연구는 과학의 발전 및 기술 적용 연구 프로그램 단계 II 아칸소 132-053-2; 오클라호마 센터에 의해 투자 되었다 그리고 농업 특수 작물의 오클라호마 부에 의해 연구 교부 금 프로그램. 우리 감사 황 홍 진 오 생물 정보학 핵심 시설 NSF (EOS-0132534)와 NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 5P20RR15564-03)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

저자는 공개 없다.

최근 몇 년 동안에서 다양 한 방법 바이러스 유사 입자 (VLP) 또는 바이러스 특정 RNA 또는 DNA2,3,44, 풍부 하 게 포함 하는 자연 환경에서 식물 바이러스 생물 다양성 연구에 고용 되어 45,46 . 이러한 메서드는 NGS와 bioinformatic 분석 뒤. 이 연구의 목표는 재배 식물에 일반적인 질병의 인과 대리인을 찾을 했다. 질병은 비 싸여 bacilliform 입자는 565 bp 조각만 복제47는 되었습니다 알 수 없는 바이러스의 결과 보고. 이 정보는 이전 연구자 가정해 가족 내에서 Caulimoviridae Badnavirus 속에 바이러스를 할당에 대 한 충분 한 했다. 이전 보고서는 칸 나 백합에 칸 나 순 질병은이 연구에서 제시 된 metagenomics 접근을 사용 하 여 단일 badnavirus의 결과 가설 하는 동안 우리는 질병 두 미정 badnavirus 종24기인 했다 결정. 따라서, 질병의 인과 대리인을 발견 하는 metagenome 접근을 사용 하 여의 힘은 우리가 지금 상황을 식별할 수 있는 하나 이상의 원인이 있을 수 있습니다.
DNA와 RNA 시퀀싱 데이터를 결합 하는 우리의 접근 철저 한 이며 또한 결과 두 가지 방법을 사용 하 여 일관 된 결과 굴복 하 고 두 개의 관련된 바이러스의 존재를 확인을 보여 줍니다. 우리 caulimoviruses의 격리에 대 한 수정된 절차를 고용 하 고는 관련 바이러스 핵 산에 대 한 풍부한 했다 고 그 바이러스 capsid 내에서 보호 된 샘플 제작. 서비스 실험실 DNA 시퀀싱을 수행 하기로 계약 했다. 드 노 보 시퀀싱에 대 한 필수 개념은 DNA 중 합 효소는 DNA 합성의 순차적 주기 동안 서식 파일 DNA 가닥으로 뉴클레오티드를 표시 하는 형광 통합 이다. contigs 조립 뒤 NGS에 의해 생산 바이러스 contigs로 확인 된 몇 가지 contigs bioinformatic로 제출 했다. 두 바이러스 게놈10,24,,4849,50 의 추가 확인 RNA-seq 데이터 ribo 고갈 RNA 준비에서 얻은 bioinformatic 분석을 통해 얻은 것입니다. 흥미로운 결과 시퀀스의 인구 DNA와 RNA 시퀀싱 되 배워야 하나 비 바이러스 및 바이러스 핵 산의 유사한 배급 제공. DNA와 RNA 시퀀싱에 대 한 시퀀스의 < 0.5% 바이러스 기원 했다. 내 바이러스 Caulimoviridae가족에 속한 시퀀스 78-82%의 인구. DNA와 RNA 시퀀싱에서 조립된 바이러스 contigs 비교 하 여 우리는 두 개의 조립된 게놈 두 데이터 집합에서 발생 한 확인 했다.
유일한 DNA 시퀀싱을 사용 하 여 새로운 바이러스 유전자를 식별 하는 관심사 badnavirus 게놈 오픈 원형 DNA 이다. 우리는 게놈에 있는 불연속을 중첩 시퀀스 contigs에서 게놈 어셈블리에 대 한 장애물을 제시 수 있습니다 추측. DNA 시퀀싱 결과의 초기 시험 두 유사한 바이러스 게놈을 공개 했다. 우리는 이러한 게놈 중 하나는 공부 하지 않은, 종의 유전적 다양성 대표 가설 또는 공동 감염 같은 대표 두 종 공장24. 따라서, 집단 bioinformatic 분석 NGS DNA와 RNA 시퀀싱 하 여 가져온 데이터 집합의 두 개의 전체 길이 genomes의 존재의 확인을 사용할 수 있습니다.
Metagenomic 연구, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV;는 caulimovirus)3에서 DNA를 복구 하는 절차에 따라 식물 homogenates에서 VLP 및 핵 산을 추출 하기 위한 다른 방법을 개발 하는 다른 보고서가입니다. 이 방법은 식별 소설 RNA 및 DNA 바이러스 시퀀스 비 재배 식물. 재배 식물의 질병의 인과 대리인 발견이 연구에 사용 된 caulimovirus 격리 절차에서 파생 된 단계 VLP을 추출 하는 자연적으로 감염 된 식물24에서 파생 된 단계와는 달리 있습니다. 두 수정된 방법의 성공 caulimovirus 격리에 대 한 프레임 워크 절차 일반적으로 식물 바이러스의 metagenomic 연구에 대 한 귀중 한 시작 지점을 있을 수 있습니다 제안 합니다.

