Name: analysis of beta-cell function using single-cell resolution calcium imaging in zebrafish islets
Uploaded: 2018-07-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets at JoVE.com

우리가 원고, 재생 치료 드레스덴 (CRTD) 물고기와 현미경 시설 기술 지원 센터의 회원에 의견에 대 한 Ninov 연구소의 회원을 감사합니다. N.N.는 DFG-CRTD, TU-드레스덴, 독일 연구 재단 (DFG) 및 당뇨병 연구 (DZD)를 위한 독일 센터에 우수 클러스터에서에서 자금에 의해 지원 됩니다.

동물 주제를 포함 하 여 모든 절차 Landesdirektion 뉴 스타트 인섹 센, 독일 (AZ 24-9168.11-1/2013-14, T12/2016)의 허가 동물 복지 행위에 의해 승인 되었습니다가지고.
1입니다. 준비
참고:이 프로토콜은 이중 유전자 변형 Tg에서 zebrafish 주 섬의 비보 전 영상 (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 제 브라. 이 유전자 변형 라인에서 인슐린 발기인 (ins) 드라이브 두 transgenes의 베타 세포 특정 식: nls-Renilla-mKO2, 단위체 Kusabira 오렌지 2 (mKO2)와 베타 세포의 핵을 표시 형광; 그리고 GCaMP6s15, 세포내 칼슘 수준에 증가에 대 한 응답에서 녹색 형광을 방출 한다. GCaMP6s의 베타 세포 특정 식 세포 유형 주변에 칼슘 변화에서 간섭 없이 베타 세포의 포도 당 응답을 공부 하 고 있습니다.
<ol><li>캘리포니아2 +/Mg2 +의 1 mL에 소 fibrinogen의 10mg을 용 해 하 여 신선한 fibrinogen 주식 (10mg/mL) 준비-행 크 스 균형 소금물 (HBSS) 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 들어 있는. Fibrinogen 파우더까지 적극적으로 소용돌이 완전히 녹 인 다. 더 이상 15 분 동안 실내 온도에 솔루션을 계속. 참고: 재고 솔루션 유해를 시작 하 고 점성 된다 경우 2-3 헤 취소 재고에 대 한 실 온에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>3 겹에 HBSS fibrinogen 주식을 diluting 하 여 fibrinogen 작업 솔루션 (3.3 mg/mL)을 준비 합니다. 예, fibrinogen 재고 fibrinogen 작업 솔루션의 900 µ L를 준비 하는 HBSS의 600 µ L에서 300 µ L를 혼합.</li>
	<li>10을 용 해 하 여 트 롬 빈 솔루션 (10 U/mL)를 준비 단위 HBSS 또는 인산 염의 1 mL에 트 롬 빈의 버퍼링 식 염 수 (PBS). 참고:이 솔루션 50 µ L 부분에 aliquoted 사전에 준비 하 고 수-20 ° c.에 언</li>
	<li>물 50 mL에 D-포도 당 1.8 g을 용 해 하 여 200 m m D-포도 당 솔루션을 준비 합니다. 장기 저장을 위한 4 ° C에서 유지.</li>
	<li>물 50 mL에 KCl의 1.1 g을 용 해 하 여 300 mM KCl 솔루션을 준비 합니다. 장기 저장을 위한 4 ° C에서 유지.</li>
	<li>장착은 독도 대 한 35 m m 직경 유리 하단 요리를 조달.</li>
	<li>해 부 및는 섬에의 설치 사용 하 여 형광 램프와 빨간 필터 큐브 스테레오 현미경 (TRITC: 여기: 532-554 nm, 방출: 570-613; 또는 텍사스-레드: 여기: 540-580 nm, 방출: 592-667 nm).</li>
	<li>이미징 (0.8 없음) X 20는 거꾸로 confocal 현미경 (LSM 780 또는 이와 유사한 Zeiss) 목표 공기와 35 m m 직경 유리 하단 요리 접시 홀더 장착 사용에 베타 세포에서 칼슘의 유입에 대 한.</li>
	<li>Zebrafish는 euthanizing tricaine 메탄 된 (MS222)의 200 mg/L 솔루션 준비.</li>
	<li>Zebrafish 해 부에 대 한 90 mm 페 트리 접시를 조달.</li>
</ol>2. 제 브라 주 섬 해 부 및 장착
<ol><li>MS222에서 머리말 붙인된 외피를 사용 하 여 물고기 안락사 이 위해 부드럽게 낚시 그물을 사용 하 여 어항에서 물고기를 제거 하 고 동물 opercular (아가미) 운동; 표시 될 때까지 MS222 솔루션을 포함 하는 페 트리 접시에 그것을 품 어 일반적으로,이 걸립니다 5 분 전송 물고기 Ca2 +/Mg2 +HBSS 솔루션을 포함 하는 배양 접시에.</li>
