이 작품은 NIH U24 샘플 살려주는 분석 결과 프로그램 (U24-AI118656) 뿐만 아니라 NIH/NIAID (R21AI119042)에 의해 지원 되었다.

샘플 컬렉션은 피츠버그 대학 기관 검토 위원회 (IRB # PRO16060443, PRO10110387)에 의해 승인 되었다. 모든 실험은 적절 한 개인 보호 장비와 캐비닛 biosafety 아래 수행 됩니다.
1. 장치 제조 및 소프트 리소 그래피
참고: 표준 소프트 리소 그래피 기술을15,16 입니다 (PDMS) 아닌을 만드는 데 사용 했다.
<ol><li>PDMS 전조를 기본 및 경화 에이전트의 10:1 비율로 섞는다.</li>
	<li>PDMS 전조 혼합물의 30 g 마이크로 가공 알루미늄 몰드에 부 어 (치수는 그림 1 참조) 및 100 mm 페 트리 접시에 PDMS 전조 혼합물의 20 g. 참고: 페 트리 접시 지원 계층에 대 한 PDMS (3 m m)의 박막을 만드는 데 사용 됩니다. PDMS의 지원 레이어는 마이크로 걸쳐 균일 한 표면 물성을 제공합니다. 또한, PDMS 박막 유리 슬라이드에 사용할 수 있습니다. 특정 채널 치수와 마스터 몰드 설계와 마이크로 밀링 알루미늄 시트에 의해 조작. 이 연구에 사용 된 나선형 채널 한 입구와 두 개의 콘센트, 효율적인 크기 기반 분리에 대 한 24 m m 8mm에서 증가 하는 반경 8 루프 나선형 아닌 했다.</li>
	<li>아니 거품 표면에, 일반적으로 5-10 분 사용 집 진공은 desiccator 표시 됩니다 때까지 드를 진공 desiccator로 형과 페 트리 접시를 놓습니다.</li>
	<li>진공 놓고 1 시간 동안 90 ° C 오븐에서 형과 페 트리 접시를 놓습니다. 참고: 열판 또는 다른 난방 도구는 오븐 대신 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>오븐에서 형과 페 트리 접시를 제거 하 고 10 분 동안 실내 온도에 냉각 수 있습니다.</li>
	<li>신중 하 게 개요를 잘라 하 고 2mm 구멍을 뚫는 사용 하 여 장치에 액체 접근 구멍을 펀치. 참고: 펀치의 크기는 배관 또는 유체 가이드의 크기에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
	<li>준수는 소자의 채널 쪽을, PDMS의 두꺼운 필름 테이프와 먼지를 제거 하는 집게와 신중 하 게 껍질.</li>
	<li>장치 및 공기 플라즈마와 일반 PDMS와 채권 일반 PDMS (그림 1A)의 준비 지원 계층에 두 채널 측면을 취급.</li>
	<li>50 m m x 70 m m 유리 슬라이드에 칩을 놓고 접합 강도 향상 시키기 위해 적어도 30 분 동안 70 ° C 오븐에 배치 합니다.</li>
</ol>2. 기계적으로 통풍된 환자에서 tracheal 분 비 컬렉션
참고: Tracheal 분 비 물은 얻을 수 있습니다 기계적으로 통풍된 환자에서 정상적인 일상적인 기도 관리 중 표준, 성인 통풍된 환자를 수용 하기 위해 기존의 방법에서 변경 하는 프로토콜을 사용 하 여. 샘플 드 식별 하 고 즉시 처리를 위해 전송 했다.
<ol><li>Tracheal 포부를 표시 하는 경우 카 테 터를 사용 하 여 기도 분 비 물을 추출.</li>
	<li>Endotracheal 튜브로 테 신중 하 게 반 방법은 사전 및 미리 채워진된 10 mL 주사기에서 0.9% 메 마른 정상적인 염 분의 5 mL 주입.</li>
	<li>카 테 터를 완벽 하 게, 고급 또는 저항을 만났다, 분 비 물 발음 고 메 마른가 래 수집 용기에 수집.</li>
	<li>메 마른가 래 컨테이너 tracheal 비의 10 mL를 수집 하 고 얼음에 그것을 배치. 즉시 처리를 위해 샘플을 보냅니다.</li>
</ol>3. tracheal 분 비 샘플 준비
참고: 모든 실험 biosafety 적절 한 개인 보호 장비와 캐비닛에서 수행 되어야 합니다.