신흥 식 물병 드라이브 올바른 인과 에이전트를 식별 하는 새로운 도구를 개발 하는 연구원. 새로운 또는 되풀이 바이러스 질병의 초기 보고서 모자이크 및 잎 정 맥 지우기, 왜소, 시 들고, 병 변, 괴 사, 기형 같은 일반적으로 발생 증상 또는 다른 증 후를 기반으로 합니다. 질병에 대 한 인과 에이전트 다른 오염 병원 체에서 그것을 분리 하는 새로운 바이러스를 보고 하기 위한 표준 적합 한 호스트에 그것을 전파 하 고 원래 호스트 종의 건강 한 식물으로 접종에 의해 질병을 재현. 이 접근에 한계는 식물 바이러스의 많은 속 곤충 또는 다른 벡터 전송 또는 다시 원래 호스트 종에 적합 한 호스트에 대 한 의존 이다. 이 경우에, 적절 한 벡터에 대 한 검색을 연장 수, 실험실 식민지는 벡터의 설정에 어려움이 있을 수 있습니다 있으며 더 노력 실험적인 전송에 대 한 프로토콜을 고안 하는 데 필요한. 성공적인 실험실 전송 연구에 대 한 조건을 얻을 수 없는 경우 다음 작업 짧은 폭포 표준 보고 새로운 바이러스 질병. 매우 낮은 titers에 그들의 자연적인 호스트에서 발생 하는 바이러스에 대 한 연구자는 연구 수행에 대 한 충분 한 전염 성 주식을 유지 하기 위해 전파에 대 한 대체 호스트를 식별 해야 합니다. 몇 가지 식물을 감염 하는 바이러스 종에 대 한이 주식 문화1성장에 걸림돌이 될 수 있습니다.
최근 몇 년 동안, 과학자는 고용 더 자주 높은 처리량 NGS와 metagenomic 접근 알려진된 질병에 관련이 있을 수 있습니다 하지만 분류학 종과 장군에 할당 될 수 있습니다 환경에 존재 하는 바이러스 시퀀스를 밝히기 2 , 3 , 4. 발견 및 고유한 환경에서 유전 물질의 분류에 같은 접근 자연에서 바이러스 다양성 또는 특정 생태계에서 그들의 존재를 설명 하는 방법을 제공 하지만 반드시 정의 하기 위한 프레임 워크를 확인 하지 않습니다 명백한 질병에 대 한 인과 대리인입니다.
Badnavirus 속 pararetroviruses의 Caulimoviridae 가족에 속한다. 이 바이러스는 약 7 ~ 9 kb의 원형 이중 가닥 DNA 게놈을 가진 모양에 있는 bacilliform. 모든 pararetroviruses RNA 중간을 통해 복제합니다. Pararetroviruses는 episomes로 존재 하 고 복제 식물 염색체 DNA5,6의 독립. 바이러스 인구의 분야 연구는 이러한 바이러스는 유전자 복잡 한 나타냅니다. 또한, 높은 처리량 연속 식물 게놈의 범위에 걸쳐 얻은 정보 위법 통합 이벤트로 식물 게놈으로 삽입 하는 badnavirus 게놈 조각의 수많은 예제를 발견 있다. 이러한 내 생 badnavirus 시퀀스 감염7,,89,,1011와 반드시 연결 되지 않습니다. 그 후, 질병의 인과 대리인으로 새로운 badnaviruses를 식별 하는 NGS의 사용 episomal 게놈의 부분 모집단 다양성 생 시퀀스12,13의 발생에 의해 복잡 합니다.
소설 pararetrovirus 유전자의 발견에 대 한 최적의 파이프라인은, 질병에 대 한 인과 대리인으로 서 이러한 바이러스를 식별 하는 두 가지 일반적인 방법 있습니다. 1 개의 방법은 감염 된 잎에서 작은 RNA 순서에 대 한 풍부 하 고 다음 이러한 시퀀스 바이러스 genome(s)14,15,,1617를 다시 구성할 것입니다. 다른 방법은 회전 원형 증폭 (RCA) 원형 DNA 바이러스 게놈18증폭입니다. RCA의 성공 잎 및 선택한 조직에 바이러스 titer의 나이에 따라 다릅니다. RCA 제품 제한 소화를 받게 되며 직접 시퀀싱19,,2021플라스 미드로 복제.
칸 나 노란색 반점 바이러스 (CaYMV)는 badnavirus 이며, 게놈의만 565 bp 파편 이전 감염된 cannas22분리 되었습니다 비록 칸 나에 노란 반점 질병의 etiological 원인으로 설명. 현대 연구에서 Alpinia purpurata (꽃 생강; CaYMV 식별 CaYMV-Ap)23. 이 연구의 목표는 감염 된 칸 나 백합에서 완전 한 badnavirus 게놈 시퀀스를 복구 했다. 우리 공장에서 오염 물질에서 바이러스를 정화 하 고이 준비에서 바이러스 성 DNA 분리에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 DNA 도서관 NGS에 사용 하기 위해 준비. 이 방법은 중간 분자 증폭 단계에 대 한 필요가 없다. 우리 또한 RNA이 NGS, 대 한 감염 된 식물에서 mRNA를 분리 RNA-seq 포함 실시 했다 각 핵 산 준비를 사용 하 여. 조립된 contigs Badnavirus taxon 도구에 대 한 생물 공학 정보 (NCBI) 기본적인 현지 줄 맞춤 검색 핵 산 (BLASTn)에 대 한 국립 센터를 사용 하 여 두 데이터 집합에 관련 된 발견 되었다. 우리는 2 개의 badnavirus 종24의 유전자 발견.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1109px;" width="1109">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:368px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich St. Louis MO</td>
			<td style="width:133px;">S5976</td>
			<td style="width:440px;">Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:368px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:133px;">S0751</td>
			<td>Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:368px;">Na2SO3</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher Waltham, MA</td>
			<td style="width:133px;">28790</td>
			<td>Grinding buffer for virus purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">urea</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">PB169-212</td>
			<td>Homogenate extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:133px;">X-100</td>
			<td>Homogenate extraction&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Cheesecloth</td>
			<td style="width:168px;">VWR Radnor, PA</td>
			<td>21910-107</td>
			<td>Filter homogenate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Tris&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">BP152-5</td>
			<td>Pellet resuspension&#38; DNA resuspension buffers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:368px;">MgCl2</td>
			<td style="width:168px;">Spectrum, Gardena, CA</td>
			<td style="width:133px;">M1035</td>
			<td>Pellet resuspension buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">EDTA</td>
			<td style="width:168px;">Spectrum</td>
			<td style="width:133px;">E1045</td>
			<td>Stops enzyme reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">25530</td>
			<td>DNA resuspension buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">phenol:chloroform:isoamylalcohol&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">P2069</td>