	<li>
스테레오 현미경 형광 램프와 빨간 필터 큐브, 췌를 동물의 복 부의 오른쪽을 덮고 피부를 해 부.
	<ol>
<li>이 대 한 날카로운 집게를 사용 하 여 항문 지 느 러 미에 입에서 zebrafish의 피부를 잘라. 복 부; 노출 컷된 피부 벗 겨 이 자르는 내부 장기 노출합니다. 베타 세포의 mKO2 식의 빨간 형광을 사용 하 여 시각적인 검사는 현미경으로 독도의 위치를 확인 합니다. 필요한 경우, 그들은 찾기 어려운 섬 표지 수 간의 돌출부를 제거 합니다. 참고: 주 섬은 오른쪽에 일반적으로 복 부의 앞쪽 지역 근처에 위치.</li>
	</ol>
</li>
	<li>신중 하 게 간, adipocytes 등 주변 조직을 제거 하 여 주 섬 청소. 주의 손상 또는 찌를 섬; 주변 조직의 지운 후 섬 표면에 개별 셀 될 뚜렷한.</li>
	<li>유리 하단 접시의 중앙에 30 µ L 방울 HBSS 플라스틱 이 드롭 해 부 섬 전송.</li>
	<li>조심 스럽게 씻어 한번 HBSS와 함께 한 번 30 µ L fibrinogen 작업 솔루션 (3.3 mg/mL)의 작은 섬. 이렇게 하지 않으면 세포 죽음에서 발생 하기 때문에 세척 단계는 섬의 건조 하지 않도록 해야 합니다.</li>
	<li>천천히 그리고 부드럽게 트 롬 빈 솔루션 (10 U/mL)의 10 µ L를 추가 합니다. 섬 두고 접시 15-20 분 fibrinogen-트 롬 빈 드롭 관찰에 대 한 손길이 닿지 않은 점성 및 약간 불투명 한이 시점에서 될 것입니다.</li>
</ol>3. 제 브라 주 독도에서 GCaMP 형광 강도의 전 비보 라이브 영상
<ol><li>금형 위에 HBSS의 200 µ L을 추가 하 고 confocal 현미경의 플레이트 홀더에 신중 하 게 접시를 놓습니다. 20 X, 0.8 나 공기 목표를 사용 하 여 confocal 영상에 대 한. 섬을 대물 옵션을 사용 하 여 찾습니다.</li>
	<li>빨간 형광에 대 한 필터를 사용 하 하는 섬에 초점, 베타 세포에서 핵 mKO2 형광을 볼 수 있습니다. 개별 핵은 명확 하 게 표시 되어야 합니다.</li>
	<li>z 축 따라 섬의 두께 통해 이동 하기 위하여 공초점 현미경의 초점 비행기를 수동으로 변경 하 여 명확한 영상 평면을 찾습니다. 특히 섬 중앙에에서 핵 mKO2 형광의 밝기는 유니폼, 이미징 비행기 이미징, 베타 세포의 충분 한 수 (50-100)를 포함 확인 하십시오.</li>
	<li>"스마트 설정 메뉴"에서 다음 설정을 사용 하 여 GCaMP6s 및 mKO2 형광에 대 한 순차적 인수 설정: GCaMP6s, 여기: 488 nm, 방출: 500-555 nm, false-색상: 그린 (선택 "GFP"); mKO2, 여기: 561 nm (mCherry), 방출: 570-630 nm, false-색상: 레드 (선택 "mCherry"). 참고:이 설정을 사용 하 여 빨강 채널 기록할 것 이다 베타 세포 핵의 위치 녹색 채널 GCaMP 형광 강도 기록 하는 동안.</li>
	<li>"수집 모드"에서 1024 x 1024 픽셀에서 이미지 해상도 설정, 10와 1에서 평균 속도. 연속 시작 "시계열"에 대 한 옵션을 선택 하 고 프레임 당 약 2 s 수집 시간 500 사이클, "기간"을 설정 하 여 녹음 합니다. 참고: 시간 시리즈의 처음 50 프레임 5 mM 포도 당 농도에서 베타 세포의 활동에 해당합니다. 이것은 초기 응답 이다. 응답 베타 셀 왁 싱 시간 녹색 형광 강도 말기 표시 됩니다. 우리는 몇 가지 (1-5%)는 베타 세포의 5 mM 포도 당에서 진동 관찰.</li>
	<li>
이미징 사이클에 잘 감시 해. 처음 50 프레임 후 녹화를 중지 하지 않고 10 m m 주변 솔루션의 포도 당 농도 증가.
	<ol>
<li>이미지 수집, perturbing 없이 부드럽게 200mm는 섬 들고 젤 위에 D-포도 당 솔루션의 5 µ L 플라스틱. 10 m m 포도 당에서 150 프레임을 획득 합니다. 참고: 포도 당 농도 증가의 베타 세포 수 증가 GCaMP 형광 진동 녹색 채널에 받고.</li>
		<li>유지 하는 세포의 핵 안정 과정에서. 섬 중 광범위 하 게 떨고 핵 초점 평면에서 이동 하는 경우 (필요한 경우) 샘플 삭제.</li>
		<li>다음 샘플의 안정성을 보장 하기 위해 fibrinogen-트 롬 빈 금형의 합 수 있도록 충분 한 기간을 기다립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>200 프레임에서 더 부드럽게 200 m m D-포도 당 솔루션의 10 µ L를 pipetting으로 20 mm 용액의 농도 증가. 20 mM 농도 대 한 150 프레임을 획득 합니다.</li>
