This work was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (2015R1A6A3A01020610 to HJP) and a grant from the Korean Health Technology R&amp;D Project, Ministry for Health, Welfare and Family Affairs, Republic of Korea (HI15C0493 to SJH).

본 연구에서는 마우스는 연세대 학교 연세 실험 동물 연구 센터의 특정 병원균이없는 시설에서 유지 하였다. 모든 동물 실험은 연세대 학교 연세 실험 동물 연구 센터의 국제 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 한국 식품 의약품 안전청 지침에 따라 실시 하였다. 솔루션 1. 준비 <ol><li> RPMI 1 % 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신에 소 태아 혈청 (FBS)을 희석하여 2 % RPMI 배지를 준비 </li><li> 전체 RPMI 미디어를 준비합니다. RPMI 미디어는 FBS의 10 %, 페니실린 - 스트렙토 마이신의 1 %, L- 글루타민의 1 %, 50 μM 2- 머 캅토 에탄올을 추가합니다. </li><li> 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS) 버퍼를 준비합니다. FBS의 2 %에 그래서, 보충 인산 완충 식염수 (PBS)를 수행합니다. </li><li> T 세포 분리 버퍼를 준비합니다. 이렇게하려면, FBS의 2 %, 2 MM의 ethylenediaminetetraa와 PBS를 보완cetic 산. </li></ol> 비장 림프구 2. 분리 <ol><li> 이전 19 설명 된 바와 같이 순진 또는 LCMV CL13에 감염된 마우스에서 비장을 제거하고 2 % RPMI 배지 10 ㎖를 포함하는 X 15mm 배양 접시 60mm에 배치합니다. 참고 :이 연구의 실험에서, 5 ~ 6 주령에 C57B1L / 6J 암컷 마우스 꼬리 정맥을 통해 정맥 주사를 통해 LCMV CL13의 2 × 10 6 플라크 형성 단위 (PFU)를 받았다. 16 일 후 감염 (16 D 파이) (25)에 쥐를 희생. 분석 GE의 일치 순진 마우스는 같은 날이었다. </li><li> 50 ㎖의 튜브에 세포 여과기를 넣고 2 % RPMI 배지 2 ㎖로 씻어. 70 μm의 셀 스트레이너에 비장를 놓고 주사기의 플런저를 사용하여 분쇄. 2 % RPMI 배지 2 ㎖로 셀 스트레이너를 씻어 50 ML 튜브에서 제거합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 2 % RPMI 매체와 원심 분리기로 튜브를 입력합니다. 뜨는을 취소하고를 재현 탁ACK 용균 완충액 1 ㎖의 세포 펠렛. 5 분 동안 실온 (RT)에서 샘플을 인큐베이션. 참고 : 위의 표시 ACK 용균 버퍼의 볼륨이 하나의 비장입니다. 풀링 비장 샘플 따라 볼륨을 확장 할 수 있습니다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 2 % RPMI 매체와 원심 분리기로 튜브를 입력합니다. 상층 액을 제거하고 완전한 RPMI 배지에서 1 × 107 세포 / ml의 농도로 세포를 재현 탁. 참고 : 트리 판 블루 만 혈구를 사용하여 염색되지 않은 세포를 살고 카운트 라이브 셀 카운팅, 얼룩 세포하십시오. </li></ol> 지라 기존의 T (T의 전환) 세포와 T의 등록 세포의 3 표현형 참고 : T의 등록 세포 분리하기 전에 다양한 항체와 세포를 염색 및 유동 세포 계측법에 의해을 분석하여 순진하거나 감염된 마우스에서 분리 된 비장 림프구의 표현형을 검사합니다. <ol><li> 세포의 50 μl를 전송새로운 U 바닥 96 웰 플레이트의 각 웰에 전체 비장 림프구 중 (5 × 105 세포) 및 웰 당 FACS 완충액 150 μL를 추가한다. 4 ℃에서 2 분 300 XG에 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 버린다. 세포 펠렛을 선동하고 잘 당 FACS 버퍼의 200 μl를 추가합니다. 4 ° C (2 회)에서 2 분 동안 300 XG에 원심 분리기. </li><li> 다음 항체 및 시약 잘 당 FACS 버퍼의 50 μL에 염색 세포 표면 마커에 대한 항체 칵테일을 준비합니다. 안티 CD4 보라색 염료, 항 CD25 녹색 염료, 항 PD-1 바이올렛 염료 항 CD8를 PerCP-Cy5.5 염료 및 세포 생존 검출 시약 근적외선 (IR​​) 형광 반응성 염료. 주 : 상기 활성화 된 T 등록 세포의 표현형을 분석은 항 CD103 (23, 25)은 세포 표면 마커 염색을 첨가 할 수있다. </li><li> 웰 당 항체 칵테일 중 50 μL와 세포 펠렛을 재현 탁. 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 로 두 번 세포를 씻으4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에 원심 분리하여 FACS 버퍼입니다. </li><li> 마지막 세척 단계 후, 상층 액을 가만히 따르다 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 제조 고정 버퍼 100 ㎕와 4 ° C에서 어둠 속에서 20 분 동안 세포를 고정합니다. </li><li> 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에 원심 분리하여 (제조사의 프로토콜에 따라 제조)을 permeabilization 세척 버퍼로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> Foxp3의 세포 내 염색 용 항체 용액을 제조하고, 반대로 Foxp3의 항체 용액 50 μL와 세포 펠렛을 재현 탁. 주 : 상기 항 CTLA이 단계에서 첨가 될 수있다 T 전환율 및 T의 등록 세포의 표현형을 분석. </li><li> 4 ° C에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어 및 단계 3.6를 반복합니다. 최종 세척 단계 후, FACS 완충액 200 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 유동 세포 계수기 (25)에 의해 세포의 표현형을 조사한다. </li><li> 게이트 살아있는 세포의 popula기. CD4 + 또는 CD8 + T 세포 중에서 PD-1 + 세포 - LCMV CL13 감염 동안 전환율 T 세포의 표현형 분석을 위해 Foxp3의 빈도를 조사한다. 주 : 실험 결과를 바탕으로, Foxp3의 비율 - PD-1 +는 LCMV CL13 16 D 파이에서 CD4 + 및 CD8 + T 세포 집단을 모두 50 % 이상이다. <ol><li> T의 등록 셀의 주파수 및 표현형을 분석, CD4 + T 세포 사이 Foxp3의 + 또는 + Foxp3의 PD-1 + 세포의 빈도를 조사한다. 주 : 실험 결과를 바탕으로, Foxp3의 + 또는 + Foxp3의 PD-1 + 세포의 비율은 각각, CD4 + T 세포 집단에서 20 % 이상이다. </li></ol></li></ol> CD4 + CD25 + T의 등록 세포의 4. 분리 참고 : 모든 시약의 볼륨은 아래에 표시된위한1 × 10 (7) 총 비장 세포의 세포 수를 시작. <ol><li> 순진하고 LCMV 만성적으로 감염된 마우스를 사용하여 2 절에 설명 된대로 세포를 준비합니다. T 세포 격리 완충액 10 ㎖를 첨가하여 세포를 세척 하였다. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전히 뜨는을 취소하고 버퍼의 40 μL의 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 자기 세포 분리 장치를 사용하여 CD4 + T 세포 농축을 위해, 바이오틴 항체 칵테일 중 10 μl를 넣고 잘 혼합한다. 4 ℃에서 10 분 동안 품어. </li><li> 버퍼의 30 μL, 비 CD4 + T 세포의 라벨링에 대한 안티 - 비오틴 마이크로 비드의 20 μL와 CD25 + 세포의 형광 라벨에 대한 CD25-PE 항체의 10 μl를 추가합니다. 잘 혼합하고 어둠 속에서 15 분 동안 품어. </li><li> 완충액 2 ㎖를 첨가하고 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 새로운 50 ㎖ 튜브에 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 셀을 통과한다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 씻으십시오.완전히 뜨는을 취소하고 최대 1.25 × 10 (8) 세포의 밀도로 500 μL 버퍼에 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 칼럼에 세포를 적용하고 열을 통과 레이블이없는 세포를 수집합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 버퍼와 원심 분리기 2 ㎖를 추가하여 열을 씻으십시오. 완전히 뜨는을 취소하고 버퍼의 90 μL에 고립 된 CD4 + T 세포를 재현 탁. </li><li> CD25 + 세포의 자기 표시를 들어, 안티 - PE 마이크로 비즈의 10 μl를 추가 잘 혼합, 4 ° C에서 어둠 속에서 15 분 동안 품어. </li><li> 버퍼 2 ㎖를 추가하고 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 씻는다. 완전하게 상층 액을 제거하고 최대 1 × 108 세포의 밀도로 완충액 500 μL에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> CD4 + CD25 + T의 등록 세포를 풍부하게하기 위해, 긍정적 인 선택을위한 칼럼에 세포를 적용하고, 콜 럼을 씻어완충액 2 ㎖를 첨가하여 N. 