저자는 그들의 협력 및 지원-특히 후세인 Almukhayzim, Hisham Aloudah에 대 한 실험적인 수술과 킹 사우드 대학, 의학 대학에서 동물 실험실의 직원을 감사 하 고 싶습니다. 저자 또한 시각을 준비 하기 위한 킹 사우드 빈 압둘 아지즈 대학에서 미디어 팀을 인정 하 고 싶습니다 자료 특히 Muath 빈 Ghannam 및 Abdulwahab Alsulami.

프로토콜의 킹 사우드 대학 윤리 위원회 동물 보호 지침을 따릅니다. 수술 절차, 마 취약, 그리고 동물에 이용 된 다른 약물 킹 사우드 대학 윤리 위원회에 의해 승인 됩니다. 모든 실험 작업은 적절 하 게 훈련 된 직원에 의해 수행 됩니다.
1. 셀 시트 건설
<ol><li>Undiluted 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 문화 요리 (3.5 cm 온도 응답 문화 요리) 코트와 접시의 모든 표면을 커버를. 참고:이 단계는 단층에는 세포의 성장을 지원 하 고 셀 집계를 방지 이후 셀 시트의 분리에 대 한 중요 하다.</li>
	<li>포함 하는 5% CO2 와 95% 공기 습도 분위기에서 37 ° C에서 24 시간을 위한 요리를 품 어.</li>
	<li>코팅된 요리에서 초과 FBS를 제거 하 고 요리 1 시간 이상 실 온 (RT)에서 건조를 허용 합니다.</li>
	<li>3 셀 정지 준비: 1 x 106 HepG2 세포, BMMSCs, 1 x 106 HepG2 세포 및 (BMMSCs와 UCMSCs에 4: 1의 비율)에서 UCMSCs 가진 1 x 106 HepG2 세포.</li>
	<li>씨 각 레이블이 접시에 적절 한 세포 현 탁 액.</li>
	<li>DMEM 배양 10 %FBS 1% 페니실린/스 보충에 있는 모든 셀을 일시 중단 합니다.</li>
	<li>셀을 포함 하는 5% CO2 와 95% 공기 습도 분위기에서 37 ° C에서 품 어.</li>
</ol>2. 셀 시트 분리
<ol><li>100% 셀 합류에서 37 ° C 배양 기에서 요리를 가져가 라.</li>
	<li>HepG2/BMMSC 및 HepG2/UCMSC 셀 시트 요리 포함 5% CO2 와 95% 공기 습도 분위기에서 20 ° C에서 30-40 분 동안 잠복기 동안에 RT, 1 시간에 대 한 HepG2 세포 시트 접시를 품 어. 참고:만 HepG2에서 만든 셀 시트는 깨지기 쉬운; 20 ° C에 온도 감소 하면 시트의 구조에 손상을.</li>
</ol>3입니다. 수술의 성능
참고: 셀 시트 분리에 대 한 보육 시간 동안 동물 절차 시작.
<ol><li>
수술의 준비에 대 한 지침
	<ol>
<li>후드, 층 류 캐비닛, 등 무 균 수술 실, 실험실 내에서 살 균 별도 영역에서 모든 수술 절차를 수행 합니다. 수술의 모든 표면 비 다공성, 봉인, 내구성, 그리고 sanitizable 인지 확인 합니다.</li>
		<li>스크럽, 장갑, 검, 및 머리 및 구두 덮개를 포함 하 여 적절 한 보호 장구를 착용 하십시오.</li>
		<li>수술에 사용 하는 도구는 깨끗 하 고 소독 (압력가 마로 소독을통해 , 높은 압력에서 포화 줄기) 시작 부분에서의 수술.</li>
		<li>장갑을 쥐 사이 변경 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
수술에 대 한 동물의 준비
	<ol>
<li>8 월에 12 주 된 누드 쥐를 사용 합니다.</li>
		<li>쥐에 대 한 주사 마 취를 만듭니다.<ol>
<li>마 취 솔루션을 준비, 케 타 민-xylazine, 2 mL의 마 취 제 (20 mg/mL의 농도)에 xylazine의 1 mL, 멸 균 생리 식 염 수 (예를 들어, 0.9% 염화 나트륨) 살 균 10 mL 혈 청 컬렉션 유리병에서의 1 mL를 혼합 하 고 전에 잘 흔들어 사용 하 여.</li>
			<li>마 취를 적용 하려면 intraperitoneally 쥐의 몸 무게의 100 g 당 케 타 민 xylazine 솔루션의 0.2 mL를 주사. 참고: 솔루션의 총 복용량은 100 mg/kg의 마 취 제 및 xylazine의 10 mg/kg 이다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>수술 사이트에서 보이는 먼지/이물질을 제거 합니다.</li>
		<li>페달 철수 반사 (두 뒷 발에 발 패드 핀치)을 테스트 하 여 마 취의 깊이 확인 합니다. 참고: 발 패드 핀치에 응답 하면 복용량의 0.05 mL/100 g (약 매 30 분), 반복 다음 마 취 깊이 다시 확인 합니다.</li>
		<li>Povidone-요오드/소 프로 파 놀에 의해 2 단계 스크럽으로 수술 영역을 치료.</li>
		<li>절 개의 오염을 피하기 위하여 무 균 드 레이프와 쥐를 커버.</li>
		<li>Buprenorphine (0.01-0.05 mg/kg)으로 쥐를 피하 주사8 절 개를 하기 전에.</li>
		<li>살 균 메스를 사용 하는 7-하-10cm 스킨과 간 노출 기본 근육 사이 컷 확인 합니다.<ol>
<li>메스의 편평한 뒤 가장자리 피부에서 복 부 근육을 구분 합니다.</li>
			<li>조심 스럽게 찔 러는 교육 알바 메스를 사용 하 고 날카로운가 위 컷을 확장.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 셀 시트 이식
참고: 셀 시트 이식 간에 수행 됩니다.
<ol><li>문화 요리에서 셀 시트를 수집 합니다.<ol>
<li>부드럽게 벤치 시트는 표면에서 분리를 통해 문화 접시를 누릅니다.</li>
		<li>살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 30 원에 시트의 가장자리를 된다고 하 여 접시의 표면에서 셀 시트를 구분 합니다.</li>
		<li>부드럽게 문화 접시에서 전체 매체를 제거 합니다.</li>
		<li>어떤 손상도 없이 그대로 시트 확인 그렇지 않으면, 그것은 수 없습니다 (그림 1)을 사용. 참고: 결과 시트를 직접 눈으로 감지할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀 시트 접시에서 수확 살 균 막 (종이 필터)를 준비 합니다.<ol>
<li>첫째, 일반적인 염 분으로 막 담가. 그런 다음, 메 마른 목화 패드와 함께 과잉 염 분을 제거 합니다.</li>
		<li>주름과 기포 막과 셀 시트 사이 피하 면 서 젖은 막 셀 시트 장소.</li>
