J.J.G.는 그들의 지원에 대 한 국립 과학 재단 (DMR-1654405) 및 암 예방 연구 연구소의 텍사스 (CPRIT) (RP170752s)을 인정 한다.

1입니다. 준비
<ol><li>Lysogeny 국물 (파운드) 한 천 만들고 접시12부.</li>
	<li>
변환 BL21(DE3) wtQβ 외 투 단백질 시퀀스를 포함 하는 pET28 플라스 미드와.
	<ol>
<li>대장균 BL21(DE3) 유능한 세포를 얼음 목욕에 녹여 Microcentrifuge 튜브에서 셀의 장소 50 μ.</li>
		<li>1 개의 관으로 플라스 미드의 2 μ를 추가 하 고 부드럽게 튜브를 끄 적. 다음 30 분 동안 얼음에 품 어.</li>
		<li>열-충격 45 셀 정확히 42 ° c.에 있는 물 욕조에 s 열 충격 직후 얼음 욕조에 다시 튜브를 배치 하 고 5 분 동안 품 어.</li>
		<li>어떤 항생제를 포함 하지 않는 파운드 미디어의 950 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>37 ° c.에 60 분 200 rpm에서 문화를 흔들어</li>
		<li>(대)와 파운드 한 천 배지에서 문화의 100 μ 접시 하 고 37 ° c.에 하룻밤 접시를 품 어 필요할 때 백색 식민지를 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
슈퍼 최적의 국물 (흐 느낌) 미디어를 확인 합니다.
	<ol>
<li>압력솥 L 2 개의 삼각 플라스 크를 당황 하 게 제시카 주기.</li>
		<li>무 균 환경에서 밖으로 무게 추가 tryptone의 20.0 g, 5.0 g의 효 모 추출 물, 무수 황산 마그네슘의 2.469 g 0.584 g 염화 나트륨의 및 각 플라스 크에 염화 칼륨 0.186 g.</li>
		<li>볼륨 1 L를 함께 초순 각 플라스 크에 고압 액체 주기.</li>
		<li>흐 느낌 미디어는 압력가 마로 소독 후 실내 온도 도달 하면, 미디어의 각 리터를 대 (100 mg/mL)의 1 mL을 추가 하 고 4 ° c.에 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0.1 m M 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.00)을 확인 합니다.
	<ol>
<li>초순의 500 ml에서 이수소 칼륨 68.045 g을 용 해 하 여 1 M 칼륨 이수소 솔루션을 확인 합니다.</li>
		<li>칼륨 초순 물 500 mL에 염기의 87.09 g을 용 해 하 여 1 M 칼륨 염기 솔루션을 확인 합니다.</li>
		<li>1 리터 병에 칼륨 이수소 솔루션 및 칼륨 염기의 61.5 mL 38.5 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>7.00, 필요한 경우에 pH를 조정 하 고 1 나의 볼륨을</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0.1 m M 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.00)에 5-40% 자당 그라디언트를 확인 합니다.
	<ol>
<li>50 mL 원심 분리기 튜브에서 0.1 M 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.00)에 용 해 하는 5-40% (5% 단위로 증가) 자당으로 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>긴 바늘 주사기를 사용 하 여 38 mL 라운드-하단 폴 리 카보 네이트 튜브의 하단에 5% 자당 해결책의 3.3 mL를 입금 하 고 5 개의 다른 튜브에 대 한이 반복 합니다.</li>
		<li>조심 스럽게 3.3 mL 튜브의 하단에 10% 자당 해결책의 보증금과 그라디언트를 방해 하지로 바늘을 조심 스럽게 제거. 다른 5 개의 튜브를 반복 합니다. 
		 </li>
	</ol>
</li>
	<li>3.3 mL 레이어 자당 솔루션, 그라디언트를 방해 하지 않는 신중 하면서 각 관에서 40%로 15%에서 증가의 입금을 계속 합니다.</li>
	<li>완료 되 면, 호 기온 변화도의 정상을 커버 하 고-80 ° c.에 저장</li>
</ol>2입니다. Qβ의 표현
<ol><li>1:1 표 백제/에탄올 벤치 영역을 닦으십시오.</li>
	<li>무 균 환경에서 흐 느껴 울 다 미디어의 3 mL에 대장균 BL21(DE3)의 단일 식민지를 추가 하 여 무 균 환경에서 2 개의 3 mL 스타터 문화를 확인 합니다.</li>
	<li>37 ° C, 0% 상대 습도 (rH) 룸에서 250 rpm에서 통에 하룻밤 성장.</li>
	<li>
개 자식 미디어에서 선발 문화 예방:
	<ol>
<li>두 3 mL 스타터 문화 셰이 커 고, 무 균 환경에서 2 중으로 각 시 동기 문화를 부 어 2 L 1 l 각 신선한 흐 미디어의 삼각 플라스 크를 당황 하 게.</li>
		<li>37 ° C, 0 %rH 룸에서 250 rpm에서 통에 접종된 미디어를 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>OD600 0.9-1.0에 도달할 때까지 37 ° C, 0 %rH 룸에서 250 rpm에서 통에 박테리아를 성장.</li>
	<li>1 M 이소프로필 β-D-1 thiogalactopyranoside (IPTG) P1000 피 펫을 사용 하 여 단백질 발현을 유도 하는 것의 1 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° C, 0 %rH 룸에서 250 rpm에서 셰이 커에는 미디어를 하룻밤 둡니다.</li>
	<li>미디어에서에서 제거 흔드는 다음 아침 및 원심 분리기를 사용 하 여 1000 mL 병 20,621 × g에서 4 ° C에서 1 시간에 대 한 셀을 수확 합니다.</li>
	<li>
삭제는 상쾌한 고 셀 펠 릿을 수집 합니다.
	<ol>
<li>박테리아를 죽 일 백제의 약 5 mL로 플라스 크에는 상쾌한 하 거 라. 이것은 폐기물 이다.</li>
		<li>주걱을 사용 하 여 원심 분리기 병의 하단에서 셀 펠 릿을 긁 고 50ml 원심 분리기 튜브에 펠 릿을 넣어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. Qβ의 정화
<ol><li>Resuspend 셀 펠 릿 ~ 20-30 mL의 0.1 M 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.00).</li>
	<li>물의 resuspension 없는 덩어리는 다는 것을 확인 하 고 제조업체의 프로토콜에 따라 microfluidizer 프로세서를 사용 하 여 세포를 lyse ( 재료의 표참조). 입자의 수확량을 증가 시키기에 두 번 이상 세포를 lyse.</li>
	<li>4 ° c.에 1 시간에 250 mL 20,621 x g에서 원심 분리기 병에는 lysate 원심</li>
	<li>펠 릿을 삭제 하 고 상쾌한 ml에서의 볼륨을 측정 한다. 0.265로 그 값을 곱하면 고는 상쾌한 황산 암모늄의 g의 금액 추가.</li>
	<li>단백질에 밖으로 침전 시키기 위하여 200 rpm에서 저 어 접시에 적어도 1 시간에 4 ° C에서 저 어.</li>
	<li>20,621 x g 4 ° c.에 1 시간에 250 mL 병에서 원심</li>
	<li>상쾌한 무시 하 고 약 10 mL의 0.1 M 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.00)와 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>몇 초 동안 vortexing에 의해 원유 샘플 및 혼합 1:1 클로 프롬/n-butanol 동등한 양의 추가 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에 30 분 동안 20,621 × g에서 38 mL 튜브에 원심</li>
	<li>파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 최고 수성 층을 복구 합니다. 수성 및 유기 층 사이 형성 했다 레이어 같은 젤을 사용할 않기로 주의 해야 합니다.</li>
	<li>6 5-40 %pre-made 자당 기온 변화도 녹여 고 약 2 mL에 각 추출의 로드 합니다.</li>