세탁 세 번 반복합니다. </li><li> 열이 최종 세척 단계 후 비면 컬럼 상 완충액 1 mL를 넣어 자화 표지 CD4 + CD25 +, 플런저를 사용하여 세포 플러시. </li><li> 반복 고립 된 CD4 + CD25 + T의 등록 세포의 순도를 향상시키기 위해 4.8-4.9 단계를 반복합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오. 상층 액을 제거하고 완전한 RPMI 배지에서 2 × 106 세포 / ml의 농도로 격리 CD4 + CD25 + T에 등록 세포를 재현 탁. </li><li> 단리-CD4 + CD25 + T의 등록 세포의 순도를 확인하려면 총 격리-CD4 + CD25 + T의 등록 세포에서 2 × 10 5 세포를 사용합니다. FACS 완충액 50 μL 안티 CD4 FITC를 함유 세포 생존율이 거의 IR 형광 반응성 염료 시약을 검출하여 세포를 염색. 참고 : CD25는 이미 분리시 PE로 표지 하였다. </li><li> 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오. 세정 후, FACS 완충액 100 ㎕의 세포 펠렛을 재현 탁하고 유동 세포 계측법에 의해 순도를 확인한다. </li><li> 게이트 라이브 세포 인구. T의 등록 세포의 순도를 분석, CD4 + CD25 + 세포의 비율을 확인. 주 : 실험 결과를 바탕으로, 정제 된 세포 중 CD4 + CD25 + 세포의 비율은 약 80 % 이상이다. </li></ol> CD8 + T 세포와 CD8 + T 세포의 라벨링 5. 분리 참고 : 모든 시약의 볼륨은 아래에 표시된 1 × 10 (7) 총 비장의 시작 세포 수에 대한 것입니다. <ol><li> 순진 마​​우스를 사용하여 2 절에 설명 된대로 세포를 준비합니다. T 세포 분리 버프 10 ㎖를 첨가하여 세포를 씻어어. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전히 뜨는을 폐기하고, 버퍼의 40 μL의 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 자기 세포 분리 시스템을 사용하는 CD8 + T 세포의 분리를 위해, 비 CD8 + T 세포 비오틴 표지 용 항체 칵테일 중 10 μl를 넣고 잘 혼합한다. 4 ℃에서 5 분 동안 품어. </li><li> 버퍼의 30 μL 및 안티 - 비오틴 마이크로 비즈의 20 μl를 추가합니다. 잘 믹스 4 °​​ C에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> 칼럼에 세포를 적용하고 열을 통과 레이블이없는 세포를 수집합니다. 버퍼 세번 2ml를 첨가하여 열을 씻는다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전히 뜨는을 취소하고 버퍼 2 ㎖에 고립 된 CD8 + T 세포를 재현 탁. </li><li> 분리 된 세포의 순도를 확인하려면, FACS 버퍼에 항체 용액 50 μl를 준비합니다. 절연 CD8 + T의 CEL 중에서 2 × 105 세포를 재현 탁항체 용액 50 μL에 LS. 참고 : 안티 - CD8 FITC 추가, 항체 용액을 제조하고, 세포 생존 검출 시약 (근적외선 형광 반응 염료) FACS 버퍼로합니다. </li><li> 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 FACS 완충액으로 세포를 씻으십시오. 세정 후, FACS 완충액 100 ㎕의 세포 펠렛을 재현 탁하고, 유세포 분류법으로 세포의 순도를 확인한다. </li><li> 게이트 라이브 세포 인구. CD8 + T 세포의 순도를 확인하기 위해, CD8 + T 세포의 비율을 확인. 주 : 실험 결과를 바탕으로, 정제 된 세포 중 CD8 + 세포의 비율은 약 90 % 이상이다. </li><li> 격리 된 CD8 + T 세포에 PBS를 추가합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다. PBS에 1 × 107 세포 / ml의 농도로 단리 CD8 + T 세포를 재현 탁. </li><li> CD8 + T 가전에 레이블을 지정하려면시험 관내 억제의 분석을위한 LLS은 RT에서 5 μM의 농도를 얻기 위해 PBS에 세포 증식 추적 바이올렛 염료 희석. 참고 : 본 연구에 사용 된 세포 증식 추적 바이올렛 염료의 대략 여기 및 발광 피크는 각각 405 및 450 나노 미터이다. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 세포 증식 추적 보라색 염료 (5 μM) 세포 현탁액 (CD8 + T 세포를 1 × 107 세포 / ml)의 균등 한 양을 혼합하고 37 ° C에서 20 분간 인큐베이팅 하였다. 튜브마다 10 분을 소용돌이. </li><li> 감기 전체 RPMI 미디어와 튜브를 입력하고 실온에서 10 분 동안 튜브를 둡니다. 실온에서 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. 완전하게 상층 액을 제거하고 예열 된 완전한 RPMI 배지로 2 × 106 세포 / ml의 농도로 세포를 재현 탁. RT에서 15 분 동안 세포를 인큐베이션. </li></ol> 6. CD4 + CD25 + T를 &lt;사용하여 체외 억제 분석 설정서브&gt; 등록 번호 및 CD8 + T 세포 <ol><li> 항 CD3 / CD28 코팅 구슬을 준비하려면, 관의 15 ㎖ (2.5 μL / 1 × 10 5 세포)에 자석 구슬의 적절한 볼륨을 전송합니다. PBS의 동일한 볼륨을 추가하고 혼합한다. 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세척하고 상층 액을 버린다. 전체 미디어의 자기 구슬을 (50 μL / 웰) 희석. </li><li> CD4 + CD25 + T의 등록 세포의 나누어지는 50 μL U-바닥 96 웰 플레이트의 웰 당 (1 × 10 5 세포 / 웰). 응답자 T (T의 RESP)와 같은 CD8 + T 세포 세포 물론 당 (1 × 10 5 세포 / 웰)의 50 μl를 추가합니다. 물론 당에 희석 항 CD3 / CD28 코팅 구슬의 50 μl를 추가합니다. 참고 : 다음과 같이 제어 우물을 설정할이 단계, 레이블 및 : 없음 항 CD3 / CD28 코팅 구슬 &quot;만 자극되지 CD8 + T 세포를&quot;; &quot;CD8 + T 세포 만&quot;항 CD3 / CD28 코팅 구슬; &quot;CD8 + T 세포 만&quot;항 CD3 / CD28 코팅 구슬;&quot;. T의 등록 세포 만 &quot;항 CD3이 / CD28 코팅 구슬 T의 등록 세포는 T의 서로 다른 비율로 전체 미디어와 공동 배양 T의 인공 호흡기 세포에 의해 희석 될 수있다 RESP 세포 : T 세포의 레지 (1 : 0.25-1 : 1). </li><li> 200 μL의 총 부피에 대한 모든 우물에 50 μL 또는 미디어의 적절한 볼륨을 추가합니다. 호일로 접시를 덮고 72 시간 동안 37 ° C에서 CO 2 배양기에서 배양한다. </li></ol> CD8 + T 세포 7. 분석 CD8의 + T 세포 증식 및 사이토 카인 생산 <ol><li> 사이토 카인 생산 분석을 위해, 문화 3 일 후, 물론 다른 플레이트에 각각의 상층 액을 분리하여 효소 면역 분석법 (ELISA)을 수행합니다. 주 : 상등액을 분취하고 -70 ℃에서 저장 될 수있다. 이 실험에서, 항 마우스 IFN-γ 항체 - 코팅 된 플레이트는 IFN-γ 생산 일치를 검출하는 데 사용제조 업체의 프로토콜에 보내고. 단일 세포 수준에서 CD8 + T 세포 증식의 IFN-γ 생산을 결정하기 위해, 세포 내 사이토 카인 염색법을 행할 수있다. </li><li> 각 우물에서 뜨는을 분리 한 후, 4 ° C (3 회)에서 2 분 동안 300 XG에 FACS 버퍼와 원심 분리기로 세포를 포함하는 접시를 씻으십시오. </li><li> 세척 후, 상층 액을 버린다. 증식 된 CD8 + T 세포의 염색 항체 칵테일 중 50 μL와 세포 펠렛을 재현 탁. 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 품어. 참고 : FACS 버퍼에 방지 CD4 FITC, 안티 - CD8를 PerCP-Cy5.5 및 세포 생존 검출 시약 (근적외선 형광 반응 염료)를 추가, 항체 칵테일을 준비합니다. 참고 사항 : CD44 또는 CD69 각종 마커에 대한 항체는 CD8 + T 세포의 활성화를 확인하는 다른 항체와 결합 될 수있다. CD8 + T 세포가 이미 증식 추적 V로 표지 된 기억단계 5.10에서 iolet 염료. </li><li> 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 두 번 씻으십시오. 마지막 세척 단계 후, 상층 액을 제거하고, 고정 버퍼 100 ㎕와 4 ° C에서 어둠 속에서 20 분 동안 세포를 고정합니다. </li><li> 4 ° C에서 2 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 두 번 씻으십시오. FACS 완충액 200 μL로 세포를 재현 탁하고 유동 세포 계측법에 의한 세포 증식 추적 바이올렛 염료 표지 된 CD8 + T 세포의 증식을 측정한다. <ol><li> 게이트 생균 중 CD8 + T 세포 집단. 세포 증식 추적 바이올렛 염료 및하기 식에있어서 CD8 + T 세포 희석액의 희석에 따른 분할 전적인 세포의 비율을 측정한다. 억제 % = [(T의 등록 세포의 부재하에 증식 된 CD8 + T 세포의 % - T에 등록 세포의 존재 하에서 증식 된 CD8 + T 세포의 %) / (%에서 증식 된 CD8 + T 세포T 세포의 등록의 유무)] X (100)는 또한 소프트웨어 (25) 유동 세포 계측법을 사용하여 데이터를 분석한다. </li></ol></li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recruitment+of+regulatory+T+cells+in+ovarian+carcinoma+fosters+immune+privilege+and+predicts+reduced+survival.">Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival.</a> Nat Med. 10 (9), 942-949 (2004).