		<li>막 그리고 그들을 쉽게 수집 하 셀 시트 정상적인 염 분의 몇 방울을 추가 합니다. 참고: 셀 시트를 위반을 피하기 위해, 하 하지 차가운 식 염 수를 사용 하 고 집게와 막 셀 시트를 올려.</li>
		<li>셀 시트는 막에 제대로 장착 되었는지 확인 하려면 몇 초 동안 막 두고 그것을 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>간 세포 시트 이식에 대 한 준비.<ol>
<li>간 표면 살 균 목화 패드와 함께 부드럽게 그것을 활용 하 여 건조 하다 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>소독 집게를 사용 하 여 셀 시트와 막 쥐의 간 단일 엽 놓습니다.</li>
		<li>살 균 염 분의 몇 방울을 추가 하 고 그것에서 셀 시트 분리 막에 부드러운 압력을 적용.</li>
		<li>신중 하 게 막 제거 하기 전에 5 분 기다립니다. 참고:이 셀 시트 제대로 간 연결 위해 수행 됩니다.</li>
		<li>마지막으로, 기본 근육 닫고 5-0 나일론 봉합 절 개 피부.</li>
		<li>Povidone-요오드와 수술 영역을 치료. 참고: 그림 2 누드 쥐의 간장에 셀 시트 이식 절차의 다이어그램을 보여 줍니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 수술 후 관리
<ol><li>즉시 수술 후, 식인 풍습 또는 질 식, 방지 하려면 개별적으로 쥐를 집 고 그것은 정기적으로 (매 15 분) 모니터링 의식과 완전히 ambulant 때까지.</li>
	<li>그런 다음, post-operatively, 합병증을 매일 5-14 d, 5 d 이상에 대 한 쥐를 평가 합니다. 매일 평가 하는 동안 다음의 있는지 확인 합니다.<ol>
<li>상처가 닫히고는 봉합 지나치게 꽉 되지 않고 그대로 있습니다.</li>
		<li>과도 한 열, 등 절 개 사이트에서 감염의 흔적은, 붓기 또는 purulent 방전.</li>
		<li>통증, 음식 및 물 소비를 감소, 체중 감소, 탈수, 피부 tenting, 또는 빠르고 오픈 입 호흡 등와 관련 된 흔적을 확인 하 고 있습니다. 제어 심한 수술 후 통증에 적당 한 경우, 주사 쥐 피하 buprenorphine (0.01-0.05 mg/kg)으로 최소 48-72 h에 대 한 모든 6-8 h9 postoperatively.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6입니다. 이식된 지역 분석
<ol><li>Scarifice 쥐 이식 후 한 달에 대 한 이식된 지역 수집 조직학 및 immunohistochemical 분석.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Marra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+targets+and+oxidative+stress+biomarkers+in+hepatocellular+carcinoma:+an+overview.">Molecular targets and oxidative stress biomarkers in hepatocellular carcinoma: an overview.</a> Journal of Translational Medicine. 9, 171 (2011).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li><li>Kushida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decrease+in+culture+temperature+releases+monolayer+endothelial+cell+sheets+together+with+deposited+fibronectin+matrix+from+temperature-responsive+culture+surfaces.">Decrease in culture temperature releases monolayer endothelial cell sheets together with deposited fibronectin matrix from temperature-responsive culture surfaces.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 45 (4), 355-362 (1999).</li><li>Okano, T., Yamada, N., Sakai, H., Sakurai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+recovery+system+for+cultured+cells+using+plasma-treated+polystyrene+dishes+grafted+with+poly+(N-isopropylacrylamide).">A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide).</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 27 (10), 1243-1251 (1993).</li><li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+mesenchymal+stem+cells:+their+phenotype,+differentiation+capacity,+immunological+features,+and+potential+for+homing.">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).</li><li>Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mesenchymal+stem+cell+(MSC)+paradigm:+polarization+into+a+pro-inflammatory+MSC1+or+an+Immunosuppressive+MSC2+phenotype.">A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype.</a> PLoS One. 5 (4), e10088 (2010).</li><li>Waterman, R. S., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cell+1+(MSC1)-based+therapy+attenuates+tumor+growth+whereas+MSC2-treatment+promotes+tumor+growth+and+metastasis.">Mesenchymal stem cell 1 (MSC1)-based therapy attenuates tumor growth whereas MSC2-treatment promotes tumor growth and metastasis.