			<td>Dissolve virion proteins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">DNAse I</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">M6101</td>
			<td>Degrade cellular DNA from extracts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">95% ethanol</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">6B-100</td>
			<td>Virus DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Laboratory blender</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td>58984-030</td>
			<td>Grind leaf samples</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">Floor model ultracentrifuge&#160; &#38;Ti70 rotor</td>
			<td style="width:168px;">Beckman Coulter, Irving TX&#160;</td>
			<td style="width:133px;">A94471</td>
			<td>Separation of cellular extracts</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:368px;">Floor model centrifuge and JA-14 rotor</td>
			<td style="width:168px;">Beckman Coulter&#160;</td>
			<td style="width:133px;">369001</td>
			<td>Separation of cellular extracts</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:368px;">Magnetic stir plate</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">75876-022</td>
			<td>Mixing urea into samples overnight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Rubber policeman</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:133px;">470104-462</td>
			<td>Dissolve virus pellet</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">&#160;2100 bioanalyzer Instrument</td>
			<td style="width:168px;">Agilent Genomics, Santa Clare, CA</td>
			<td style="width:133px;">G2939BA</td>
			<td>Sensitive detection of DNA and RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2100 Bioanalyzer RNA-Picochip</td>
			<td></td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>Microfluidics chip used to move, stain and measure RNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip</td>
			<td></td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>Microfluidics chip used to move, stain and measure DNA quality in a 2100 Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Nanodrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">ND-2000</td>
			<td>Analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Plant total RNA isolation kit</td>
			<td style="width:168px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">STRN50-1KT</td>
			<td>Isolate RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">RNase-free water&#160;</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td>10128-514</td>
			<td>Resuspension of DNA and RNA for NGS</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:368px;">RNA concentrator spin column</td>
			<td style="width:168px;">Zymo Research, Irvine, CA</td>
			<td style="width:133px;">R1013</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">rRNA removal kit</td>
			<td style="width:168px;">Illumina, San Diego, CA</td>
			<td style="width:133px;">MRZPL116</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:133px;">12321D</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">&#160;RNA&#160; enrichment system</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td style="width:133px;">7277300001</td>
			<td>Prepare RNA for RNA-seq</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">16500100</td>
			<td>Gel analysis of DNA/RNA quality at intermediate steps of procedures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:133px;">15585011</td>
			<td>Agarose gel staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pGEM-T +JM109 competent cells</td>
			<td style="width:168px;">Promega, Madison, WI</td>
			<td style="width:133px;">A3610</td>
			<td>Clone genome fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">pFU Taq polymerase</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">M7741</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">dNTPs</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">U1511</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">PCR oligonucleotides</td>
			<td style="width:168px;">IDT, Coralvill, IA</td>
			<td style="width:133px;">Custom order</td>