</li><li>Dittmer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+impairment+of+CD8(+)+T+cells+by+regulatory+T+cells+during+persistent+retroviral+infection.">Functional impairment of CD8(+) T cells by regulatory T cells during persistent retroviral infection.</a> Immunity. 20 (3), 293-303 (2004).</li><li>Robertson, S. J., Messer, R. J., Carmody, A. B., Hasenkrug, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+suppression+of+CD8++T+cell+function+by+Friend+virus-induced+regulatory+T+cells.">In vitro suppression of CD8+ T cell function by Friend virus-induced regulatory T cells.</a> J Immunol. 176 (6), 3342-3349 (2006).</li><li>Iwashiro, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunosuppression+by+CD4++regulatory+T+cells+induced+by+chronic+retroviral+infection.">Immunosuppression by CD4+ regulatory T cells induced by chronic retroviral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9226-9230 (2001).</li><li>Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C. D., Lee, S., Rouse, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25++T+cells+regulate+virus-specific+primary+and+memory+CD8++T+cell+responses.">CD4+CD25+ T cells regulate virus-specific primary and memory CD8+ T cell responses.</a> J Exp Med. 198 (6), 889-901 (2003).</li><li>Suvas, S., Azkur, A. K., Kim, B. S., Kumaraguru, U., Rouse, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4+CD25++regulatory+T+cells+control+the+severity+of+viral+immunoinflammatory+lesions.">CD4+CD25+ regulatory T cells control the severity of viral immunoinflammatory lesions.</a> J Immunol. 172 (7), 4123-4132 (2004).</li><li>Veiga-Parga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+regulatory+T+cells+during+viral-induced+inflammatory+lesions.">On the role of regulatory T cells during viral-induced inflammatory lesions.</a> J Immunol. 189 (12), 5924-5933 (2012).</li><li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signature+of+CD8++T+cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection.">Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection.</a> Immunity. 27 (4), 670-684 (2007).</li><li>Jin, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperation+of+Tim-3+and+PD-1+in+CD8+T-cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection.">Cooperation of Tim-3 and PD-1 in CD8 T-cell exhaustion during chronic viral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14733-14738 (2010).</li><li>Punkosdy, G. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+upregulated+on+regulatory+T+cells+during+chronic+virus+infection+enhances+the+suppression+of+CD8++T+cell+immune+response+via+the+interaction+with+PD-L1+expressed+on+CD8++T+cells.">PD-1 upregulated on regulatory T cells during chronic virus infection enhances the suppression of CD8+ T cell immune response via the interaction with PD-L1 expressed on CD8+ T cells.</a> J Immunol. 194 (12), 5801-5811 (2015).</li><li>Virgin, H. W., Wherry, E. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cells+suppress+in+vitro+proliferation+of+virus-specific+CD8++T+cells+during+persistent+hepatitis+C+virus+infection.">Regulatory T cells suppress in vitro proliferation of virus-specific CD8+ T cells during persistent hepatitis C virus infection.</a> J Virol. 79 (12), 7852-7859 (2005).</li><li>Sekiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+orphan+receptor+Nr4a2+induces+Foxp3+and+regulates+differentiation+of+CD4.">The nuclear orphan receptor Nr4a2 induces Foxp3 and regulates differentiation of CD4.</a> T cells. Nat Commun. 2 (269), (2011).</li><li>Merianos, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+alloantibodies+induce+a+postnatal+immune+response+that+limits+engraftment+following+in+utero+hematopoietic+cell+transplantation+in+mice.">Maternal alloantibodies induce a postnatal immune response that limits engraftment following in utero hematopoietic cell transplantation in mice.</a> J Clin Invest. 119 (9), 2590-2600 (2009).</li><li>Allakhverdi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CD103+identifies+human+regulatory+T-cell+subsets.">Expression of CD103 identifies human regulatory T-cell subsets.</a> J Allergy Clin Immunol. 118 (6), 1342-1349 (2006).</li><li>Camisaschi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LAG-3+expression+defines+a+subset+of+CD4(+)CD25(high)Foxp3(+)+regulatory+T+cells+that+are+expanded+at+tumor+sites.">LAG-3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites.</a> J Immunol. 184 (11), 6545-6551 (2010).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GARP+selectively+identifies+activated+human+FOXP3++regulatory+T+cells.">Expression of GARP selectively identifies activated human FOXP3+ regulatory T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13439-13444 (2009).</li><li>Myers, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-2-independent+and+TNF-alpha-dependent+expansion+of+Vbeta5++natural+regulatory+T+cells+during+retrovirus+infection.">IL-2-independent and TNF-alpha-dependent expansion of Vbeta5+ natural regulatory T cells during retrovirus infection.</a> J Immunol. 190 (11), 5485-5495 (2013).</li></ol>