</a> PLoS One. 7 (9), e45590 (2012).</li><li>Curtin, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+buprenorphine+in+a+postoperative+pain+model+in+rats.">Evaluation of buprenorphine in a postoperative pain model in rats.</a> Comparative Medicine. 59 (1), 60-71 (2009).</li><li>. Guidelines on Anesthesia and Analgesia in Rats - ULAM Guidelines and SOPs - Michigan Medicine Confluence Available from: <a target="_blank" href="https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats">https://wiki.med.umich.edu/display/ULAMGSOP/Guidelines+on+Anesthesia+and+Analgesia+in+Rats</a> (2017)</li><li>Alshareeda, A. T., Sakaguchi, K., Abumaree, M., Mohd Zin, N. K., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+cell+sheet+technique+on+the+development+of+hepatocellular+carcinoma+in+rat+models.">The potential of cell sheet technique on the development of hepatocellular carcinoma in rat models.</a> PLoS One. 12 (8), e0184004 (2017).</li><li>Russo, J., Russo, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+and+histologic+classification+of+tumors+of+the+rat+mammary+gland.">Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary gland.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 187-200 (2000).</li><li>Lin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+limitations+of+genetically+modified+mouse+models+in+drug+discovery+and+development.">Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development.</a> Current Drug Metabolism. 9 (5), 419-438 (2008).</li><li>Driscoll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preclinical+new+drug+research+program+of+the+National+Cancer+Institute.">The preclinical new drug research program of the National Cancer Institute.</a> Cancer Treatment Reports. 68 (1), 63-76 (1984).</li><li>Suzuki, R., Aruga, A., Kobayashi, H., Yamato, M., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+in+vivo+cancer+model+using+cell+sheet+engineering.">Development of a novel in vivo cancer model using cell sheet engineering.</a> Anticancer Research. 34 (9), 4747-4754 (2014).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+cell+sheet+technique+in+tissue+engineering.">Application of the cell sheet technique in tissue engineering.</a> Biomedical Reports. 3 (6), 749-757 (2015).</li><li>Matsuura, K., Haraguchi, Y., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+sheet+transplantation+for+heart+tissue+repair.">Cell sheet transplantation for heart tissue repair.</a> Journal of Controlled Release. 169 (3), 336-340 (2013).</li><li>Matsuura, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+development+of+bioengineered+human+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+using+cell+sheet+technology.">Toward the development of bioengineered human three-dimensional vascularized cardiac tissue using cell sheet technology.</a> International Heart Journal. 55 (1), 1-7 (2014).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+evidence+that+tumors+are+angiogenesis+dependent?.">What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent?.</a> Journal of the National Cancer Institute. 82 (1), 4-6 (1990).</li></ol>