	<li>무료 감속으로 4 ° C에서 16 h 99,582 x g에서 ultracentrifuge.</li>
	<li>발광 다이오드 (LED) 조명 각 튜브 아래 빛나는 고 블루 밴드 표시 한다. 긴 바늘 주사기이 입자를 복구 합니다.</li>
	<li>Ultrapellet 370,541 x g 2.5 h 4 ° c.에 대 한에서 입자</li>
	<li>상쾌한 무시 하 고 0.1 M 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.00) 순화 된 입자의 투명 한 펠 릿 resuspend.</li>
</ol>4. 정량화 및 제품의 확인
<ol><li>Bradford 분석 실험을 사용 하 여 계량 제품13.</li>
	<li>실행 줄이고 비 감소 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) 제품14확인. 참고:; 외 투 단백질의 분자량을 확인 하는 데 사용은 SDS 페이지 감소 비 줄이는 SDS 페이지 더 높은 순서 구조를 확인 하는 것은.</li>
</ol>5. 어근 Qβ에 DB 화합물
<ol><li>
Qβ에 disulfides 줄일 수 있습니다.
	<ol>
<li>해산의 0.0020 g tris(2-carboxyethyl) 초순 100 x 재고 솔루션의 1 mL에 phosphine (TCEP). 참고: 신선한 TCEP 감소 하기 전에 준비.</li>
		<li>Microcentrifuge 튜브에 Qβ (5 mg/mL)의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>100 x TCEP 재고 솔루션의 20 µ L을 추가 하 여 따라.</li>
		<li>1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
다시 dibromomaleimide 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG DB)을 사용 하 여 감소 이황화 다리.
	<ol>
<li>Dibromomaleimide-폴 리 에틸렌 글리콜 (DB-PEG) DMF의 100 µ L의 0.0017 g을 분해.</li>
		<li>10 m m 나트륨 인산 염 해결책 (pH 5.00)의 680 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>추가 DB-말뚝의 솔루션으로 Qβ를 감소 하 고 365 nm UV 램프에서 혼합 과정을 관찰. 밝은 노란색 형광 혼합 시 365 nm 휴대용 UV 램프로 즉시 구상 될 수 있다.</li>
		<li>하룻밤 실 온 (RT)는 불고기 집에 진행 하는 반응 하 게.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원심 필터 반응 혼합물을 정화 (COMW = 10 kDa) 세 번 사용 하 여 1 x PBS 3,283 x g에서 4 ° c.에서 20 분</li>
	<li>줄임으로써 비-SDS 페이지 및 네이티브 agarose 젤 전기 이동 법은 활용을 모니터링 합니다. 참고: VLPs 네이티브 agarose 젤에 그대로 입자로 실행 하 고 그들은 그들의 충전, 크기와 모양에 따라 구분 됩니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Virus-Based+Polymer-Protein+Nanoparticles+by+Atom+Transfer+Radical+Polymerization.">Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).</li><li>Capehart, S., Coylet, M., Glasgow, J., Francis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+Integration+of+Gold+Nanoparticles+and+Organic+Fluorophores+Using+Synthetically+Modified+MS2+Viral+Capsids.">Controlled Integration of Gold Nanoparticles and Organic Fluorophores Using Synthetically Modified MS2 Viral Capsids.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (8), 3011-3016 (2013).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-Directed+Synthesis+of+Porous+and+Protective+Core-Shell+Bionanoparticles.">Template-Directed Synthesis of Porous and Protective Core-Shell Bionanoparticles.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55 (36), 10691-10696 (2016).</li><li>Chen, Z., Li, N., Li, S., Dharmarwardana, M., Schlimme, A., Gassensmith, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+Chemistry:+The+Chemical+Functionalization+of+Viral+Architectures+to+Create+New+Technology.">Viral Chemistry: The Chemical Functionalization of Viral Architectures to Create New Technology.</a> WIREs. Nanomed. Nanobiotechnol. 8 (4), 512-534 (2015).</li><li>Chalker, J. M., Bernardes, G. J. L., Lin, Y. A., Davis, B. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+Hybrid+Bacteriophage+Qbeta+virus-like+particles.">Assembly of Hybrid Bacteriophage Qbeta virus-like particles.</a> Biochemistry. 48 (47), 11155-11157 (2009).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Functionalization+across+Quaternary+Structure+in+a+Virus-+like+Particle.">Fluorescent Functionalization across Quaternary Structure in a Virus- like Particle.</a> Bioconjugate Chem. 28 (9), 2277-2283 (2017).</li><li>. Pouring LB Agar Plates Available from: <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/">https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</a> (2016)</li><li>Smith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Modification,+Bioconjugation,+and+Disulfide+Bridging+Using+Bromomaleimides.">Protein Modification, Bioconjugation, and Disulfide Bridging Using Bromomaleimides.</a> J. Am. Chem. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+Virus-like+Particles+with+Poly(2-oxazoline)s.">Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).</li><li>Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Functionalized+Bacteriophage+Q&#946;+as+a+Photocaged+Drug+Carrier.">Dual Functionalized Bacteriophage Q&#946; as a Photocaged Drug Carrier.</a> Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