S.-J.H. has a patent and receives patent royalties related to the PD-1 pathway. The other authors have no financial conflicts of interest.

T 세포의 레지 단지 소수 쥐와 인간에서 존재하지만, 그들은 면역 반응을 조절하고 면역 관용을 유지하는데 중요한 역할을 그들의 기능을 이해하는 것이 중요하다. T의 수와 억제 기능은 만성 바이러스 감염 15-20뿐만 아니라 암의 진행 도중 13,14 세포 증가 REG. 이것은 아마도 계속 항원 자극에 기인한다. 레지 세포 항원 지속성 및 질병 개발 함수 T를 평가하기 위해, 자신의 억제 활성을 측정 할 필요가있다. 여기서는 T에 등록 세포의 생체 표현형 분석 및 CD8 + T 세포와 T에 등록 세포의 시험 관내 공동 배양 시스템을 사용하여 억제 활성을 측정하는 프로토콜을 기술한다. 현재 프로토콜의 중요한 단계는 분석 및 T의 등록 세포의 분리이다. 라이브 갓 절연 T <sub&gt; 등록 세포는 체외에서 명확한 억제 활동을 보여줍니다. 또한 만성 바이러스 감염 동안 T 전환율 및 T의 등록 세포의 표현형을 조사 하였다. 전환율 T 세포, 즉 Foxp3의 - CD4 + 및 CD8 + T 세포는 만성 바이러스 감염 (도 1) 후 세포 활성의 감소를 보였다. 는 PD-1 발현은 모두 T 전환율 세포 집단에서 상향 조절되었다. T의 등록 세포 수 증가까지 조절 PD-1 발현은 만성 바이러스 감염시의 면역 반응의 특징이다. 또한 이러한 TIM-3 및 CTLA-4와 같은 다른 수용체에 대한 저해 방지기구는 choric 바이러스 감염 후 FACS에 의한 T 세포의 표현형을 조사 PD-1과 결합하여 사용될 수있다. 억제 활성을 조사하기 위하여, T의 RESP 세포와 T에 등록 된 T 세포의 등록 1 1로 공 배양의 비율로 공 배양했다나이브 마우스의 T 세포의 등록에 비해 만성적으로 감염된 마우스의 세포는 상당히 CD8 + T 세포 증식 및 IFN-γ 분비를 감소시켰다. 이것은 등록 된 T 세포와 공동 배양 된 CD8 + T 세포의 증식 및 사이토 카인 생산은 역 T에 등록 세포의 억제 기능에 관계하고 있음을 의미한다. 이 프로토콜은 비 등록 된 T 세포와 T 세포의 레지 분리 오염위한 자기 세포 분리 시스템의 사용을 권장하고 있지만 배제 할 수 없다. CD25 종종 활성화 CD4 + T 전환뿐만 아니라 T에 등록 세포에서 과발현으로 Foxp3의-GFP 리포터 생쥐 28-30에서 얻어진 T에 등록 셀은 정확하게 자기 세포 분리 시스템보다 T의 레지 세포의 기능을 연구하기 위해 더 좋은 후보들이다. T의 등록 세포의 억제 기능은 다양한 생체 외 평가 된억제 분석 16,28,31-34. 시험 관내 억제 분석의 장점은 단지 T의 RESP 세포가 T에 등록 세포와 공동 배양하기 때문에 그것은 상기 CD8 + T 세포 반응의 억제에 대한 T에 등록 세포의 직접적인 영향을 평가하는 것이다. CD8 + T 세포뿐만 아니라, CD25 - CD4 + T 세포를 대신 T 세포의 RESP (25)에 사용될 수있다. 이러한 수지상 세포 또는 천연 킬러 세포와 같은 면역 세포에 T의 등록 또는 T 세포의 전환의 영향 실험 조건을 변화시킴으로써 평가 될 수있다. 반복 당 단백질 등 CD103 35 LAG-3 36 분자, CD43 38, CD11a에 38 37 우세 또는 킬러 세포 렉틴 형 수용체 아과 G 부재 (1) (38)는 특정 질환에서 활성화 된 T 등록 세포의 마커로 사용되었다. 이 프로토콜에서, 우리는 같은 PD-1을 사용하여지표는 만성 바이러스 감염시 T의 등록 세포를 활성화 식별합니다. 이 프로토콜은 특정 조건에서의 T 세포 등록 다각적 분석 (표현형 및 기능)에 사용될 수있다.