저자는 공개 없다.

연구의 광범위 한 금액은 적절 한 비보에 전 임상 동물 모델 인간의 암과 유사한 개발에 전념 하 고 있습니다. 현재, 암 동물 모델을 만드는 데 사용 하는 주요 접근 유전 공학 및 세포 이식11를 포함 한다. 유전자 변형된 동물 모델 식별 및 기본 약물 유발 독성 분자 메커니즘을 이해 뿐만 아니라 대상 유전자의 유효성 검사에 대 한 좋은 도구입니다. 그러나,이 모델은 관련 된 몇 가지 제한 사항이; 예를 들어, 주어진된 유전자의 수정 예상된 형12항상 발생 하지 않습니다. 세포 이식 접근은 더 일반적으로 동물, 암 유발 하는 데 사용 됩니다 그리고 그것은 암 세포 현 탁 액의 주입을 포함 한다. 그러나,이 간단 하 고 편리한 접근에는 그것의 자신의 단점이 있습니다. 세포 현 탁 액을 생성 하는 효소 소화 단계는 암 세포를 수확 하 사용 됩니다. 이 줄어 듭니다 engraftment 효율 이식된 세포의 접착 단백질의 일부의 손실에 결과. 따라서, 거기 보장은 없습니다 이식된 암 세포 유발된 종양의 크기를 조정의 어려움을 언급 하지 않기 위하여 암 조직을 형성할 것 이다. 또한,이 방법은 혈액 순환 또는 비 대상 기관13에 셀 engraftment 이식된 세포의 급속 한 전환을 또 다른 심각한 단점은 있다.
새로운 셀 시트 기술은 이러한 단점을 극복 하기 위해 개발 되었습니다. 스즈키 외. 14 대 장, 간, 그리고 췌 장 종양 베어링 동물 암 세포 시트 이식 방법을 사용 하 여 만들었습니다. 비해 종양 생성 을 통해 암 세포 이식 방법,이 종양 크고 더 안정적 이었다. 작은 종양 조직 이식 종양을 유발 하는 동물에는 높은 효소 소화 단계를 요구 하지 않는 이식 방법의 사용에 의존 합니다. 분해 효소에 손상을 세포 외 매트릭스 셀 상호 작용에 영향을 미치는. 셀 시트 기술 그것의 관련 된 세포 외 매트릭스 및 성장 요인15함께 그대로 단층 셀 시트의 컬렉션을 수 있도록 침략 수확 방법을 사용 하 여이 제한을 극복 한다. 셀 시트 기술 또한 장기 engraftment16,17에 대 한 수 있습니다. 이것은 vivo에서 학문에 큰 가치 있는 세포 조직의 인생17의 전체 기간에 대 한 호스트의 조직으로 engraft 할 수 있어야 합니다. 또한,이 기술은 생 분해성 건설 기계3,15의 사용 없이 조직 공학의 새로운 방법의 개발을 사용할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 여전히는 몇 가지 제한이 있습니다. 셀 시트 기술을 사용 하 여, 이식할된 조직의 중앙 부분 괴는 이식 너무 크면 가능 하 게 될 수 있습니다. 반대로, 작은 경우에 이식 너무 이식의 성공 기회를 줄일 수 있습니다. 또한, 하려면 종양의 후속 성장 제어, 이식 조직의 크기 되어야 합니다 균일 한 모든 실험에서. Transplantable 조직의 크기 2 mm3 때문에 불 쌍 한 산소 환경18괴 사 유도 결과로 제한 됩니다.
이 연구에는 HCC 동물 모델 성공적으로 만들었습니다 비 계 없는 이식 셀 시트를 사용 하 여. 셀 시트의 세 가지 유형으로 쥐의 간을 이식 했다: 라인 셀 셀 HCC의 셀 시트, 세포 라인 세포 및 BMSCs, HCC의 셀 시트와 세포 라인 세포 및 UCMSCs HCC의 셀 시트. 모든 세 개의 셀 시트 이식 받는 사람 쥐에서 종양을 유발 하기에 충분 했다. 그러나, 그것은 그 형성된 된 종양의 크기 감소는 시트를 MSCs 추가 지적 했다. 이 MSCs를 사용 하 고, 특히 UCMSCs, 종양 개발에 불리 한 영향을 나타냅니다. 결론, 암 세포 시트 이식 단단한 종양 동물 모델을 생성 하는 효율적인 방법을 제공 합니다. Vivo에서 모델 같은 데 하는 것은 상당한 응용 프로그램 중요 한 임상 정보 귀 착될 수 있었다. 또한, 종양 크기 감소에 의해 명백한 UCMSCs는 종양 개발 및 전파를 제한합니다. 이 암 치료에 대 한 일부 MSC 하위 셀 기반 접근 방식에 사용 될 수를 나타냅니다.