작은 단백질 정화에 비해, 살 균 소 Qβ 정화는 독특한 단계 자당 기온 변화도 원심 분리입니다. 클로 프롬/n-butanol 추출 단계 후 Qβ 5-40% 자당 기온 변화도 사용 하 여 더 순화 이다. 원심 분리, 중 입자는 그들의 크기에 따라 구분 됩니다. 더 큰 입자 작은 입자는 낮은 밀도 영역에 체류 하는 동안 더 높은 밀도 영역에 여행. Qβ는 그라데이션의 더 낮은 세 번째에 여행 하 고 더 작은 단백질 불순물은 원심 분리기 튜브의 상단에 갇혀 있는 동안 거기 남아 있다. Qβ의 콜 로이드 서 스 펜 션 보여줍니다 강한 Tyndall 자당에서 뿌리는 때 볼 수 있습니다 파란색 밴드 LED 빛에서 빛나고 아래. 이 밴드는 긴 주사기 바늘을 사용 하 여 추출 다음 쉽습니다. 자당에서 Qβ은 다음 수송과 ultracentrifugation에 의해 명확한 펠 릿을 양보. 펠 릿 원하는 버퍼에 resuspended 또는 더 빠른 단백질 액체 착 색 인쇄기 (FPLC)에 의해 순화 될 수 있습니다. SDS 페이지 결과 입자의 순도 확인할 수 있습니다.
100 x TCEP 재고 솔루션 갓 물 감소 직전에 준비 되어야 한다 그래서 TCEP 인산 염 버퍼, 안정 되지 않습니다. 또한, TCEP 무료 thiol 포함도 활용 반응을 수행 하기 전에 TCEP의 과잉을 제거 필요는 없습니다 그래서 다른 아미노산으로 반응. Dibromomaleimide 화합물은 pH 5.00 나트륨 인산 염 해결책, 감소 된 Qβ를 추가 하 여 다음에 녹아 있다. 5.00 pH, 시스테인 (감소 이황화) protonated, 다시는 아에 다시 산화를 방지 하 여 dibromomaleimide와 활용 반응 촉진입니다. 아래 365 nm 자외선 조명, 반응 혼합물에서 노란색 형광 직후 감소 Qβ DB 화합물에 추가 되었습니다. 다르게 Qβ에 미리 합성된 fluorophores, 연결에서이 형광 활용 반응에 의해 유발 됩니다. fluorophore 유황과 maleimide 반지 사이 새로운 채권 생성 되 자 마자 형성 됩니다. 형광 스펙트럼 표시는 여기 (400 nm) 및 방출 (550 nm) 최대 uv GFP 필터는 confocal 현미경에 맞게 (ex λ = 405 nm, λem 500−540 nm =). Qβ 못 했다 다음 혈 청 무료 DMEM에 대 식 세포 Raw 264.7와 알을 품을. 4 시간 후 인큐베이션, Qβ-못 되었고 uptaken punctate 노란색 형광 구획 셀 내부 시각 수 있습니다. 한 언급 하는 사실은 형광 혈 청 또는 다른 시스테인-부자는 리소좀 또는 늦은 endosomes 셀의 내부에 소 혈 청 알 부 민 (BSA)를 어느 정도 대 한 전송 수 있습니다. 시간이 지나면서,이 셀 추적 애플 리 케이 션;에 대 한 세포 내부의 형광 약하게 그러나, 그것은 또한 약물 전달 시스템에 대 한 새로운 디자인을 위한 기회를 제공.
결론적으로, 우리 dibromomaleimide thiol 화학을 통해 DB-말뚝 Qβ VLP에 어근은 설명 했다. 모든-에-하나의 활용 반응 뿐만 아니라 functionalizes와 못, VLP에 숨 구멍을 따라 disulfides 하지만 또한 그것 붙일 레이블된 배치할 나노.