규제 T (T의 REG) 세포는 개발 및 기능 1 전사 인자로 forkhead 상자 P3 (Foxp3의)을 표현한다. 또한, T의 등록 세포는 CD25이 림프구 활성화 유전자 3 (LAG-3) (3), 글루코 코르티코이드 - 유도 된 종양 괴사 인자 수용체 (4) 및 세포 독성과 같은 다양한 분자를 발현 T 림프구 회합 단백질 4 (CTLA-4) (5) 그 표면 또는 세포 내 영역에. 바이러스 6,7, 8,9 박테리아, 기생충 10-12 또는 암 13,14 개발 과정에서 병원체 각종 만성 감염 동안 T에 등록 셀은 향상된 억제 기능을 표시 활성화 세포로 분화 될 대상 이펙터 CD4 +와 CD8 + T 세포. 많은 논문 확장 활성화 T에 등록 세포가 손상된 CD8 + T 세포 응 답에 기여한다고 제안했다친구 레트로 바이러스 (FV) 감염 15 ~ 17시 전자. FV 유발 T에 등록 셀은 IFN-γ 또는 그랜 자임 B 발현 및 CD8 + T 세포의 세포 독성 15-17 반응성을 억제한다. 또한, 단순 포진 바이러스 감염 모델에서, 이는 바이러스 - 특이적인 CD8 + T 세포 및 immunopathogenic CD4 + T 세포를 18-20의 침윤 심각한 조직 손상의 확대 결과 CD4 + CD25 + T에 등록 세포의 고갈을보고 하였다. 림프 구성 맥락 수막염 바이러스의 복제 13 균주 만성적으로 감염된 마우스 (LCMV CL13) 21-24 널리 만성 바이러스 감염 동안 효과기 T 세포 (T의 EFF) 및 T의 등록 세포의 표현형 및 기능을 특성화하는데 사용되어왔다. 영구 LCMV 감염시 바이러스 관련 T EFF의 세포는 점차적으로 자신의 이펙터 기능을 잃고 지쳐 T (T의 배기) 세포가된다. 한편, T에서레지 세포는 바이러스 특이 적 T 세포 반응 (25)을 억제하는 능력을 강화한다. T 개의 EFF 셀의 작동 능력의 감소는 이러한 T EFF 세포 억제 성 수용체의 상향 조절, 항원 제시 세포의 변경 기능, 면역 조절 사이토 카인의 생산 및 증가 된 주파수 또는 T의 등록 향상된 기능 등 여러 가지 요인들에 의해 설명 될 수있다 세포 26. T 세포 억제에 관여하는 요소 중에서, 프로그램 된 세포 사멸 단백질 -1 (PD-1) 발현 T의 배기 세포와 T에 등록 세포 널리 항원 지속성 및 억제 환경의 특징으로 간주되어왔다. 최근에는 T의 등록 셀의 PD-1 경로의 폐색 및 제거를 향상 T 세포의 기능을 야기한다는보고 LCMV 만성 감염시 바이러스로드 (27)가 감소 하였다. 또한, T의 등록 세포는 LCMV (23, 25)와 쥐의 만성 감염시 활성화 </s업&gt;과 억제 기능 (25)을 강화한다. PD-1은 높은 T에 등록 세포뿐 아니라 T의 배기 세포 발현되며, PD-1 T에 등록 세포에 의해 발현 수준은 T 세포의 증식 (25)을 억제하는 그들의 억제 기능의 강도와 상관 관계. 여기서는 LCMV CL13 및 나이브 마우스로부터 단리 휴지 T에 등록 세포 감염 쥐로부터 분리 활성화 T 등록 세포의 특성을 비교하는 방법을 설명한다. 더욱이, 우리는 활성화 된 T 세포의 레지 분리 및 표현형 생체 검사뿐만 아니라 시험 관내에서의 억제 활성을 측정하기위한 일련의 처리를 설명한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="976">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:383px;">FITC Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td style="width:67px;">RM4-5</td>
			<td style="width:173px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:104px;">553047</td>
			<td style="width:249px;">Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytofix/Cytoperm</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Use this reagent for cell surface staining.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">U-Bottom Tissue Culture Plates</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fixation buffer</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">554655</td>
			<td>Use this reagent for cell surface staining.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC Rat Anti-Mouse CD25</td>
			<td>7D4</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553072</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer, 70mm</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352350</td>
			<td>Use this strainer for grinding the whole spleen.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainer, 40mm</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352340</td>
			<td>Use this strainer for filtering the cells before column enrichment.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brilliant Violet 421 Anti-mouse CD279 (PD-1)</td>
			<td>29F.1A12</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>135217</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brilliant Violet 605 Anti-Mouse CD4</td>
			<td>RM4-5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td align="right">100547</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">APC Anti-Mouse/Rat Foxp3&#160;</td>
			<td>FJK-16s</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-5773</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td>
			<td></td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-5223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP-Cyanine5.5 Anti-Mouse CD8a</td>
			<td>53-6.7</td>
			<td>eBiosicence</td>
			<td>45-0081</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 100X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse IFN-gamma Platinum ELISA</td>
			<td></td>
			<td>eBiosicence</td>
			<td>BMS606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td></td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS (1X)</td>
			<td></td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td></td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine, 200mM solution</td>
			<td></td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin, 10,000U/mL</td>
			<td></td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td></td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-34975</td>
			<td>Please determine appropriate concentration. In this protocol, this reagent was diluted 500X in FACS buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-104-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-091-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS Separation Columns, LD columns</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td>Use this column for Treg cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS Separation Columns, LS columns</td>
			<td></td>
			<td>Miltenyibiotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Use this column for CD8+ T cell and Treg cell isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA, 0.5M (pH 8.0)</td>
			<td></td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td></td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td></td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30919.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellTrace Violet Cell Proliferation Kit</td>
			<td></td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C34557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Canto II flowcytometer</td>
			<td></td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometer*</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flowjo</td>
			<td></td>
			<td>TreeStar</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry software&#8224;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematocytomer</td>
			<td></td>
			<td>Marienfeld superior</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phenotypic and functional analysis of activated regulatory t cells isolated from chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice

전사 인자로서 Foxp3를 표현 규제 T (T의 REG) 세포, CD4 + T 세포의 서브 세트이다. T의 등록 세포는 면역 반응을 조절함으로써 면역 관용과 항상성 유지에 중요한 역할을한다. T의 등록 세포의 주요 역할은 효과기 T (T의 EFF) 세포의 증식 및 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2와 같은 사이토 카인의 생성을 억제하는 것이다. EFF는 T 세포의 기능을 억제하는 T 세포의 레지 능력 영구 병원체 감염, 암 개발 중에 향상된 것이 증명되었다. 휴식 또는 염증 상태에서 T 세포에 등록하는 기능, 마우스 또는 인간 T 등록 세포를 이용한 시험 관내 억제 분석 다양한 고안되었다을 명확히한다. 본 연구의 주된 목적 표현형과 휴식 사이 억제 기능의 차이와 활성화 T의 등록과 비교하는 방법을 개발하는 것이다세포. 활성화 된 T 레지 세포를 분리하기 위해, 마우스, 림프 구성 맥락 수막염 바이러스 (LCMV) 클론 13 (CL13)을 LCMV 만성 피로를 감염시켰다. LCMV CL13 감염된 마우스의 비장으로부터 분리 된 T 세포는 등록 나이브 마우스로부터 단리 된 T 세포를 등록 쉬고 비하여 활성화 된 표현형 향상된 억제 활성을 모두 나타내었다. 여기서는 등록 된 T 세포 휴식에서 활성화 된 T 세포를 등록 구별 생체 표현형 분석을위한 기본 프로토콜을 설명한다. 더욱이, 우리는 완전히 활성화 T에 등록 세포의 억제 활성의 측정을위한 프로토콜을 기술한다.