<ol><li>1 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) (10 배 희석)에 대 한 플라스틱 10 mL 주사기를 사용 하 여 9 mL에 기도 분 비 샘플의 분산. 무딘 피 펫을 사용 하 여 균질 점액 샘플.</li>
	<li>큰 덩어리 또는 마이크로 접근 구멍 또는 채널을 차단할 수 있는 혈전을 제거 하려면 40 µ m 나일론 셀 스 트레이너와 희석제를 변형. 처리 후 얼음에 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>100 x 양의 희석된 정지 x 1000 결과 PBS 버퍼를 사용 하 여 각 샘플의 희석 액을 분산. 전체 분리 작업 중 얼음에 샘플을 놓습니다.</li>
</ol>4. 실험 설정
참고: 모든 실험 biosafety 적절 한 개인 보호 장비와 캐비닛에서 수행 되어야 합니다.
<ol><li>각 4 개의 나선형 microchannels (그림 1B)의 일정 한 흐름을 적용 유체 가이드와 함께 PDMS 칩을 조립. 참고: 4 채널 처리량 증가를 병렬화, 결과 서 스 펜 션의 볼륨 및 셀 밀도의 최적화에 의해 사용 되었다. 유체 가이드 설계 및 명확한 수 지와 스테레오 리소 그래피 형식 3D 프린터와 함께 했다. 입구와 출구 포트 유체 가이드의 연결 및 작업 중 안정적인 씰링의 용이성에 대 한 여성 Luer 커넥터를 사용합니다.</li>
	<li>입구, 안 벽 (IW) 콘센트와 유체 가이드의 외벽 (아야) 출구 포트 1/16 인치 남성 Luer 커넥터를 연결 하 고 샘플 정지에 실리콘 튜브를 연결.</li>
	<li>무딘 도움말 샘플 저수지의 바닥에 도달 하는 출구 및 입구의 양쪽 끝을 삽입 합니다.</li>
	<li>연동 펌프 유입 배관으로 연결 합니다.</li>
	<li>샘플 저수지에 유입 튜브와 IW 콘센트 튜브의 끝을 놓고 폐기물 저수지 (그림 1 c, D)에 아야 콘센트 배관의 끝을 놓습니다.</li>
	<li>샘플 저수지에 칼슘과 마그네슘 없이 필터링 된 PBS의 50 mL 튜브를 배치 합니다.</li>
	<li>장치를 낮은 흐름 속도 (~ 1 mL/min)에서 펌핑 시작 합니다. 참고: 때 거품에에서 캡처됩니다 채널, 기포를 불안정 하 게 트위터와 채널의 상단을 밀어. 장치는 완전히 버퍼 솔루션 때, PBS 튜브 준비 기도 분 비 샘플 튜브를 변경 합니다.</li>
	<li>샘플 샘플 저수지에 놓으면 연동 펌프에 전환 하 고 4 mL/min (그림 1 c, D)에 흐름 속도 설정 합니다.</li>
	<li>샘플 볼륨에 지정 된 볼륨 (~ 1 mL)에 도달 하면, 작업을 중지 하 고 실리콘 튜브를 분리. 참고: 제안 된 메서드는 희석제의 큰 볼륨을 감소에 더 효율적입니다 (> 50 mL)를 마이크로 원심 튜브 볼륨 (~ 1 mL) (그림 2).</li>
</ol>5. 교류 Cytometry 분석
참고: 분리 방법 (마이크로 및 세포)를 비교, cytometry 면역 형광 검사와 함께 사용 되었다.