HCC는 간 크게 빈약한 예 지와 관련 된 기본 암입니다. 매년, 거의 절반 백만 새로운 환자 진단 HCC, 간 암 환자 세계1의 85%를 대표 하는. Hepatocarcinogenesis는 단일 형태의 질병; 오히려, 그것은 이외에 다른 histopathological 기능 및 유전자와 게놈 다양성, 질병의 모음 다양 한 전조 결과1. 따라서, HCC에 대 한 효과적인 치료 전략의 개발의 주요 과제는 HCC 생물학의 제한 된 지식과이 복잡 한 질병을 이해 하는 것을 도울 수 있는 적합 한 실험 동물 모델의 부족. Vivo에서 동물성 모형 인간 암 모방 하는 후보 유전자를 선택 하 고 연루 조사 암 응답에 영향을 미칠 수 있는 다른 요인 뿐만 아니라 암 유도, 전조/예측 마커 식별에 필요한 치료 요원입니다.
시험관에 암 연구는 여전히 주요 한계에 연관 된다. 이 사실은 암 세포 기능의 그들의 비보에 문화에서 유지 될 때 많은 손실입니다. 세포 생체 외에서 결과 비보 전 설정에서 전체 조직 생리학의 부재에서 발생 하는 변경 합니다. 암 세포 세포 상호 작용 (실질, 면역, 맥 관 구조, 상피, 등) 종양 microenvironment 내 암 세포 특성2에 크게 반영합니다. 종양 microenvironment 암 세포 유전자/단백질 표정 및 angiogenetic 및 전이성 잠재력 phenotypic 특성을 변경할 수 있습니다. 2 차원 (2 차원) 생체 외에서 문화 시스템은 또한 종양의 진행을 조절 하는 데 필요한 적합 한 조직 매트릭스를 결여 된다. 따라서, 이러한 제한으로 인해 모델 vivo에서 항상 체 외에 모델의 예비 결과 지원 하기 위해 활용 되어야 합니다. 이 연구에서 우리는 vivo에서 동물 모델을 기본 HCC 완전 한 생물학 과정을 보통 개발 하 셀 시트 기술을 사용 합니다.
이상 10 년 전, 오 카노의 실험실 설립 셀 시트 기술3에 따라 조직 공학의 새로운 방법. 이 기술은 표면 hydrophobicity를 제어 하 여 가역 세포 접착/분리 수 있도록 온도 응답 문화 플라스틱을 이용 한다. 이 메서드는 잘된 세포 외 기질 (ECM) 및 셀 상호 그대로 3 차원 (3 차원) 형식 (i.e.,cell 시트), 배양된 세포의 부드러운 수확을 수 있습니다. 셀 시트 기술은 상업적으로 사용할 수 및 사용할 준비가 문화 요리 (PIPA) 오전, 온도 반응 중합체 poly(N-isopropylacrylamide) precoating을 해야 합니다. 온도 20 ° c에서 PIPA 오전 고분자 화 되 고 반면, 더 높은 온도 (37 ° C)에서 중합체 탈수 되 고 혼 탁 한 침전 변환 수성 솔루션에 용 해. 고분자는 친수성 아 미드 체인 및 소수 성 측 쇄 (이소프로필 그룹)를 포함합니다. 높은 온도에서 물 분자의 브라운 운동 강화입니다, 반면에, 낮은 온도에서 수산화 구조 분석의 이소프로필 그룹 및 소수 성 이소프로필 그룹을 둘러싼 물의 분자 집계 때문에 소수 성 상호 작용. 따라서, 고분자의 전체 체인 집계 하 고 침전 물이4.
제시 연구에서이 기술은 세 가지 다른 셀 시트를 사용 하 여 HCC 동물 모델 개발 채택 된다. 첫 번째 시트 고용 이루어져 HCC 셀 라인만, 반면 다른 두 시트 HCC 셀 라인 셀과 두 개의 서로 다른 소스에서 MSCs의 조합으로 구성: 골 MSCs (BMMSCs) 및 탯 MSCs (UCMSCs). MSCs는 비 조 혈 stromal 세포 adipocytes, 등 osteocytes, chondrocytes, myocytes5엽 혈통의 intocell 파생 상품을 차별화 할 수 있다. 암 셀 시트를 만들 때 이러한 세포를 사용 하는 우리가 하는 이유는 암에 MSCs의 효과에 일치 하지 않는 보고. MSCs가 두 가지 고기를 가질 수 있습니다 제안 되었습니다: "MSC1", proinflammatory 표현 형 및 "MSC2", 면역 표현 형6. MSCs는 수용 체 통행세 같이 (TLRs)를 표현 한다. MSCs의 TLR4 못쓰게 TLR3 못쓰게 면역 요인6의 그들의 분 비를 증가 하는 반면 proinflammatory 요인의 그들의 분 비를 증가 시킵니다. 이러한 두 고기의 생체 외에서 연구 보고 MSC2 공동 문화 반대 효과7를 했다 하는 동안 암 세포 라인 MSC1의 공동 문화 암 세포 성장를 감쇠. 이 연루 MSCs 프로 암 또는 항 암 제, 그들의 표현 형에 따라 될 수 있습니다. 따라서, 셀 시트 기술을 사용 하 여 HCC 동물 모델 개발, 뿐만 아니라 우리 종양 개발에 MSC 이식의 효과 탐험 하고자 이러한 세포를 사용 하 여 것입니다 향상 여부 등이 모델의 개발을 줄이기 위해.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:787px;" width="787">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:501px;">Reagents&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:309px;">FBS&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:309px;">DMEM high glucose&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5671-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:309px;">Penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Life Technology</td>
			<td style="width:119px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:309px;">Sterile physiologic saline</td>
			<td style="width:192px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S0817-1GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:309px;">Human HepG2 cell line</td>
			<td style="width:192px;">ATCC, USA</td>
			<td style="width:119px;">HB-8065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Human bone marrow MSCs cell line</td>
			<td style="width:192px;">PromoCell, USA</td>
			<td>C-12974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:309px;">human umbilical cord tissue MSCs</td>
			<td style="width:192px;">PromoCell, USA&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C-12971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:309px;">Ketamine 50%</td>
			<td style="width:192px;">Rompun, Bayer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:309px;">Xylazine 2%</td>
			<td style="width:192px;">Rompun</td>
			<td style="width:119px;">23076-35-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Alphadine&#174;&#160;solution.</td>
			<td style="width:192px;">Riyadh Pharma</td>
			<td style="width:119px;">LBL0816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:501px;">Disposables:&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:309px;">15mL Polypropylene High Clarity PP Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:192px;">Falcon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:309px;">3.5 cm sterile UpCell culture dishes with the filter paper (membrane)</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">174904-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:309px;">100-1000 &#181;l &#160;Pipette Tips&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CLS4868-1000EA&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Basic Procedure Drape</td>
			<td style="width:192px;">Thermofisher</td>
			<td style="width:119px;">PMD5293.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:501px;">Equipment&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:309px;">Plus pipette, variable volume</td>
			<td style="width:192px;">Eppendorf&#174;&#160;Research&#174;</td>
			<td style="width:119px;">Z683779-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Tissue culture incubator 37 &#176;C, 5% CO2</td>
			<td style="width:192px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Biological safety cabinet</td>
			<td style="width:192px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:309px;">Tissue culture incubator 20 &#176;C, 5% CO2</td>
			<td style="width:192px;">Any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:501px;">Sterile surgical tools and nude rats:&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:501px;">Forceps</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:501px;">Scissors</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="2" height="22" style="height:22px;width:501px;">scalpel&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:309px;">&#160;Nylon Suture&#160; 5-0</td>
			<td style="width:192px;">Accutome</td>
			<td style="width:119px;">AB-3854S</td>
			<td>Monofilament, Lancet</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:309px;">1 ml Tuberculin Syringes</td>
			<td style="width:192px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-826-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:309px;">Nude rats&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Charles river</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the potential of mesenchymal stem cell sheet on the development of hepatocellular carcinoma in vivo