우리는 정맥 LCMV CL13의 2 × 10 6 PFU로 주입함으로써 지속적인 바이러스 감염 쥐를 생성합니다. T의 등록 세포 및 만성 바이러스 감염시 T 전환 세포의 표현형 변화를 조사하기 위해, 순진 감염된 마우스에서 얻은 비장 림프구는 다양한 항체로 염색 및 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. CD4 + T의 전환 (그림 1A, 상단 패널)와 Foxp3의 - - CD8 + T의 전환 (그림 1B, 상단 패널) 셀 (16) 라 파이에서, PD-1은 Foxp3를 모두 상향 조절했다. Foxp3의 + CD4 + T 세포의 레지의 주파수는 나이브 마우스 (도 1a)에서보다 LCMV CL13 감염된 마우스의 두 배 이상이었다. 특히, Foxp3의 + CD4 + T 세포의 레지 대부분은 높은 수준의 발현, 활성화 된 표현형을 표시PD-1이 시점 (그림 1A)에서. 시험 관내 억제 분석을 위해, CD8 + T 세포의 전환 및 CD4 + CD25 + T 세포의 레지 상당수가 필요 하였다. 1 × 10 7 세포 증식 추적 보라색 염료 표지 CD8 + T 세포를 얻기 위해, 순진한 마우스의 두 비장의 비장 세포가 풀링되었다. 2 × 6 또는 CD4 + CD25 + T에 등록 셀 × 106 (3)을 얻기 위해, 순과 LCMV CL13 감염된 마우스에서 적어도 세 비장 각각 모았다. T의 RESP 세포와 같은 CD8 + T 세포는 다른 면역 세포 (도 2A)와 상당한 오염없이 성공적으로 분리 하였다. T 세포의 등록은 또한 80 % 이상의 순도 (도 2B)과 CD25 + CD4 + T 세포의 지배적 인구 단리 될 수있다. 나이브 만성 T에 등록 세포의 억제 기능을 비교하기 위해 분리 된 T의 등록 및 T의 RESP 세포를 3 일 동안 37 ° C에서 항 CD3 / CD28 - 코팅 비드 자극 하에서 함께 배양 하였다. CD8 + T RESP 세포 증식 억제율 (%)은 T 세포의 레지 DESE 의존적 (도 3A)에서 증가 하였다. CD8 + T의 RESP 셀 1의 비율로 만성 T에 등록 세포와 공동 배양 한 경우, 1, CD8 + T의 RESP 세포의 증식이 크게 (도 3b)을 억제 하였다. CD8 + T의 RESP 세포가 만성적으로 감염된 마우스에서보다는 T의 등록에 나이브 마우스로부터 T에 등록 세포 쉬고 활성화 T 등록 세포와 공동 배양시 CD8 + T의 RESP 세포에 의해 IFN-γ의 생산도 현저하게 억제했다 </서브&gt; 셀 용량 의존적으로 (도 3C). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54138/54138fig1.jpg" /> 그림 1 : 16 D 파이 (A) PD-1 또는 Foxp3의에서 CD25의 발현에 순진 마우스 또는 LCMV CL13에 감염된 생쥐의 비장에 CD4 +와 CD8 + T 세포의 표현형 - CD4 + T의 전환과 Foxp3의 + CD4 + T의 등록 세포. Foxp3의에서 PD-1 또는 CD25의 (B) 표현 - CD8 + T의 전환 세포. 비장 림프구는 CD4, CD8, CD25, PD-1과 Foxp3의에 대한 항체로 염색 하였다. 데이터는 세개의 독립된 실험의 대표 값이다. 패널 A는 기준으로 25에서 수정되었습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54138/54138fig1large.jpg" target="_blank">를 클릭하십시오</a><html> 여기이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54138/54138fig2.jpg" /> 도 2 : 나이브 또는 LCMV CL13 감염 쥐로부터 분리 나이브 마우스 및 T의 등록 세포로부터 단리 된 T 세포의 RESP 순도 분리 후에 CD8 + T 세포 (A) 백분율.. 분리 후, CD25을 발현하는 CD4 + T 세포의 레지의 (B) 백분율. (B)의 각 사분면은 CD4 및 CD25의 발현 수준을 결정 하였다. 데이터는 3 개의 독립적 인 실험의 대표입니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54138/54138fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 레 / ftp_upload / 54138 / 54138fig3.jpg &quot;/&gt; 도 3 : CD8 + T 세포 반응에 대한 활성화 된 T 등록 셀의 영향은 T에 등록 세포 용량 - 의존적으로 T에 등록 세포와 공동 배양 된 CD8 + T 세포 (A) % 억제.. 1 T에 등록 세포와 공동 배양 된 CD8 + T 세포 (B) 확산도 : 1 비율. T 자 등록의 셀 용량 의존적으로 T에 등록 세포와 공동 배양 된 CD8 + T 세포 (C) IFN-γ 생성. CD8 + T 세포의 증식은 증식 된 CD8 + T 세포 및 IFN-γ 분비 세포 증식 추적 바이올렛 염료 희석 측정은 ELISA에 의해 평가 하였다. 세포 증식 추적 바이올렛 염료 표지 된 CD8 + T 세포는 T의 부재 또는 존재하에 3 일간 항 CD3 / CD28 - 코팅 비드로 자극했다 <s순진 또는 만성 감염 마우스 중 하나에서 고립 UB&gt; 등록 번호 세포. 히스토그램에서, 괄호가없는 숫자로 각각와 T 세포의 레지없이 공 배양 CD8 + T 세포의 증식 비율을 나타낸다. 히스토그램 채워진 회색 피크 T의 등록없이 세포 공 배양 CD8 + T 세포의 증식을 나타낸다. 각 그룹은 삼중으로 설계되었다. 막대는 + SEM을 의미 나타냅니다. 이 수치는 기준으로 25에서 수정되었습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54138/54138fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