			<td>PCR amplify virus genome</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:368px;">Miniprep DNA purification kit</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">A1330</td>
			<td style="width:440px;">Plasmid DNA purification prior to sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:368px;">PCR clean-up kit</td>
			<td style="width:168px;">Promega</td>
			<td style="width:133px;">A9281</td>
			<td style="width:440px;">Prepare PCR products for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:368px;">pDRAW32 software</td>
			<td style="width:168px;">ACAClone</td>
			<td></td>
			<td>Computer analysis of circular DNA and motifs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">MEGA6.0 software</td>
			<td style="width:168px;">MEGA</td>
			<td></td>
			<td>Molecular evolutionary genetics analysis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:368px;">Primer 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Simgene.com</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT&#8482; RiboGreen&#8482; RNA Assay Kit</td>
			<td style="width:168px;">Thermo-Fisher</td>
			<td>R11490</td>
			<td>Fluorometric determination of RNA quantity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior&#8482; pyrosequencing System</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5526337001</td>
			<td>Sequencing platform</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A)</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996520001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996490001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A)</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996538001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr EmPCR Oil &#38; Breaking Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996511001</td>
			<td>Reagents for emulsion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr Titanium Sequenicing kit*</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996554001</td>
			<td>Includes sequencing reagents, enzymes, buffers, and packing beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5996619001</td>
			<td>Sequencing plate with associated reagents and gaskets</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IKA Turrax mixer</td>
			<td></td>
			<td>3646000</td>
			<td>Special mixer used with Turrax Tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;">IKA Turrax Tube (specialized mixer)</td>
			<td></td>
			<td>20003213</td>
			<td>Specialized mixing tubes with internal rotor for creating emulsions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Nebulizers Kit</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>5160570001</td>
			<td>Nucleic acid size fractionator for use during library preparations</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior emPCR Bead Counter</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 635 001</td>
			<td>Library bead counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Bead Deposition Device</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 473 001</td>
			<td>Holder for Picotiter plate during centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Counterweight &#38; Adaptor for the Bead Deposition Devices</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 889 103 001</td>
			<td>Used to balance deposition device with picotiter plate centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Software</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td>05 996 643 001</td>
			<td>Software suite for controlling the instrument, collecting and analyzing data</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Junior Sequencer Control v. 3.0</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Run Processor v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS De Novo Assembler v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Reference Mapper v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0</td>
			<td style="width:168px;">Roche</td>
			<td></td>
			<td>(Included in item 05 996 643 001 above)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combining analysis of dna in a crude virion extraction with the analysis of rna from infected leaves to discover new virus genomes