vivo 동물 모델을 모방한 인간의 암 중요 한 임상 정보를 제공 하는 다양 한 응용 프로그램을 가질 수 있습니다. Vivo에서 암 모델의 개발에 대 한 현재 사용 된 기술에는 상당한 제한이. 따라서, 본이 연구에서는 우리 셀 시트 기술을 vivo에서 암 모델 개발을 구현 하고자 합니다. 간세포 암 (HCC) 누드 쥐 HCC 셀 선 세포에서 만들어진 셀 시트를 사용 하 여 성공적으로 개발 됩니다. 암 셀 시트는 세포내 접착 및 세포 외 매트릭스 제어 층 상된 구조 형성을 통해 생성 됩니다. HCC 시트 이식 간 고 한 달 내 종양-베어링 동물 모델의 생성에 대 한 수 있습니다. 또한,이 암 모델 개발에서 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 역할은 조사. HCC 셀 라인 시트 외에 다른 두 셀 시트 만들어집니다: HCC 세포와 골 MSCs (BMMSCs)와 HCC 전지와 탯 MSCs (UCMSCs)의 시트의 시트. HCC 세포와 MSCs의 시트는 종양 방위 동물을 생산 할 수 있습니다. 그러나, MSCs의 추가 구성 된 종양의 크기 줄이고 종양 개발에 불리 한 영향이 사용된 MSCs의 소스에 따라 달라 집니다. 이 특정 MSC의 만든 셀 시트 종양 관리 및 제어에 활용 될 수 나타냅니다.