표현형 및 만성 림프 구성 맥락 수막염 바이러스에 감염된 마우스에서 고립 활성화 규제 T 세포의 기능 분석

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

phenotypic-functional-analysis-activated-regulatory-t-cells-isolated

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.7K 조회수.  Yonsei University. Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from naïve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

비디오: Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

연구

면역학 및 감염병학

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

새로운 도구는 HIV-1에 감염된 개인으로부터 규제 T 세포를 확장하려면

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

Systemic Injection of Neural Stem/Progenitor Cells in Mice with Chronic EAE

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative neurology. This directive has arisen from the extensive evidence that brain repair is achieved after focal or systemic NPC transplantation in several preclinical models of neurological diseases.
These experimental data have identified the cell delivery route as one of the main hurdles of restorative stem cell therapies for brain diseases that requires urgent assessment. Intraparenchymal stem cell grafting represents a logical approach to those pathologies characterized by isolated and accessible brain lesions such as spinal cord injuries and Parkinson's disease. Unfortunately, this principle is poorly applicable to conditions characterized by a multifocal, inflammatory and disseminated (both in time and space) nature, including multiple sclerosis (MS). As such, brain targeting by systemic NPC delivery has become a low invasive and therapeutically efficacious protocol to deliver cells to the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system (CNS).
This alternative method of cell delivery relies on the NPC pathotropism, specifically their innate capacity to (i) sense the environment via functional cell adhesion molecules and inflammatory cytokine and chemokine receptors; (ii) cross the leaking anatomical barriers after intravenous (i.v.) or intracerebroventricular (i.c.v.) injection; (iii) accumulate at the level of multiple perivascular site(s) of inflammatory brain and spinal cord damage; and (i.v.) exert remarkable tissue trophic and immune regulatory effects onto different host target cells in vivo.
Here we describe the methods that we have developed for the i.v. and i.c.v. delivery of syngeneic NPCs in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), as model of chronic CNS inflammatory demyelination, and envisage the systemic stem cell delivery as a valuable technique for the selective targeting of the inflamed brain in regenerative neurology.

The transplantation of neural stem/progenitor cells (NPCs) holds great promises in regenerative neurology. The systemic delivery of NPCs has turned into effective, low invasive, and therapeutically very efficacious protocol to deliver stem cells in the brain and spinal cord of rodents and nonhuman primates affected by experimental chronic inflammatory damage of the central nervous system.

만성 EAE와 마우스의 신경 줄기 / 전구 세포의 전신 주입

Neural stem/precursor cells (NPCs) are a promising stem cell source for transplantation approaches aiming at brain repair or restoration in regenerative ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

T 세포의 유도<em&gt; 체외</em&gt; 마우스 배아 줄기 세포에서

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T 세포는 수지상 세포에서 Transinfection에 의해 박테리아를 캡처

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with respect to how viral members of the microbiome affect subsequent microbe interactions with these virus-infected host cells. The co-habitation of virus with bacteria and fungi is principally present on the mucosal surfaces of the oral cavity and genital tract. Mucosal cells, particularly those with persistent chronic or persistent latent viral infections, could have a significant impact on members of the microbiome through virus alteration in number and type of receptors expressed. Modification in host cell membrane architecture would result in altered ability of subsequent members of the normal flora and opportunistic pathogens to initiate the first step in biofilm formation, i.e., adherence. This study describes a method for quantitation and visual examination of HSV&#39;s effect on the initiation of biofilm formation (adherence) of S. aureus and C. albicans.

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

박테리아와 균류에 의해 바이러스에 감염된 세포에 바이오 필름 개시의 결정

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the allograft early after transplantation, mount a graft reactive response against the transplanted organ, and initiate organ rejection2. Recent data suggest that suppressive macrophages facilitate successful long-term transplantation3 and are required for the induction of transplantation tolerance4. This suggests a multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation, and function, which demands a new roadmap for the isolation and analysis of macrophage function5. Due to the plasticity of macrophages, it is necessary to provide a methodology to isolate and characterize macrophages, depending on the tissue environment, and to define their functions according to different scenarios. Here, we describe a protocol for immune characterization of graft-infiltrating macrophages and the methods we used to functionally evaluate their capacity to inhibit CD8+ T proliferation and to promote CD4+Foxp3+ Treg expansion in vitro.

Macrophages are plastic cells of the hematopoietic system that have a crucial role in protective immunity and homeostasis. In this report, we describe optimized in vitro techniques to phenotypically and functionally characterize graft-infiltrating regulatory macrophages that accumulate in the transplanted organ under tolerogenic conditions.

이식 반응 면역을 억제하는 조절 성 마크로파지의 기능적 특성 규명

Macrophage accumulation in transplanted organs has long been recognized as a feature of allograft rejection1. Immunogenic monocytes infiltrate the ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.