Metagenome 이렇게는 원형 DNA 게놈으로 식물 바이러스 및 그들의 증명서를 식별 하는 데 사용 됩니다. 종종 식물 DNA 바이러스는 그들의 호스트에 낮은 titers에서 발생 또는 다른 호스트에 기계적으로 주사 될 수 없다는 전파 감염 물질의 더 큰 titer를 달성 하기 어렵다. 감염 된 잎은 최적의 pH와 이온 조성 대부분 bacilliform 파라 레트로 바이러스를 정화 하는 것이 좋습니다 가벼운 버퍼에 지상. 요소는 virions 함정 포함 시체를 휴식 하 고 세포질 구성 요소를 분해 하는 데 사용 됩니다. 차등 원심 분리 공장 오염 물질에서 virions의 분리를 추가 제공합니다. 다음 가수분해 K 치료는 capsids 제거합니다. 바이러스 성 DNA 이다 집중 그리고 차세대 시퀀싱 (NGS) 사용 합니다. NGS 데이터는 NCBI-BLASTn 바이러스 시퀀스 생성 된 데이터 집합의 하위 집합을 식별 하는 제출 contigs 조립 하는 데 사용 됩니다. 병렬 파이프라인에서 RNA는 감염 된 잎은 표준 열 기반 RNA 추출 방법을 사용 하 여 격리 됩니다. 다음 리보솜 고갈 mRNA 및 바이러스 성적 하위 집합에 대 한 풍부 하 게 수행 됩니다. 조립된 시퀀스 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)에서 파생 된 바이러스 시퀀스에서이 데이터 집합의 하위 집합을 식별 하기 위해 NCBI BLASTn에 제출 했다. 우리의 연구에서 우리는 두 개의 데이터 집합에서 두 개의 관련된 전체 길이 badnavirus 유전자 발견. 이 메서드는 식물 바이러스 게놈 시퀀스를 다시 구성할 작은 RNA 시퀀스의 집계 인구를 추출 하는 또 다른 일반적인 접근을 선호. 이 후자의 metagenomic 파이프라인 복구 바이러스 관련 시퀀스는 복고풍 속기 요소 식물 게놈으로 삽입 됩니다. 이를 더 적극적으로 전염 성 요원을 분별 생화학 또는 분자 분석을 결합 이다. 이 연구에서 설명 하는 접근 가능성이 표시 활성 바이러스 감염 하는 바이러스 복제의 시퀀스를 복구 합니다.