바이러스 성 capsids 나노 크기를 사용 하 여 생물 의학 연구1,2,3응용 프로그램의 범위를 확대 하는 것을 목표로 하는 흥미 진 진한 필드로 떠오르고 있다. Recombinantly 표현된 바이러스 같은 입자 (VLPs)는 구조적으로 바이러스에서 파생 된 하지만 그들은 그들에 게 비 전염 성 배치할 나노 입자를 만드는 원래 바이러스 유전 물질 부족 합니다. 표면 기능 프로그램 유전자는 고 각 capsid 앞뒤 사람에 게 동일 하 게 표현 된다, 위치 및 원자 정밀도로 아미노산의 반응 측면 체인의 수를 알아야 가능 하다. 대부분의 경우에서 외부와 실내 표면 bioconjugation 반응-는 biomolecule와 합성 사이 공유 결합을 형성 하는 반응을 통해 functionalized feasibly 수 있습니다 용 매 노출된 아미노산 잔류물의 많은 종류를가지고 분자4,5.
Bioconjugation 반응 생체의 비교적 간단한 패션에서 더 다양 한 기능을가지고 도움이 됩니다. 분자의, 치료 약6, 형광 태그7 등 폴리머8,9 미리 합성 하 고 특징 VLPs의 표면에 연결 하기 전에 수 있습니다. 생물 의학에서 특히 일반적인 VLP 바이오 소재 연구, recombinantly 표현으로 28 nm icosahedral 바이러스 성 capsid10살 균 소 Qβ에 따라 VLP 되었습니다. 비록 우리가 최근에 Haddleton 베이커 반응을 통해 Qβ의 숨 구멍 줄 감소 disulfides dibromomaleimide 화합물의 성공적인 활용11 전달 Qβ에 가장 일반적인 반응 사이트 넓은 여백에 의해 lysines 있습니다. 반응 좋은 진행 항복 하 고, 동등 하 게 중요 한 것은, 입자의 열 안정성을 잃고 없이. 동시에이 반응을 활용 유도 형광, 셀으로이 입자의 통풍 관을 추적 하는 데 사용할 수 있습니다 생성 합니다. 이 작품에서는, 우리 Haddleton 베이커 반응, 밝은 노란색 fluorophore를 통해 Qβ의 표면에 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)의 활용을 보여 줍니다. 이러한 입자 세포에 의해 그들은 촬영으로 추적할 수 있습니다. 본 프로토콜 연구원 원리 용 노출된 disulfides 포함 된 많은 다른 VLPs 중 하나에 적용 되는 새로운 형광 PEGylated 배치할 나노 입자를 기반으로 Qβ, 생성 도움이 됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LB Broth (Miller)&#160;</td>
			<td style="width:71px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">1.10285.0500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Tryptone, Poweder</td>
			<td style="width:71px;">Research Products International</td>
			<td style="width:119px;">T60060-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Yeast Extract, Poweder</td>
			<td style="width:71px;">Research Products International</td>
			<td style="width:119px;">Y20020-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anhydrous magnesium sulfate</td>
			<td style="width:71px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">CI-06808-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S271-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP366-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Elga PURELAB Flex 3 Water Purification System</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4474524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP362-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S25590B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I6758-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fiberlite F10-4x1000 LEX rotor&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">096-041053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td style="width:71px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">KW-0066-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:71px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">32614-M6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1-Butanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A399-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">SW 28 Ti Rotor, Swinging Bucket, Aluminum</td>
			<td style="width:71px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Bucket Set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Type 70 Ti Rotor, Fixed Angle, Titanium, 8 x 39 mL,</td>
			<td style="width:71px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Coomassie (Bradford) Protein Assay</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">PI23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">TRIS Hydrochloride</td>
			<td style="width:71px;">Research Products International</td>
			<td style="width:119px;">T60050-1000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tetramethylethylenediamine</td>
			<td style="width:71px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">J63734-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4706-2G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2 3-Dibromomaleimide 97%</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">553603-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Polythylene Glycol</td>
			<td style="width:71px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">41561-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium Phosphate</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AC424375000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Acrylamide/bis-Acrylamide</td>
			<td style="width:71px;">P212121</td>
			<td style="width:119px;">RP-A11310-500.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3771-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP179-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FV3000 confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:71px;">Olympus&#160;</td>
			<td>FV3000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Labnet Revolver Adjustable Rotator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Thomas Scientific&#160;</td>
			<td>1190P25&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1000 mL Sorvall High Performance Bottle, PC, with Aluminum Cap&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">010-1459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nalgene Centrifuge Bottles with Caps, Polypropylene Copolymer</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">3141-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nunc Round-bottom tubes; 38 mL; PC</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">3117-0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2 L Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks with Heavy Duty Rim</td>
			<td style="width:71px;">Pyrex</td>
			<td style="width:119px;">4980-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td style="width:71px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">UFC801024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">M-110P Microfluidizer Materials Processor</td>
			<td style="width:71px;">Microfluidics</td>
			<td style="width:119px;">M-110P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">3117-0380PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate</td>
			<td style="width:71px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">41121703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cylinder, Graduated - Polypropylene 250 mL</td>
			<td style="width:71px;">PolyLab</td>
			<td style="width:119px;">80005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">533LS-E Series Steam Sterilizers</td>
			<td style="width:71px;">Getinge</td>
			<td style="width:119px;">533LS-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TrueLine, Cell Culture Plate, Treated, PS, 96 Well, with Lid</td>
			<td style="width:71px;">LabSource</td>
			<td style="width:119px;">D36-313-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microcentifuge Tube: 1.5mL</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">VWR Os-500 Orbital Shaker</td>
			<td style="width:71px;">VWR Scientifc Products</td>
			<td style="width:119px;">14005-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetra Handcast systems</td>
			<td style="width:71px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">1658000FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Polypropylene, 250 mL</td>
			<td style="width:71px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">41121703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Spectrofluorometer NanoDrop</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Long Needle&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Hamilton&#160;</td>
			<td style="width:119px;">7693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Exel International 5 to 6 cc Syringes Luer Lock</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-841-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">P1000 Pipetman</td>
			<td style="width:71px;">Gilson</td>
			<td style="width:119px;">F123602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">P200 Pipetman</td>
			<td style="width:71px;">Gilson</td>
			<td style="width:119px;">F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">P100 Pipetman</td>
			<td style="width:71px;">Gilson</td>
			<td style="width:119px;">F123615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">P20 Pipetman</td>
			<td style="width:71px;">Gilson</td>
			<td style="width:119px;">F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">P10 Pipetman</td>
			<td style="width:71px;">Gilson</td>
			<td style="width:119px;">F144802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic High Precision Laboratory Balance</td>
			<td style="width:71px;">Intelligent Weighting Technology</td>
			<td style="width:119px;">IWT_PM100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 well, 50 &#181;l</td>
			<td style="width:71px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">456-1084</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