	<li>350 프레임 후 섬 KCl의 30 m m를 사용 하 여 depolarize. 이 위해 20 µ L 300 m m KCl 재고 솔루션을 추가 합니다. 이 단계에서 관찰 GCaMP6s 형광 진동 중지 하 고 고 강도;에 수정 베타 세포 포도 당에 반응 하지 않았다 또한 KCL 추가 시 녹색 형광 강도 증가 표시할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 개별 베타 세포에 대 한 GCaMP 형광 추적의 정량화
참고: 추적 하 고 개별 베타 세포의 포도 당 수준의 응답 계량, 전체 이미징 동안 GCaMP 형광 강도 수량화 합니다. 정량화는 셀룰러 해상도에서 수행 됩니다. 이 위해 피지20 을 사용 하 여 이미지 (4.1-4.6 단계), 그리고 스프레드시트 소프트웨어 또는 분석 (4.8-4.9 단계)를 수행 하려면 R21 에서 GCaMP 형광의 강도 값을 추출.
<ol><li>피지 "LSM 도구 상자"를 사용 하 여 이미지 파일을 엽니다. 이 위해 선택 "플러그인 | LSM 도구 상자 | LSM 도구 상자 표시 ". "LSM 도구 상자", "오픈 LSM"를 클릭 하 고 이미지 파일을 선택 합니다. 참고: "LSM 도구 상자"에서 지원 되지 않는 형식에 대 한 변환 분석을 위한 티파니를 먼저.</li>
	<li>피지에서 관심 영역 (ROI) 도구를 사용 하 여 셀의 응답을 압축을 풉니다. "도구" 아래 "분석" 메뉴에서 "투자 수익 관리자"를 엽니다. 도구 모음에 있는 "다각형 선택 도구"를 사용 하 여 투자 수익을 수동으로 그립니다.</li>
	<li>베타 세포 핵 되 빨강 채널에 투자 수익을 그립니다. 셀의 세포질의 일부를 포함 하려면 셀의 핵 보다 더 큰 영역을 커버 하는 투자 수익을 선택 합니다. 투자 수익 위치 프레임 사이의 일치 하는지 확인 하 고 필요한 경우 위치를 조정 합니다.</li>
	<li>"[T] 추가" 버튼을 클릭 하 여 선택한 ROIs "ROI 관리자"를 추가 합니다. 선택한 여러 셀에 데이터를 얻기 위해 투자 수익에 여러 ROIs를 추가 합니다.</li>
	<li>다음, "분석" 메뉴에서 "설정 측정" 선택 합니다. 지정 지역 내에 총 형광 강도의 추출에 대 한 "통합 밀도"를 선택 합니다.</li>
	<li>GCaMP 형광을 포함 하는 녹색 채널을 shift 하 고 "ROI 관리자"에서 "멀티 측정"를 선택 합니다. 참고:이 시간 시리즈를 통하여 셀에 대 한 강도 측정을 제공할 것입니다.</li>
	<li>경우에 투자 수익 위치는 섬의 움직임으로 인해 조정 될 필요가 있다, 수동으로 다른 프레임의 강도 측정을 컴파일하십시오. 복사 하 고 별도 스프레드시트에 값을 붙여 넣습니다.</li>
	<li>"LSM 도구 상자"에서 이미지 프레임의 타임 스탬프를 가져옵니다. 사용 "우표 적용 | T 우표 적용 | 파일 이름 | 덤프 텍스트를 "타임 스탬프를. "다른 이름으로 저장" 옵션을 사용 하 여 타임 스탬프를 저장 하거나 스프레드시트에 복사 합니다.</li>
	<li>모든 셀에 대 한 강도 값을 컴파일 시 분석 한 셀에 한 번 또는 자동으로 (예를 들어, Excel 수식 또는 R를 사용 하 여)을 수행 합니다.</li>
	<li>
2 단계에서 개별 셀을 분석 합니다.
	<ol>
<li>첫 번째 단계에서 기준선 위에 형광 강도 계산 합니다. 이 위해, 처음으로 50 프레임 (5 mM 포도 당)에 대 한 형광 강렬의 평균으로 기준 형광 강도 (F0)을 계산 합니다. 기준선 (0F) 전체 시계열에서 뺍니다 (F-F0). 참고: 몇 가지 세포는 일반적으로 더 높은 농도와 자극을 다음 기저 포도 당에서 분명 GCaMP 진동 표시할 수 있습니다. 이러한 셀만 있는 셀 형광에 한 방울을 보여준 초기 프레임의 평균 강도 취 함으로써 F0 를 추정 가능 하다.</li>
		<li>분석의 두 번째 단계에서 형광 강도 정상화 하 여 최종 GCaMP 형광 강도 얻을. 참고:이 다른 동물에서 독도 간의 차이 제거 수행 됩니다. 개별 독도 포도 당 자극에 따라 형광 방출의 다양 한 레벨을 표시합니다.</li>
		<li>높은 강도 값으로 그것을 분할 하 여 형광 강도 정상화. 이 위해 (F최대 -F0), 피크 강도 계산 하 고 피크 강도 최종 GCaMP 형광 강도를 뺀 초기 계획 값을 나누어 (F-F0) / (F최대 -F0).</li>
	</ol>
</li>
	<li>건강에 해로운 또는 손상 될 수 있습니다 다음 KCl 자극 강도에 변화를 전시 하지 않는 셀을 삭제 합니다.</li>
	<li>R에서 (단계 4.9-4.10) 분석을 수행 하기 위한 사용 R 스크립트 (plotcelltrace. R)이이 원고와 함께 제공.</li>
</ol>