이 수정된 바이러스 정화 방법 바이러스 DNAs NGS와 생물 정보학 두 바이러스 종 식별 하는 데 유용의 농축을 제공 합니다. 후에 homogenate에서 40000 x g 2.5 h에 대 한 centrifuged는, 튜브의 하단에 녹색 펠 릿과 길이 따라 흰색 펠 릿 있었습니다. 녹색 펠 릿은 한 microcentrifuge 튜브에 resuspended 그리고 화이트 펠 릿 두 microcentrifuge 튜브 resuspended 했다. PCR 표준 CaYMV PCR 진단 뇌관을 사용 하 여 실행 되었다 고 제품 solubilized 화이트 펠 릿과 하지 녹색 펠 릿 (그림 1A)에서 발견 되었습니다. 원유 준비의 샘플 전송 전자 현미경에 의해 조사 되었다 하 고 우리가 124-133 nm 길이 (그림 1B)를 측정 하는 bacilliform 입자를 관찰. 이것은 대부분 badnaviruses의 예측된 모달 길이 이내 이다. DNA는 흰색과 녹색 알갱이에서 추출 하 고 별도로 resuspended. 그림 1C, 우리는 녹색에서 추출한 DNA의 5 µ L 로드 고 흰색 펠 렛 샘플 (녹색 부분에 대 한 DNA의 1.6 µ g)와 흰 부분을 위해 DNA의 3.1 µ g 0.8 %agarose 젤 전기 이동 법 ethidium 평범한 사람을 다음 DNA를 분석 얼룩. 녹색 부분 흰색 분수 높은 분자량 DNA, DNA (그림 1C) 낮은 분자량의 두 밴드를 생산 하는 반면 낮은 분자량 DNA를 포함. 그림 1C 에 젤 100 V에서 40 분 동안 실행 하 고 레인 3에 얼룩 젤 전압 명확 하 게 밴드를 생산 하기 위해 인하 해야 제안 합니다. 이러한 데이터 제안 화이트 펠 릿 virions에 대 한 풍부한 했다. 흰색 샘플에서 추출 된 DNA (0.6 µ g/mL) 농도, 했지만 NGS, 10의 최소 필요에 대 한 적절 한 진행에 DNA의 ng. 조각난된 DNAs는 NGS에 대 한 라이브러리를 준비 하 사용 되었다.
동시에, RNA 높은 처리량 RNA-이 대 한 감염된 칸 나 식물 (그림 1D)에서 추출 된 표준 워크플로 라이브러리 준비, NGS, contigs, 만들고 확인 하는 바이러스 성 게놈 시퀀스 (그림 1E)를 위해 수행 되었다. 재료를 시작으로 DNA와 RNA를 사용 하 여 출력 결과 비교 했다.
우리는 원유 바이러스 준비에서 고립 된 DNA를 사용 하 여 188,626 원시 DNA 읽기를 NGS 여 얻었다. 읽기 13,269 contigs로 조립 및 BLASTn 뉴클레오티드 시퀀스의 NCBI 데이터 집합을 검색 하는 데 사용 되었다 (Viridplantae TaxID를 사용 하 여: 33090 및 바이러스 TaxID: 제한 기체로 10239) (그림 1E). NCBI BLASTn 결과 계시는 데 노 보 조립 contigs의 93% 셀룰러 시퀀스, 22%, 아니었다 고 0.3% 바이러스 contigs (그림 2A). Contigs 셀룰러 시퀀스도 미토 콘 드리 아 발견 했다로 분류 또는 엽록체 DNA의 대부분. 바이러스 contigs dataset에서 바이러스 contigs의 32% (되지 않은 Badnavirus 시퀀스) Caulimoviridae 의 회원 관련 있었다와 이들 중 58% 관련이 있었다 Badnavirus. 바이러스 contigs의 29% 매우 비슷한 (e < 1 x 10-30) CaYMV 격리 V17 ORF3 유전자 (EF189148.1), 사탕수수 bacilliform 바이러스 Batavia D, 완전 한 게놈 (FJ439817.1), 격리 되었고 바나나 행진 CA 바이러스 게놈 (완료 KJ013511)입니다. 이 인구 내에서 두 개의 전체 길이 genomes 닮은 긴 contigs가 있었습니다.
높은 처리량 RNA-seq 생산 153,488 청소 개별 시퀀스 읽기 읽기 < 500 bp. Contig 어셈블리의 길이 평균 8,243 contigs이 감소. 이러한 NCBI BLASTn에 제출 했다 (TaxID Viridplantae를 사용 하 여: 33090 및 바이러스 TaxID: 제한 기체로 10239) 출력 식물 세포 시퀀스, 23%의 범주에는 contigs의 76%를 배치 했다, 그리고 0.1% 바이러스 contigs (로 분류 했다 그림 2 B). 가까이 시험 바이러스 contigs 인구의 0.1%의 인구의 68% Caulimoviridae (그림 2B)에 할당 된 결정. 이 인구 내의 3 개의 큰 contigs 높은 유사성을 발견 했다 (10-30X e < 1) CaYMV 격리 V17 ORF3 유전자 (EF189148.1), 사탕수수 bacilliform 바이러스 분리 Batavia D, 완전 한 게놈 (FJ439817.1)와 바나나 행진 CA 바이러스 완전 한 게놈 (KJ013511). 우리가 수동으로 전체 길이 바이러스 게놈을 생산 하기 위해 이러한 두 합류 3 contigs 검사.