making conjugation-induced fluorescent pegylated virus-like particles by dibromomaleimide-disulfide chemistry

바이러스 같은 입자 (VLPs) 생물 의학에 있는 최근 증가 및 재료 연구 생 합성, 개별 크기, 유전자 프로그래밍 및 biodegradability의 그들의 용이 함에 표시 될 수 있습니다. 그들은 그들의 표면에 합성 ligands를 추가 하기 위한 bioconjugation 반응에 매우 의무가 있어, 이러한 수성 태어난된 capsids에 bioconjugation 방법론에서 범위 상대적으로 제한 됩니다. 촉진 하기 위해 기능성 생체 재료 연구의 방향, 비 전통적인 bioconjugation 반응은 고려 되어야 한다. 이 프로토콜에서 설명 하는 반응 dibromomaleimides를 사용 하 여 살 균 소 Qβ를 기반으로 한 VLP의 노출된 이황화 결합 용 매에서 새로운 기능을 소개. 또한, 최종 제품은 형광, 추적이 가능한 생체 외에서 프로브를 상업적으로 사용할 수 있는 필터 세트를 사용 하 여 생성의 이점이 있다 이다.

Dibromomaleimide 파생 상품 dibromomaleimide 무수 물 및 1 차 아민15사이 응축 반응을 통해 합성 될 수 있다. 또는 N-methoxycarbonyl 활성화 3, 4-dibromomaleimide를 사용 하 여 가벼운 합성 방법16 methoxypolyethylene 글리콜 (PEG) 수익률 DB-페그 (그림 1)에 반응 하 여 여기 악용 했다. NMR 화합물 구조 (그림 2)를 식별 하기 위해 사용 되었다. Qβ VLP는 28 nm icosahedral 배치할 나노, 180 동일한 외 투 단백질의 구성 되는 이다. 외 투 단백질에서 인접 한 외 투 단백질17β 시트와 그들의 α 나선형 도메인 통해 noncovalent 연동 이합체를 형성 하는 경향이 있다. VLPs는 높은 온도, 극단적인 pHs, 그리고 다양 한 용 매 작곡18에서 그들의 안정성을 위해 선택 하는 경향이. 이 경우에, Qβ VLP Leviviridac 가족 180 간 물가 이황화 채권 capsid19 (그림 3)에 대칭의 5-6 배 축에 있는 때문에 다른 RNA 페이지 보다 더 안정적입니다. 이러한 hexameric 및 pentameric 구조 비 감소 SDS 페이지19에 의해 구상 될 수 있다 disulfides에 의해 연결 됩니다. TCEP 10 등가물 (tris(2-carboxyethyl)phosphine) (0.70 µmol), Qβ (0.070 µmol 외 투 단백질, 0.070 µmol disulfides)의 1 mg에 disulfides 상대 하나에 실내 온도에 감소 Qβ capsids (rQβ)를 생성 하기 위해 모든 disulfides를 줄이기 위해 사용 되었다 시간, 그리고 비 감소 SDS 페이지 모든 더 높은 순서 구조 단위체 외 투 단백질(그림 4 및 그림 5A) 감소 되었다 보여준다. 원유 rQβ 혼합 DB-말뚝의 솔루션의 20을 직접 추가 되었다 rebridge 그들에 반응 한 냄비 합성으로 이루어졌다 (1.4 µmol)에서 나트륨 인산 염 (10 m m, pH 5.00, 10 %DMF) 다음 한 시간 감소 반응11. DB-말뚝의 추가 직후 365 nm UV 램프 (그림 5D) 아래 밝은 노란색 형광을 관찰 했다. 혼합물은 다음 incubated RT에서 하룻밤 불고기 집, 정화 원심 필터를 사용 하 여 다음에 (MWCO = 10 kDa) 작은 분자의 초과 하는 금액을 제거 하려면 시간 원하는 버퍼 3 rinsing. Qβ-malemide 어원이 같은 말 10 m m 나트륨 인산 염 해결책 (pH 5.00) photostability를 홍보 하로 resuspended 했다. 활용을 줄임으로써 비-UV 및 coomassie 파란 얼룩 (그림 5A) SDS 페이지 확인 됐다. 모든 밴드는 coomassie 파란 얼룩, 성공적인 활용을 나타내는 colocalized 자외선에서 형광 (그림 5A)를 보였다. Qβ 못 어원이 같은 말의 무결성 네이티브 agarose 젤 전기 이동 법 그리고 전송 전자 현미경 (TEM) (그림 5B, C)에 의해 확인 되었다.