쥐에 이식된 셀 시트 tumorigenicity:
이식 후 1 개월 쥐의 간은에서 모든 이식된 셀 시트 종양 (그림 3)를 개발 했습니다. HepG2, HepG2/BMMSC, HepG2/UCMSC 셀 시트에서 개발 된 종양의 평균 크기 4.5 cm, 4 cm, 및 2.5 cm, 각각10했다.
간 조직의 조직학 분석:
되며 고 오신 (H & E) 비 이식 쥐 hepatocytes와 간은 서로 anastomose 접시에 배열 하 고 핵 했다 라운드, 하나 또는 두 개의 저명한 nucleoli의 얼룩. 반면, 종양 섹션 수집 가능한 염증 및 괴 사 성 피하 hepatocytes, 불규칙 한 핵 윤곽을의 가장자리 그리고 변성 (그림 4) 취소.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57805/57805fig1.jpg"> 그림 1: 3.5 cm 온도 응답 문화 접시를 사용 하 여 셀 시트의 제조. (A)이이 패널 이식에 적합 하지 않은 손상 된 세포의 시트를 보여줍니다. (B)이이 패널 그대로 셀 시트,이 식을 위한 준비를 보여줍니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57805/57805fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57805/57805fig2.jpg"> 그림 2 : 셀 시트 이식 절차 누드 쥐에서. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57805/57805fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57805/57805fig3.jpg"> 그림 3 : 쥐의 간 세포 시트 이식의 한 달 뒤에 종양 개발. 종양 (A)는 HepG2 세포 시트에서 생성 된 (크기: 4.5 cm), (B) HepG2 및 BMMSC 셀 시트 (크기: 4 cm), 및 (C) UCMSC 및 HepG2 세포 시트 (크기: 2.5 c m). 블루 서클 종양 영역을 표시. 이 그림은 이전에 게시 작업10에서 수정 되었습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57805/57805fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57805/57805fig4.jpg"> 그림 4 : 쥐의 간 조직학 분석. H & E 얼룩 쥐의 간, 셀 시트 이식 후 4 주. (A)이 패널 쇼 정상 쥐 간 세포. (B)이이 패널은 암 세포 이식 후 간 형태를 보여줍니다. 검은색 화살표 간장 암, 녹색 화살표 표시 정상적인 hepatocytes, 파란색 화살표, 염증된 세포를 나타냅니다 나타내고 주황색 화살표 괴 HCC 셀을 나타냅니다. 눈금 막대는 20 배 확대를 나타냅니다. 이 그림은 이전에 게시 작업10에서 수정 되었습니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57805/57805fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

여기, 우리는 vivo에서 암 모델 셀 시트 기술을 사용 하 여 개발 하는 프로토콜을 제시. 이러한 모델은 항 암 치료제의 평가 위한 매우 유용할 수 있었다.

Vivo에서 간세포 암 종 개발에 중간 엽 줄기 세포의 잠재력을 탐험

An in vivo animal model that mimics human cancer could have various applications that deliver significant clinical information. The currently used ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

5.8K 조회수.  Ministry of National Guard Health Affairs. 여기, 우리는 vivo에서 암 모델 셀 시트 기술을 사용 하 여 개발 하는 프로토콜을 제시. 이러한 모델은 항 암 치료제의 평가 위한 매우 유용할 수 있었다.