<ol>
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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+Cell+Hubs+Dictate+Pancreatic+Islet+Responses+to+Glucose.">Beta Cell Hubs Dictate Pancreatic Islet Responses to Glucose.</a> Cell Metab. 24 (3), 389-401 (2016).</li></ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

여기 beta 세포 포도 당 응답 단일 셀 해상도 정량화에 대 한 기술을 설명합니다. 이것은 유전자 인코딩 칼슘 표시기, GCaMP6s를 사용 하 여 세포내 칼슘 농도 모니터링 하 여 이루어집니다. 베타 세포 활동 fibrinogen-트 롬 빈 형에서 섬을 장착 하 여 캡처된 비보 전 이다. 프로토콜의 중요 한 단계는 금형의 안정성 이다. 충분 한 시간 HBSS 용액에 녹이는 것 fibrinogen에 주어질 필요가 있다. 이 없이, 금형 않습니다 이미징 세션 동안 안정성을 제공 하기 위해 충분히 유해 하지. 적어도 1 주 동안 (데이터 표시 되지 않음) fibrinogen-트 롬 빈 형에 탑재 하 고 세포 배양에 있는 섬 가능한 남아 있을 수 있습니다. 낮은 용융 agarose 등 fibrinogen-트 롬 빈 형에 대안 섬22탑재를 활용할 수 있습니다. 또 다른 중요 한 매개 변수는 섬에의 해 부는. 이 단계는 섬 주변 조직 부상 또는 파고는 섬 없이 제거 될 필요가 있다. 숙련 된 해 부 연습 함께 제공 됩니다.
이미징 프로토콜의 한계는 섬에의 한 confocal 평면에 제한 이다. 이렇게 개별 베타 세포 내 칼슘 유입의 역학을 잡으려고 합니다. 섬의 전체 두께 통해 Z 스택 이미징 속도 및 개별 셀에서 진동 신호의 손실 리드. 이 제한 3 차원에서 칼슘 역학을 캡처 수 있도록 같은 회전 디스크 현미경 검사 법, confocal 영상 빠른 수단을 사용 하 여 향상 시킬 수 있습니다. 또 다른 국경 vivo에서 칼슘 이미징12것입니다. Zebrafish 태아의 투명 한 특성 또는 zebrafish 성인23 의 색소 없는 종자를 사용 하 여 생체 내 이미징 미래에 대 한 가능성을 열 수 있습니다.
베타 세포 활동 공간 및 시간 고해상도 이미징 개별 베타 세포 중 기능이 조사를 수 있습니다. 이 방법은 베타 셀 부분 모집단의 존재에 도울 수 있다. 최근, 여러 연구 명목상 동질적인 베타 세포24,,2526부분 모집단의 존재를 나타났습니다. Ex vivo 이미징 포도 당에 대 한 하위-인구의 응답의 성격 유전 기자와 결합할 수 있습니다. 또한 약리 자극 이미징 설치 결합 베타 세포 기능을 향상 시킬 수 있는 화합물의 심사에 대 한 수 있습니다.
요약 하면, 여기에 제시 된 기술 정량화 및 개별 베타 세포의 포도 당 응답의 비교 수 있습니다. 베타 세포 기능, 당뇨병의 발전에 중요 한 매개 변수를 직접 윈도우를 제공합니다.