우리는 두 개의 전체 길이 바이러스 게놈의 존재를 확인 상호 발판으로 DNA와 RNA 시퀀싱 제작한 바이러스 게놈 길이 contigs 비교. 6,966의 1 개의 전체 길이 바이러스 게놈 bp 가칭 칸 나 노란색 반점 관련 바이러스 1 (CaYMAV-1) (그림 3A) 지명 되었다. 두 번째 게놈 이었다 7,385 bp와 CaYMV Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (그림 3A) 감염의 변종.
마지막으로, 각 바이러스의 복제 ~ 1000 bp 파편 설계 되었다 PCR 뇌관 차동 9 상업 종류를 나타내는 227 칸 나 식물의 인구에 있는 두 유전자를 감지 사용 되었다. 많은 경우에 개별 공장 두 바이러스에 감염 되었습니다. 12 식물에서 CaYMAV-1 및 CaYMV Ap01 RT-PCR 탐지의 예를 제공합니다. 3 다음 긍정적인 CaYMV Ap01 대해서만 되었고 9 두 바이러스 (그림 3B)에 대 한 긍정적인 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg"> 그림 1 : 바이러스 핵 산 준비 및 NGS 워크플로. (1.0%) (A) Agarose 젤 전기 이동 법 CaYMV 유전자의 565 bp PCR 파편의. 두 개의 PCR 제품 녹색 펠 렛 샘플 (3 차선)에 흰색 펠 릿 (차선 1, 2)에서 준비 하는 샘플만 발견 했다. 긍정적인 컨트롤 (+)은 감염 된 공장 표준 상자성 셀 입자를 포함 하는 자동화 된 방법을 사용 하 여 격리 된 DNA에서에서 증폭 PCR 제품을 나타냅니다. 레인 L 샘플 레인에 선형 DNA 밴드의 크기를 측정 하기 위한 표준으로 사용 하는 DNA 사다리를 포함 합니다. 감염 된 칸 나 잎의 원유 분류 되는 백색 펠 릿에 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 전망 하는 바이러스 입자의 (B) 예. (C) Agarose (0.8%) 녹색 (1 레인)에서 복구 된 DNA의 전기 영동 젤과 화이트 (2 레인) 패널 A. PCR에 의해 시험 된 긍정적인 그 펠 릿 레인 2 옆 빨간색과 노란색 점 두 높은 분자량 DNA 밴드 흰색 부분에서 발생 하는 식별 합니다. (D) Agarose (1%) 되는 RNA 정화 열 기반 총 RNA의 전기 이동 법 젤. 레인 L 샘플 레인에 선형 밴드의 크기를 측정 하기 위한 표준으로 사용 하는 DNA 사다리를 포함 합니다. 레인 1-6 ribo-고갈 및 핵 산 격리, 도서관 준비, 시퀀싱, contig 어셈블리 및 바이러스 게놈 RNA-이 (E) 도식 파이프라인에 대 한 단일 샘플에는 풀링된 했다 감염 된 칸 나 잎에서 분리 된 RNA를 포함 발견입니다. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg"> 그림 2 : 크로나 차트 시각화 contigs의 분류학 종류. (A) 풍요로 움과 contigs의 분류학 배포 원유 바이러스 준비에서 조립 왼쪽된 쇼에 차트. 오른쪽 차트 Caulimoviridae 가족, Badnavirus 속, 및 3 개의 밀접 한 관련이 종와 관련 된 바이러스 contigs의 비율을 보여 줍니다. (B) 왼쪽에 있는 패널 contigs RNA-seq에서 파생 된의 풍부한 그들의 분류학 분포에 따라 보여 줍니다. 오른쪽에 Caulimoviridae 가족, Badnavirus 속, 및 3 개의 밀접 한 관련이 종와 관련 된 바이러스 contigs의 인구 내의 contigs의 풍요를 묘사 하는 그래프입니다. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg"> 그림 3 . CaYMAV-1 및 CaYMV Ap01 유전자의 특성. (A) 도표 표현의 칸 나 노란색 반점 연결 바이러스 1 (CaYMAV) 및 칸 나 노란색 반점 바이러스 게놈에서 절연 비슷한 Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). 뉴클레오티드 위치 1-10 게놈의 시작으로 식별 되 고 tRNA만난 anticodon 사이트가 대부분 badnavirus 유전자의 전형. 열려있는 독서 프레임 (ORF) 1과 2의 번역에 대 한 중지 및 시작 위치는 인접 한. 이 단백질에는 알 수 없는 함수. ORF3 아연 손가락 (ZnF), 프로 테아 제 (프로), 역전사 (RT), RNAse H 도메인을 포함 하는 polyprotein입니다. 3' 많은 신호 순서는 두 바이러스 게놈에 대 한 보존입니다. (B) RT-PCR 분석 RNA 바이러스에 감염 된 잎 및 CaYMAV 및 CaYMV Ap01 검출 뇌관에서 격리를 사용 하 여 실시 되었다. 12 식물의 동일한 인구, 3 감염 되었습니다 CaYMV Ap01만, 반면 CaYMAV와 CaYMV Ap01 감염 된 나머지. (+) 나타냅니다 긍정적인 제어 (-) 부정적인 제어를 나타냅니다. 이 수치는 Wijayasekara 그 외 여러분 에서 재현/수정 24 동의입니다. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes at JoVE.com