형광 분광학 Qβ-maleimide (Qβ-Μ)와 Qβ-못 되며 약 400 nm 540-550 nm, 각각의 여기 및 방출 맥시 마를 보였다 (그림 6). 이 정렬 상용 GFP uv 필터 집합, 그 흥분 파장은 405 nm 및 방출 파장은 500-540 nm. 상업적으로 사용할 수 있는 필터와 어원이 같은 말의 photophysical 속성의 편리한 맞춤 허가 체 외에서 조사, 그리고 그림 7에 몇 군데는로 Qβ 말뚝을 사용 하 여 설정 합니다. Qβ-나무 못 (200 nM) 혈 청 무료 DMEM 매체에 마우스 Raw 264.7 세포와 인 큐베이 팅, 핵 얼룩이 옵니다. 그림 7 에 colocalization 이미지 노란색 형광 입자 Raw 264.7 세포 uptaken 되었고 외피의 4 시간 후에 추적할 수 있습니다 보여 줍니다. Unfunctionalized Qβ VLPs 무시할 형광을 표시합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57712/57712fig1.jpg"> 그림 1: DB-말뚝의 합성 계획. <a href="/files/ftp_upload/57712/57712fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57712/57712fig2.jpg"> 그림 2: NMR 특성화. (A) 1 H NMR 및 (B) 13C DB-말뚝의. <a href="/files/ftp_upload/57712/57712fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57712/57712fig3.jpg"> 그림 3: Qβ VLP capsid 키메라에 처리의 결정학 구조 (PDB ID: 1QBE). 두 개의 시스테인 잔류물 (Cys 74와 Cys 80) 오렌지에 표시 됩니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57712/57712fig4.jpg"> 그림 4: Qβ maleimide (Qβ M) 어원이 같은 말의 활용 계획. Qβ (0.07 µmol disulfides의) TCEP의 10 항목을 사용 하 여 감소 되었다 (0.7 µmol)에서 dibromomaleimide 화합물 (DB와 DB 못)의 20 등가물의 추가 의해 따라 한 시간 동안 RT (1.4 µmol). <a href="/files/ftp_upload/57712/57712fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57712/57712fig5.jpg"> 그림 5: Qβ, rQβ의 Qβ M와 Qβ-못. (A) 비 감소 SDS 페이지 및 (B) 네이티브 agarose 젤 Qβ, rQβ, Qβ-M의 그리고 Qβ-못 UV (맨 위) 및 coomassie 파란 얼룩 (아래). (C) Qβ-M (위)와 Qβ-못 (아래)의 TEM 현미경 사진. (D) 365 nm 자외선 조명 아래 맨 Qβ의 사진-말뚝 반응 혼합물. <a href="/files/ftp_upload/57712/57712fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57712/57712fig6.jpg"> 그림 6: 형광 스펙트럼. 형광 여기 (A) 및 방출 (B) 의 스펙트럼 Qβ M와 칼륨 인산 염 버퍼 (pH 7.00)의 0.1 m M에 Qβ-못. 최대 여기는 약 400 nm와 방출 최대 주위는 540-550 nm. <a href="/files/ftp_upload/57712/57712fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57712/57712fig7.jpg"> 그림 7: macrophage 264.7 세포에서 단백 결합 Qβ 말뚝의 Confocal 형광 이미지. 블루: NucRed 라이브 647 ReadyProbes 시 약. 노란색: Qβ-말뚝입니다. 상단 이미지: 파란색과 노란색 채널 병합. 하단 이미지: 밝은 분야 심상. 필터 세트: uv-GFP (ex λ = 405 nm, λem = 500-540 nm), Cy5. 외피의 시간 이었다 4 h. <a href="/files/ftp_upload/57712/57712fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

Dibromomaleimide-아 황산 화학에 의해 형광 PEGylated 바이러스 같은 입자 활용 유도 만들기

여기, 선물이 붙일 functionalize dibromomaleimide와 Qβ VLP에 disulfides에 절차. 우리는 Qβ 식 및 정화, dibromomaleimide 기능성된 분자의 합성 및 dibromomaleimide와 Qβ 사이 활용 반응 설명합니다. 결과 노란색 형광 활용된 입자 셀 안에 형광 프로브로 사용할 수 있습니다.

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

making-conjugation-induced-fluorescent-pegylated-virus-like-particles

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.8K 조회수.  University of Texas at Dallas. 여기, 선물이 붙일 functionalize dibromomaleimide와 Qβ VLP에 disulfides에 절차. 우리는 Qβ 식 및 정화, dibromomaleimide 기능성된 분자의 합성 및 dibromomaleimide와 Qβ 사이 활용 반응 설명합니다. 결과 노란색 형광 활용된 입자 셀 안에 형광 프로브로 사용할 수 있습니다.