우리의 혈액 포도 당 췌 내 분 비의 기능 때문에 큰 부분에서 좁은 범위에 유지 됩니다. 췌 장의 내 분 비 역할은 독도 Langerhans, 호르몬 분 비 세포를 포함 하는 의해 수행 됩니다. 인슐린 은닉 베타-세포는 혈당 탄수화물이 포함 된 식사를 다음 수준을 감소 합니다. 부적당 한 인슐린 베타 세포에서 분 비 당뇨병1, 지속적인된 높은 혈당에 의해 특징에 발생할 수 있습니다. 타입 1과 타입 2 당뇨병, 현재 전세계 400 백만 이상의 사람들이 고생, 병 적 상태와 사망률2이끌어 낸다. 베타 세포 기능 장애에 기여 하는 분자 및 환경 요인, 조사 함으로써 우리가 이해할 것 이다 더 나은 어떻게 타입-2 당뇨병을 시작 하 고 진행. 또한, 인간 줄기 세포 생체 외에서 기능성 베타 세포로 분화 하는 능력 제 1 형 당뇨병에서 세포 대체 요법에 대 한 새로운 베타 세포의 원천을 제공할 수 있습니다. 이 위해, 그것은 베타 세포의 기능 및 유전 모형 유기 체에서 성숙 접시에 기능성 베타 세포를 만들기 위한 필요한 지식을 얻기 위해 공부 하는 것이 중요.
베타 세포 기능 인슐린 응답 포도 당 자극으로 분 비의 총량을 측정 하 여 전체 섬 수준에서 모니터링할 수 있습니다. 이 누적 방법은 셀의 개별 속성을 구분 하지 않고 셀의 단일 그룹으로는 섬을 공부 한다. 그러나, 개별 베타 세포의 포도 당 응답의 분석 다양을 한 베타 세포의 기능 특성에이3의 존재를 밝혔다. 개별 베타 세포의 기능을 평가 하기 위해 인슐린 분 비4이어질 세포내 변화를 모니터링 가능 하다. 인슐린 분 비는 베타 세포로 포도 당의 항목 앞에 있습니다. 베타 세포에 들어가는 포도 당 급속 하 게 ATP를 물질 대사로 변화. 높은 세포내 ATP 농도 ATP-민감한 칼륨 이온 채널 베타 셀 도발은 이어지는 오픈 확률 감소. 도발은 전압에 민감한 칼슘 이온 채널 열리고 세포내 칼슘 증가. 차례 차례로, 칼슘 exocytosis를 순환에 발표 되 고 포도 당 이용5,,67을 홍보 하 여 포도 당 수치를 낮추고 인슐린의 트리거합니다.
몇 가지 전략을 막 잠재적인8, 인슐린 소포 exocytosis9의 직접적인 시각화 및 정량화의 세포내 캘리포니아2 + 의 모니터링을 포함 하 여 베타 세포의 기능을 조사에 적용 포도 당 응답10에 대 한 프록시로 유입. 그 중, 세포내 캘리포니아2 + 의 영상 업 스케일링 같은 섬11,12, 간의 포도 당 응답의 직접 비교를 위해 수 있도록 내 여러 개별 셀에 분석의 이점을 제공 한다 개별 베타-셀입니다. 세포내 캘리포니아2 + 농도 칼슘-민감한 형광 염료13 또는 유전자 인코딩 칼슘 지표 (GECIs)14를 사용 하 여 모니터링할 수 있습니다. 반면 칼슘 표시기 염료 부족 셀 형 특이성, GECIs 특정 발기인에 의해 특정 셀 형식으로 표현할 수 있습니다. 또한, GECIs, GCaMP6, 등의 새로운 세대는 빠른 임시 역학15와 함께 더 나은 신호 대 잡음 비율을 제공 한다. 여기는 단일 셀 해상도에서 베타 세포에서 칼슘을 시각화 하기 위해 특정 GCaMP6s에 있는 GECIs의 새로운 세대의 유틸리티에 설명 합니다. 우리 선택의 우리의 모델로 zebrafish 주 섬에이 메서드를 적용 됩니다. 배아 개발 하는 동안 베타 세포 주 섬에는 등 쪽에서 발생 하 고 복 부 췌 장 새싹16. 주 섬은 쉽게 식별 및 격리 zebrafish 췌 장 내에서 틀에 박힌 해 부 위치에 있습니다. 그들의 유전 제거 혈당17,18에 리드 주 섬에 베타 세포 포도 당 규칙을 위한 필요 하다. 또한,이 베타 세포 초기 zebrafish 개발19동안에 포도 당 응답 되. 이 프로토콜은 포스트 미 발달 단계 형성 보조 독도 영상에 적용할 수 있습니다. 프로토콜 정의 된 포도 당 농도 및 개발의 나중 단계에서 이미지 베타 세포 비보 전, 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)</td><td></td><td></td><td>By request from authors</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>ZEISS</td><td>495015-0001-000</td><td>SteREO Discovery.V8</td></tr><tr><td>Fluorescence lamp</td><td>ZEISS</td><td>423013-9010-000</td><td>Illuminator HXP 120 V</td></tr><tr><td>Red Filter Cube</td><td>ZEISS</td><td>000000-1114-462&amp;nbsp;</td><td>Filter set 45 HQ TexasRed</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>ZEISS</td><td>LSM 780</td><td></td></tr><tr><td>Bovine fibrinogen</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hanks&#039; Balanced Salt solution)</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>35 mm diameter glass-bottom dishes</td><td>ThermoFisher</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>tricaine methane sulfonate</td><td>Sigma</td><td>E10521&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11445-12</td><td></td></tr><tr><td>FIJI, using ImageJ Version: 2.0.0-rc-43/1.50e</td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>R, version 3.2.4</td><td></td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>RStudio</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/</td></tr><tr><td>plotcelltrace.R</td><td></td><td></td><td>A custom script provided with the manuscript</td></tr></tbody></table>

