; rather, they likely engage in interactions with resident microorganisms in the gut lumen. The vector microbiota has been demonstrated to play an important role in pathogen transmission for several vector-borne diseases. Whether resident bacteria in the gut of the Ixodes scapularis tick, the vector of several human pathogens including Borrelia burgdorferi, influence tick transmission of pathogens is not determined. We require methods for characterizing the composition of the bacteria associated with the tick gut to facilitate a better understanding of potential interspecies interactions in the tick gut. Using whole-mount in situ hybridization to visualize RNA transcripts associated with particular bacterial species allows for the collection of qualitative data regarding the abundance and distribution of the microbiota in intact tissue. This technique can be used to examine changes in the gut microbiota milieu over the course of tick feeding and can also be applied to analyze expression of tick genes. Staining of whole tick guts yield information about the gross spatial distribution of target RNA in the tissue without the need for three-dimensional reconstruction and is less affected by environmental contamination, which often confounds the sequencing-based methods frequently used to study complex microbial communities. Overall, this technique is a valuable tool that can be used to better understand vector-pathogen-microbiota interactions and their role in disease transmission.

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Here, we present a protocol to spatially and temporally assess the presence of viable microbiota in tick guts using a modified whole-mount in situ hybridization approach.

제자리에 전체 산 교 잡에 의해 틱 용기에 Microbiota의 시각화

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To date, miRNAs have been implicated in a large number of biological and disease processes, which has signified the need for the reliable detection methods of miRNA transcripts. Here, we describe a detailed protocol for digoxigenin-labeled (DIG) Locked Nucleic Acid (LNA) probe-based miRNA detection, combined with protein immunostaining on mouse heart sections. First, we performed an in situ hybridization technique using the probe to identify miRNA-182 expression in heart sections from control and cardiac hypertrophy mice. Next, we performed immunostaining for cardiac Troponin T (cTnT) protein, on the same sections, to co-localize miRNA-182 with the cardiomyocyte cells. Using this protocol, we were able to detect miRNA-182 through an alkaline phosphatase based colorimetric assay, and cTnT through fluorescent staining. This protocol can be used to detect the expression of any miRNA of interest through DIG-labeled LNA probes, and relevant protein expression on mouse heart tissue sections.

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) are short and highly homologous RNA sequences, serving as post-transcriptional regulators of messenger RNAs (mRNAs). Current miRNA detection methods vary in sensitivity and specificity. We describe a protocol that combines in situ hybridization and immunostaining for concurrent detection of miRNA and protein molecules on mouse heart tissue sections.

조직 관련 미르 식에서 제자리 교 잡 마우스 심장 섹션 사용 하 여 프로 파일링

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

작은 분자 조사를 시험관 및 셀 모양을 사용 하 여 사전 mRNA 구조 변화 유도

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Murine Oocytes에 계량 및 방화 mRNAs 단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (SM-물고기)의 사용

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated with a better outcome than alcohol- and tobacco-related OPSCC. Chromogenic in situ hybridization (CISH) of HPV viral RNA could allow the semiquantitative evaluation of viral transcripts of the oncogenic proteins E6 and E7 and an in situ visualization with a good spatial resolution. This technique allows the diagnosis of an active infection with the visualization of HPV transcription in the tumoral HPV-infected cells. An advantage of this technique is the avoidance of contamination from nonneoplastic HPV-infected cells adjacent to the tumor. Overall, its good diagnosis performances have it considered to be the gold standard for active HPV infection identification. Since E6 and E7 viral protein interaction with cell proteins pRb and p53 is mandatory for cell transformation, HPV RNA CISH is functionally relevant and acutely reflects active oncogenic HPV infection. This technique is clinically relevant as well since &#34;low&#34; or &#34;high&#34; HPV transcription levels helped the identification of two prognosis groups among HPV-related p16-positive head and neck cancer patients. Here we present the protocol for manual HPV RNA CISH performed on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) slides with a kit obtained from the manufacturer. Instead of chromogenic revelation, RNA in situ hybridization may also be performed with fluorescent revelation (RNA FISH). It may also be combined with conventional immunostaining.

Human papillomavirus (HPV) RNA chromogenic in situ hybridization is considered to be one of the gold standards for active human papillomavirus infection detection within tumors. It allows the visualization of HPV E6-E7 mRNA expression with localization and semiquantitative evaluation of its signal.

시투 혼성화에서 발색성 HPV 관련 두경부 암 진단을 위한 도구

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.