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Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance. The abundance of membrane proteins in cells underlies the need for comprehensive study of the folding of this ubiquitous family of proteins. Additionally, advances in our ability to characterize diseases associated with misfolded proteins have motivated significant experimental and theoretical efforts in the field of protein folding. Rapid progress in this important field is unfortunately hindered by the inherent challenges associated with membrane proteins and the complexity of the folding mechanism. Here, we outline an experimental procedure for measuring the thermodynamic property of the Gibbs free energy of unfolding in the absence of denaturant, &Delta;G&deg;H2O, for a representative integral membrane protein from E. coli. This protocol focuses on the application of fluorescence spectroscopy to determine equilibrium populations of folded and unfolded states as a function of denaturant concentration. Experimental considerations for the preparation of synthetic lipid vesicles as well as key steps in the data analysis procedure are highlighted. This technique is versatile and may be pursued with different types of denaturant, including temperature and pH, as well as in various folding environments of lipids and micelles. The current protocol is one that can be generalized to any membrane or soluble protein that meets the set of criteria discussed below.

This video article details the experimental procedure for obtaining the Gibbs free energy of membrane protein folding by tryptophan fluorescence.

막 단백질 폴딩의 열역학은 형광 분광학에 의해 측정

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

연구

생체공학

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

탈착 전기 분무 이온화 질량 분석에 의한 생물 조직의 이미지

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Intra-lymph Node Injection of Biodegradable Polymer Particles

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these foreign molecules to T and B lymphocytes. Lymph nodes have thus become critical targets for new vaccines and immunotherapies. A recent strategy for targeting these tissues is direct lymph node injection of soluble vaccine components, and clinical trials involving this technique have been promising. Several biomaterial strategies have also been investigated to improve lymph node targeting, for example, tuning particle size for optimal drainage of biomaterial vaccine particles. In this paper we present a new method that combines direct lymph node injection with biodegradable polymer particles that can be laden with antigen, adjuvant, or other vaccine components. In this method polymeric microparticles or nanoparticles are synthesized by a modified double emulsion protocol incorporating lipid stabilizers. Particle properties (e.g.&#160;size, cargo loading) are confirmed by laser diffraction and fluorescent microscopy, respectively. Mouse lymph nodes are then identified by peripheral injection of a nontoxic tracer dye that allows visualization of the target injection site and subsequent deposition of polymer particles in lymph nodes. This technique allows direct control over the doses and combinations of biomaterials and vaccine components delivered to lymph nodes and could be harnessed in the development of new biomaterial-based vaccines.

Lymph nodes are the immunological tissues that orchestrate immune response and are a critical target for vaccines. Biomaterials have been employed to better target lymph nodes and to control delivery of antigens or adjuvants. This paper describes a technique combining these ideas to inject biocompatible polymer particles into lymph nodes.

생분해성 폴리머 입자의 림프절 내 주입

Generation of adaptive immune response relies on efficient drainage or trafficking of antigen to lymph nodes for processing and presentation of these ...

Determination of Zeta Potential via Nanoparticle Translocation Velocities through a Tunable Nanopore: Using DNA-modified Particles as an Example

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and nanoparticles. Tunable resistive pulse sensing (TRPS) is a relatively recent adaptation to RPS that incorporates a tunable pore that can be altered in real time. Here, we use TRPS to monitor the translocation times of DNA-modified nanoparticles as they traverse the tunable pore membrane as a function of DNA concentration and structure (i.e., single-stranded to double-stranded DNA).
TRPS is based on two Ag/AgCl electrodes, separated by an elastomeric pore membrane that establishes a stable ionic current upon an applied electric field. Unlike various optical-based particle characterization technologies, TRPS can characterize individual particles amongst a sample population, allowing for multimodal samples to be analyzed with ease. Here, we demonstrate zeta potential measurements via particle translocation velocities of known standards and apply these to sample analyte translocation times, thus resulting in measuring the zeta potential of those analytes.
As well as acquiring mean zeta potential values, the samples are all measured using a particle-by-particle perspective exhibiting more information on a given sample through sample population distributions, for example. Of such, this method demonstrates potential within sensing applications for both medical and environmental fields.

Here we use a polyurethane tunable nanopore integrated into a resistive pulse sensing technique to characterize nanoparticles surface chemistry via the measurement of particle translocation velocities, which can be used to determine the zeta potential of individual nanoparticles.

조정 나노 기공을 통해 나노 입자 전좌 속도를 통해 제타 전위의 측정 : 예를 들어 DNA 변성 입자를 사용하여

Nanopore technologies, known collectively as Resistive Pulse Sensors (RPS), are being used to detect, quantify and characterize proteins, molecules and ...

An Integrated System to Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction by Upconversion Nanoparticle-mediated Kinase Photoactivation

Upconversion nanoparticle (UCNP)-mediated photoactivation is a new approach to remotely control bioeffectors with much less phototoxicity and with deeper tissue penetration. However, the existing instrumentation on the market is not readily compatible with upconversion application. Therefore, modifying the commercially available instrument is essential for this research. In this paper, we first illustrate the modifications of a conventional fluorimeter and fluorescence microscope to make them compatible for photon upconversion experiments. We then describe the synthesis of a near-infrared (NIR)-triggered caged protein kinase A catalytic subunit (PKA) immobilized on a UCNP complex. Parameters for microinjection and NIR photoactivation procedures are also reported. After the caged PKA-UCNP is microinjected into REF52 fibroblast cells, the NIR irradiation, which is significantly superior to conventional UV irradiation, efficiently triggers the PKA signal transduction pathway in living cells. In addition, positive and negative control experiments confirm that the PKA-induced pathway leading to the disintegration of stress fibers is specifically triggered by NIR irradiation. Thus, the use of protein-modified UCNP provides an innovative approach to remotely control light-modulated cellular experiments, in which direct exposure to UV light must be avoided.