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

새로운 바이러스 게놈을 발견 감염 된 잎에서 RNA 분석 원유 Virion 추출에 DNA의 결합 분석

여기 우리는 이중 가닥 DNA 게놈으로 식물 바이러스를 식별 하는 새로운 접근 방식을 제시. 감염 된 잎에서 DNA와 RNA를 추출 하 고 다음-세대 시퀀싱을 수행 표준 방법을 사용 합니다. Bioinformatic 도구 contigs로 시퀀스를 조립 하 고 contigs 바이러스 게놈을 나타내는 식별 분류학 그룹에 게놈을 할당 합니다.

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

combining-analysis-dna-crude-virion-extraction-with-analysis-rna-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K 조회수.  Texas A&M Agrilife Center at Dallas. 여기 우리는 이중 가닥 DNA 게놈으로 식물 바이러스를 식별 하는 새로운 접근 방식을 제시. 감염 된 잎에서 DNA와 RNA를 추출 하 고 다음-세대 시퀀싱을 수행 표준 방법을 사용 합니다. Bioinformatic 도구 contigs로 시퀀스를 조립 하 고 contigs 바이러스 게놈을 나타내는 식별 분류학 그룹에 게놈을 할당 합니다.

비디오: Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

&#39;단일 바이러스 게놈&#39;을 사용하여 단일 비리의 분리 및 유전체 분석

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

연구

면역학 및 감염병학

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

감염된 세포의 염색질에서 인플루엔자 바이러스 Ribonucleoprotein 컴플렉스의 동질 정제

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

에서 뇌 - 분리 된 백혈구의 분리 및 분석<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA에 감염된 마우스

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

새로운 도구는 HIV-1에 감염된 개인으로부터 규제 T 세포를 확장하려면

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency and type of chromosome aberrations in different cell types allows defects in DNA repair pathways to be elucidated. Understanding mammalian DNA repair biology has been greatly helped by the production of mice with knockouts in specific genes. The goal of this protocol is to quantify genomic instability in mouse B lymphocytes. Labeling of the telomeres using PNA-FISH probes (peptide nucleic acid - fluorescent in situ hybridization) facilitates the rapid analysis of genomic instability in metaphase chromosome spreads. B cells have specific advantages relative to fibroblasts, because they have normal ploidy and a higher mitotic index. Short-term culture of B cells therefore enables precise measurement of genomic instability in a primary cell population which is likely to have fewer secondary genetic mutations than what is typically found in transformed fibroblasts or patient cell lines.

DNA repair pathways are essential for maintenance of genomic integrity and preventing mutation and cancer. The goal of this protocol is to quantify genomic instability by direct observation of chromosome aberrations in metaphase spreads from mouse B cells using fluorescent in situ hybridization (FISH) for telomeric DNA repeats.

PNA-FISH에 의해 마우스 B 림프구에서 염색체 이상을 신속하게 분석

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

웨스트 나일 바이러스 돌연변이 균주의 감염에에서 MyD88 매개 세포 면역 반응의 생체 외 분석

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 T 세포의 기능 분석

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

새로운 세계 Zika 바이러스 전염성 클론으로부터 재조합 바이러스의 구조 및 특성 규명

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...