analysis of beta-cell function using single-cell resolution calcium imaging in zebrafish islets

췌 장 베타 세포는 호르몬 인슐린을 은닉 하 여 증가 혈액 포도 당 농도에 응답. 베타 세포의 기능 장애는 혈당과 심각한, 생명을 위협 하는 결과를 리드. 베타 세포 생리 적 조건 하에서 작동 하는 방법 및 어떤 유전과 환경 요인 그들의 장애를 일으킬 수 있습니다 이해는 당뇨병 환자에 대 한 더 나은 치료 옵션을 발생할 수 있습니다. 베타 세포에 칼슘 수준을 측정 하는 기능 베타 세포 기능, 칼슘 이온 트리거 인슐린 방출의 유입으로의 중요 한 지표 역할을 합니다. 여기는 GCaMP6s, 칼슘의 유전자 인코딩된 센서를 사용 하 여 zebrafish 베타 세포에 포도 당 자극 칼슘 유입 모니터링을 위한 프로토콜에 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 단일 셀 해상도 ex vivo 탑재 독도에서 세포내 칼슘 역학을 모니터링 수 있습니다. 같은 섬 내 베타 세포의 포도 당 응답 수 있습니다 캡처할 수 동시에 다른 포도 당 농도에서 zebrafish 베타 세포 사이 기능이의 존재를 제안. 게다가, 기술은 포도 당 자극에 따라 칼슘 유입의 진동 특성을 보여 높은 시간적, 공간적 해상도를 제공 한다. 우리의 접근 방식을 모델로 제 브라를 사용 하 여 조사 하는 베타 세포의 기능 및 역 기능에 유전과 환경 요인의 기여에 문을 엽니다.