비디오: Exploring the Potential of Mesenchymal Stem Cell Sheet on The Development of Hepatocellular Carcinoma In Vivo

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

다른 Lineages로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 전파 및 차별 화를위한 3D 플랫폼으로서 알긴산의 Microcapsule

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

연구

생체공학

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

미세 주입 상처 분석 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 표피의 현지화는 응답 기자의 상처<em&gt; 초파리</em&gt; 태아.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

멀티 깊이 원형 단면 Endothelialized 마이크로 채널 - 온 - 칩의 개발을위한 절차

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell number. While researchers commonly reference their seeding density this does not necessarily indicate the actual number of cells that have adhered to the material in question. This is particularly the case for materials, or scaffolds, that do not cover the base of standard cell culture well plates. This study investigates the initial attachment of human mesenchymal stem cells seeded at a known number onto electrospun poly(&#949;-caprolactone) yarn after 4 hr in culture. Electrospun yarns were held within several different set-ups, including bioreactor vessels rotating at 9 rpm, cell culture inserts positioned in low binding well plates and polytetrafluoroethylene (PTFE) troughs placed within petri dishes. The latter two were subjected to either static conditions or positioned on a shaker plate (30 rpm). After 4 hr incubation at 37&#160;oC, 5% CO2, the location of seeded cells was determined by cell DNA assay. Scaffolds were removed from their containers and placed in lysis buffer. The media fraction was similarly removed and centrifuged &#8211; the supernatant discarded and pellet broken up with lysis buffer. Lysis buffer was added to each receptacle, or well, and scraped to free any cells that may be present. The cell DNA assay determined the percentage of cells present within the scaffold, media and well fractions. Cell attachment was low for all experimental set-ups, with greatest attachment (30%) for yarns held within cell culture inserts and subjected to shaking motion. This study raises awareness to the actual number of cells attaching to scaffolds irrespective of the stated cell seeding density.

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

폴리 (ε 카프로 락톤) 전기 방사 원사에 인간 중간 엽 줄기 세포의 첨부 파일을 최적화

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

개발 Zebrafish 마음에 전단 응력을 조절의 효과의 4 차원 이미지를 캡처 빛 시트 형광 현미경 검사 법

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

3 차원 동적 문화 시스템과 다층된 중간 엽 줄기 세포 시트의 건설

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

조직 수준 역학을 제어하기 위해 준수 기판에 인간 배아 줄기 세포 식민지의 기하학적 패터닝

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Isolation, Expansion, and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from the Infrapatellar Fat Pad of the Goat Stifle Joint

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded during arthroscopic procedures and knee replacement surgeries. Additionally, its removal is associated with minimal donor site morbidity. Recent studies have demonstrated that IFP-MSCs do not lose their proliferation capacity during in vitro expansion and have age-independent osteogenic differentiation potential. IFP-MSCs possess superior chondrogenic differentiation potential compared to bone marrow-derived MSCs (BMSCs) and adipose-derived stem cells (ADSCs). Although these cells are easily obtainable from aged and diseased patients, their effectiveness is limited. Hence, using IFP-MSCs from healthy donors is important to determine their efficacy in biomedical applications. As access to a healthy human donor is challenging, animal models could be a better alternative to enable fundamental understanding. Large animals such as dogs, horses, sheep, and goats play a crucial role in translational research. Amongst these, the goat could be a preferred model since the stifle joint of the goat has the closest anatomy to the human knee joint. Moreover, goat-IFP can fulfill the higher MSC numbers needed for tissue regeneration applications. Furthermore, low cost, availability, and compliance with the 3R principles for animal research make them an attractive model. This study demonstrates a simple protocol for isolating IFP-MSCs from the stifle joint of goats and in vitro culture conditions for their expansion and differentiation. The aseptically isolated IFP from the goat was washed, minced, and digested enzymatically. After filtration and centrifugation, the collected cells were cultured. These cells were adherent, had MSCs-like morphology, and demonstrated remarkable clonogenic ability. Further, they differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, demonstrating their multipotency. In conclusion, the study demonstrates the isolation and expansion of MSCs, which show potential in tissue engineering and regenerative medicine applications.

Infrapatellar fat pad mesenchymal&#160;stem cells (IFP-MSCs) can be isolated easily from the infrapatellar fat pad of the knee joint. They proliferate well in vitro, form CFU-F colonies, and differentiate into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages. Herein, the methodology for the isolation, expansion, and differentiation of IFP-MSCs from goat stifle joint is provided.

염소 스티플 관절의 슬개골 하 지방 패드에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 확장 및 분화

The IFP, present in the knee joint, serves as a promising source of MSCs. The IFP is an easily accessible tissue as it is routinely resected and discarded ...