In this protocol, caged protein kinase A (PKA), a cellular signal transduction bioeffector, was immobilized on a nanoparticle surface, microinjected into the cytosol, and activated by the upconverted UV light from near-infrared (NIR) irradiation, inducing downstream stress fiber disintegration in the cytosol.

원격으로 업 컨버전 나노 중재 니 Photoactivation에 의해 세포내 신호 변환 하는 통합된 시스템

Upconversion nanoparticle (UCNP)-mediated photoactivation is a new approach to remotely control bioeffectors with much less phototoxicity and with deeper ...

Trapping of Micro Particles in Nanoplasmonic Optical Lattice

The plasmonic optical tweezer has been developed to overcome the diffraction limits of the conventional far field optical tweezer. Plasmonic optical lattice consists of an array of nanostructures, which exhibit a variety of trapping and transport behaviors. We report the experimental procedures to trap micro-particles in a simple square nanoplasmonic optical lattice. We also describe the optical setup and the nanofabrication of a nanoplasmonic array. The optical potential is created by illuminating an array of gold nanodiscs with a Gaussian beam of 980 nm wavelength, and exciting plasmon resonance. The motion of particles is monitored by fluorescence imaging. A scheme to suppress photothermal convection is also described to increase usable optical power for optimal trapping. Suppression of convection is achieved by cooling the sample to a low temperature, and utilizing the near-zero thermal expansion coefficient of a water medium. Both single particle transport and multiple particle trapping are reported here.

We describe a procedure to optically trap micro-particles in nanoplasmonic optical lattice.

Nanoplasmonic 광학 격자에 마이크로 입자의 트래핑

The plasmonic optical tweezer has been developed to overcome the diffraction limits of the conventional far field optical tweezer. Plasmonic optical ...

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present several limitations that have led to the use of biomaterials in combination with osteogenic growth factors, such as bone morphogenetic proteins (BMPs). Commonly used absorption or encapsulation methods require supra-physiological amounts of BMP2, typically resulting in a so-called initial burst release effect that provokes several severe adverse side effects. A possible strategy to overcome these problems would be to covalently couple the protein to the scaffold. Moreover, coupling should be performed in a site-specific manner in order to guarantee a reproducible product outcome. Therefore, we created a BMP2 variant, in which an artificial amino acid (propargyl-L-lysine) was introduced into the mature part of the BMP2 protein by codon usage expansion (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk was coupled to functionalized beads through copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). The biological activity of the coupled BMP2-K3Plk was proven in vitro and the osteogenic activity of the BMP2-K3Plk-functionalized beads was proven in cell based assays. The functionalized beads in contact with C2C12 cells were able to induce alkaline phosphatase (ALP) expression in locally restricted proximity of the bead. Thus, by this technique, functionalized scaffolds can be produced that can trigger cell differentiation towards an osteogenic lineage. Additionally, lower BMP2 doses are sufficient due to the controlled orientation of site-directed coupled BMP2. With this method, BMPs are always exposed to their receptors on the cell surface in the appropriate orientation, which is not the case if the factors are coupled via non-site-directed coupling techniques. The product outcome is highly controllable and, thus, results in materials with homogeneous properties, improving their applicability for the repair of critical size bone defects.

Biomaterials doped with Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) have been used as a new therapeutic strategy to heal non-union bone fractures. To overcome side effects resulting from an uncontrollable release of the factor, we propose a new strategy to site-directly immobilize the factor, thus creating materials with improved osteogenic capabilities.

뼈 Morphogenetic 단백질의 2 고체 표면에 화학 클릭 하 여 사이트 감독 동원 정지

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 '황금' 형광 및 질량 분석 및 형광 단백질 분석 엔지니어링

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all variations are based on the 20 canonical amino acids (cAAs). As a way to introduce additional physicochemical properties into polypeptides, the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) is increasingly used in protein engineering. Due to their relatively short length, the modification of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides by ncAAs is particularly attractive. New functionalities and chemical handles can be generated by specific modifications of individual residues. The selective pressure incorporation (SPI) method utilizes auxotrophic host strains that are deprived of an essential amino acid in chemically defined growth media. Several structurally and chemically similar amino acid analogs can then be activated by the corresponding aminoacyl-tRNA synthetase and provide residue-specific cAA(s) &#8594; ncAA(s) substitutions in the target peptide or protein sequence. Although, in the context of the SPI method, ncAAs are also incorporated into the host proteome during the phase of recombinant gene expression, the majority of the cell&#39;s resources are assigned to the expression of the target gene. This enables efficient residue-specific incorporation of ncAAs often accompanied with high amounts of modified target. The presented work describes the in vivo incorporation of six proline analogs into the antimicrobial peptide nisin, a lantibiotic naturally produced by Lactococcus lactis. Antimicrobial properties of nisin can be changed and further expanded during its fermentation and expression in auxotrophic Escherichia coli strains in defined growth media. Thereby, the effects of residue-specific replacement of cAAs with ncAAs can deliver changes in antimicrobial activity and specificity. Antimicrobial activity assays and fluorescence microscopy are used to test the new nisin variants for growth inhibition of a Gram-positive Lactococcus lactis indicator strain. Mass spectroscopy is used to confirm ncAA incorporation in bioactive nisin variants.

The protocol presents the Escherichia coli-based selective pressure incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into the lactococcal antimicrobial peptide nisin. Its properties can be changed during recombinant expression via substitution with desired ncAAs in defined growth media. Resulting changes in bioactivity are mapped by growth inhibition assays and fluorescence microscopy.

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 생산 하는 항균 성 펩 티 드

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.