위에서 설명한 프로토콜을 사용 하는 45 일 후 수정 (dpf) 제 브라에서 한 섬 베타 세포의 포도 당 응답 분석 했다. 이 위해 주 섬 안락사 동물에서 해 부 되었고 유리 하단 접시에 fibrinogen-트 롬 빈 형에 탑재. 섬 5 mM 포도 당을 포함 하는 HBSS에 몰두 했다. 포도 당 농도 단계별 방식으로 10 밀리미터 및 20 밀리미터에 증가 되었다. 베타 세포의 포도 당 농도가 증가 응답 기록 되었다. 마지막으로, 베타 셀 30 m m KCl (그림 1)를 사용 하 여 depolarized 했다. 도발은 KCl을 사용 하 여 건강 한 베타 세포에서 칼슘 항목을 유도 합니다.
피지 및 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 개별 베타 세포의 GCaMP6s 형광 강도 추출 되 고 정규화 (그림 2). 형광 강도의 추적에서 볼 있듯이, 개별 베타 세포 포도 당 자극, KCl 자극 시 중지 시 GCaMP6s 형광 진동 표시. 기술은 그들의 기능으로 베타 세포의 포도 당-응답 및 창 세포 확인을 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig1.jpg"> 그림 1: Ex vivo 라이브 이미징 zebrafish 베타 세포에서 GCaMP6s를 사용 하 여 칼슘 유입의. Tg(ins:nls-Renilla-mKO2);에서 주요 섬 Tg(ins:GCaMP6s) zebrafish (45 dpf) fibrinogen-트 롬 빈 형에 탑재 되었고 5 m m (기저) 포도 함께 알을 품을. GCaMP6s 형광 녹색 채널에 존재 하는 동안 베타 세포 빨간 핵 표시와 함께 표시 했다. 섬 10 밀리미터 및 20 밀리미터 D-포도 당, 순차 외피로 구성 된 포도 당 경사로와 자극 그리고 30 m m KCl 화살촉 표시 개별 베타 세포의 활동 분석의 추가 통해 depolarized. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57851/57851fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig2.jpg"> 그림 2: GCaMP6s 형광 강도-추적 개별 베타 세포에 대 한 정규화. 정규화 된 GCaMP6s 형광 강도-추적 화살표 그림 1에 표시 된 베타 세포에 대 한. X 축에 시간을 (초) 나타냅니다. 맨 바 HBSS 매체에서 포도 당와 KCl의 농도 묘사. Y 시간 시리즈 동안 정규화 된 형광 강도를 나타냅니다. 이 위해, 초기 강도 (F0) 5 mM 포도 당에 부 화 하는 동안 평균 강도 계산 됩니다. 이 전체 시계열 데이터에서 뺍니다 (F-F0). 셀에 의해 표시 된 최대 강도 의해 강도 이상 기준선은 정규화 (F-F0) / (F최대-F0). 정규화 된 추적 셀 30 m m KCl.와 depolarized는 안정 시킨다 포도 당을 베타 세포의 진동 응답을 보여 줍니다 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57851/57851fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

베타 세포 기능 혈액 포도 당 항상성, 칼슘 유입에 대 한 유전자 인코딩된 기자를 사용 하 여 단일 셀 해상도에서 계산 되는 중요 하다.

Zebrafish 독도에서 단일 셀 해상도 칼슘 이미징 사용 하 여 베타 세포 기능 분석

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

analysis-beta-cell-function-using-single-cell-resolution-calcium

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K 조회수.  TU Dresden. 베타 세포 기능 혈액 포도 당 항상성, 칼슘 유입에 대 한 유전자 인코딩된 기자를 사용 하 여 단일 셀 해상도에서 계산 되는 중요 하다.

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Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

연구

발생학

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

생물학

Simultaneous Calcium Imaging and Glucose Stimulation in Living Zebrafish to Investigate In Vivo &#946;-Cell Function

The pancreatic &#946;-cells sustain systemic glucose homeostasis by producing and secreting insulin according to the blood glucose levels. Defects in &#946;-cell function are associated with hyperglycemia that can lead to diabetes. During the process of insulin secretion, &#946;-cells experience an influx of Ca2+. Thus, imaging the glucose-stimulated Ca2+ influx using genetically encoded calcium indicators (GECIs) provides an avenue to studying &#946;-cell function. Previously, studies showed that isolated zebrafish islets expressing GCaMP6s exhibit significant Ca2+ activity upon stimulation with defined glucose concentrations. However, it is paramount to study how &#946;-cells respond to glucose not in isolation, but in their native environment, where they are systemically connected, vascularized, and densely innervated. To this end, the study leveraged the optical transparency of the zebrafish larvae at early stages of development to illuminate &#946;-cell activity in vivo. Here, a detailed protocol for Ca2+ imaging and glucose stimulation to investigate &#946;-cell function in vivo is presented. This technique allows to monitor the coordinated Ca2+ dynamics in &#946;-cells with single-cell resolution. Additionally, this method can be applied to work with any injectable solution such as small molecules or peptides. Altogether, the protocol illustrates the potential of the zebrafish model to investigate islet coordination in vivo and to characterize how environmental and genetic components might affect &#946;-cell function.

Here, the study presents a protocol for calcium imaging and glucose stimulation of the pancreatic &#946;-cells of the zebrafish in vivo.

The pancreatic &#946;-cells sustain systemic glucose homeostasis by producing and secreting insulin according to the blood glucose levels. Defects in ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

애벌레 Zebrafish의 측면 라인 세포의 생체 내 칼슘 이미징

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

신경과학

생체 내 제브라피시 유충의 전뇌 영상

In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the cellular resolution. Here, we provide an optimized protocol for performing whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy, including sample preparation and immobilization, sample embedding, image acquisition, and visualization after imaging. The current protocol enables in vivo imaging of the structure and neuronal activity of a larval zebrafish brain at a cellular resolution for over 1 h using confocal microscopy and custom-designed fluorescence microscopy. The critical steps in the protocol are also discussed, including sample mounting and positioning, preventing bubble formation and dust in the agarose gel, and avoiding motion in images caused by incomplete solidification of the agarose gel and paralyzation of the fish. The protocol has been validated and confirmed in multiple settings. This protocol can be easily adapted for imaging other organs of a larval zebrafish.

저자 스포트라이트: 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피시 유충의 In Vivo 전뇌 이미징  

Presented here is a protocol for in vivo whole-brain imaging of larval zebrafish using three-dimensional fluorescence microscopy. The experimental procedure includes sample preparation, image acquisition, and visualization.

생체 내 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 유충의 전뇌 이미징

As a vertebrate model animal, larval zebrafish are widely used in neuroscience and provide a unique opportunity to monitor whole-brain activity at the ...

제브라피시 전뇌의 행동 추적 및 신경 활동 패턴

Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used for measuring activities across brain regions through optical imaging methods. However, reports on the recording of brain activity in behaving adult zebrafish have been scarce. The present study describes procedures to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish. We focus on steps to restrain adult zebrafish from moving their heads, which provides stability that enables laser scanning imaging of the brain activity. The head-restrained animals can freely move their body parts and breathe without aids. The procedure aims to shorten the time of head restraint surgery, minimize brain motion, and maximize the number of neurons recorded. A setup for presenting an immersive visual environment during calcium imaging is also described here, which can be used to study neural correlates underlying visually triggered behaviors.

저자 스포트라이트: 성체 제브라피시 뇌 연구의 발전 

Here, we present a protocol to perform two-photon calcium imaging in the dorsal forebrain of adult zebrafish.

행동하는 성인 제브라피쉬의 전뇌 활동에 대한 Two-Photon Calcium Imaging

Adult zebrafish (Danio rerio) exhibit a rich repertoire of behaviors for studying cognitive functions. They also have a miniature brain that can be used ...

Zebrafish 독도에서 단일 셀 해상도 칼슘 이미징 사용 하 여 베타 세포 기능 분석

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분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

Simultaneous Calcium Imaging and Glucose Stimulation in Living Zebrafish to Investigate In Vivo β-Cell Function

애벌레 Zebrafish의 측면 라인 세포의 생체 내 칼슘 이미징

생체 내 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 유충의 전뇌 이미징

생체 내 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 유충의 전뇌 이미징

생체 내 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 유충의 전뇌 이미징

행동하는 성인 제브라피쉬의 전뇌 활동에 대한 Two-Photon Calcium Imaging

행동하는 성인 제브라피쉬의 전뇌 활동에 대한 Two-Photon Calcium Imaging

행동하는 성인 제브라피쉬의 전뇌 활동에 대한 Two-Photon Calcium Imaging