<ol><li>Fluorescein isothiocyanate (FITC)-활용된 마우스 반대로 인간 CD66b 단일 클론 항 체 및 allophycocyanin (APC)-마우스 안티 인간 CD45 단일 클론 항 체는 초기 정지 (단계 3.3) 및 결과 정지 (단계 4.9)를 (200 µ L 활용 추가 각 항 체)의 1시 25분의 비율에서 v/v.</li>
	<li>30 분 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>교류 cytometer는 PMNs 척도 두 샘플을 분석 합니다. 참고: FITC APC 이중 긍정, CD45 긍정적인, CD66b 긍정 이며 인구 neutrophils 것 여겨졌다. 복구는 입력 및 결과 서 스 펜 션의 총 세포 수의 비율에 의해 계산 되었다.</li>
</ol>6. 네브라스카 릴리스 분석
참고:는 격리의 기능을 비교 메서드에서 마이크로 및 세포, 호 중구는 NE 분석 결과 키트 사용 되었다.
<ol><li>PMA (분석 결과 키트에 제공 된) 각 결과 정지 (단계 4.9에서 얻은) 50의 최종 농도를 추가 nM.</li>
	<li>2 h 37 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>10 분에 대 한 300 x g에서 정지 원심</li>
	<li>(분석 결과 키트에 제공 된) 96 잘 접시에 각 상쾌한의 10 µ L를 전송 합니다. 참고: 플랫 바닥와 검은 폴리스 티 렌 96 잘 microplate 뿐만 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>각 우물에 희석된 분석 결과 버퍼 (분석 결과 키트에 제공 된)의 90 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>Elastase 기판 (Z 날개 날개 날개 날개 2Rh110, 분석 결과 키트에 제공 된)의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>1.5 h 37 ° c.에 대 한 품 어</li>
	<li>96 잘 접시 485의 여기 파장에는 fluorometer를 사용 하 여 읽기 및 525의 방출 파장 nm. 참고: 네브라스카의 수준 흐름 cytometry 분석에서 PMN 수로 분할 되었다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 여기에 설명 된 기술에 특허 출원을 제기 했습니다.

관성 마이크로 입자 및 셀의 크기5,18,,1920에 따라 마이크로 채널에서 특정 측면 위치에 지역화 합니다. 학장의 결합된 효과의 한 힘 및 곡선된 아닌, 큰 입자 또는 호 중구에 관성 리프트 힘을 끌어 (> 10 µ m) 있는 내부 채널 및 작은 입자, 점액 집계, 및 파편 6 보다 작은 µ m 위치 특정 흐름 속도에서 채널 밖에10,11,,1314조건.
그러나, 특히 때 입자의 분리 크기 범위 또는 관심의 셀 다른 셀/입자와 겹치는 마이크로를 사용 하 여 농도 분리의 복구 사이 교환이 이다. 정렬 된 입자와 셀의 높은 농도 달성 하기 위해 분리 범위 좁은 있어야 하며 각 샘플 실행;에 대 한 현미경 관찰과 미세 조정 이 관성 마이크로 기도 분 비 물 같은 유형이 다른 생체 인식에의 사용을 제한합니다.
여기, 우리가 시험관에서 분석 실험 폐쇄 루프 관성 마이크로 (그림 1B, C)를 사용 하 여에 대 한 임상 기도 분 비 물 샘플 준비 방법 소개. 입자/초점 콘센트를 통해 세포의 재순환에 의해 폐쇄 루프 작업 높은 농도 요인 및 높은 회수율을 달성. 그리고 아야 콘센트 폐기물 관으로 흐름 IW 콘센트는 원래 샘플 튜브를 지속적으로 먹인 다. 10 µ m 직경에서 보다 큰 셀 초기 샘플 튜브, 따라서, 배경 액체 폐기물 튜브를 제거 하는 동안 샘플의 셀 밀도 증가에 남아 있습니다. 높은 희석 속도 파편과 점액을 포함 하 여 배경 액체의 수 있습니다. 또한, 환자 샘플의 상태에 제안된 된 방법 수 균일 하 게 해리 하 고 면역 세포를 분리.
DTT 점액1,,2122셀 내용 구분 proteoglycan 집계에서 이황화 결합을 고대의 널리 mucin 세포의 용 해 버퍼입니다. 그러나, DTT 보도 백혈구 표면 항 원, 백혈구 기능2에 영향을 미칠 수 있는 방해 합니다. 우리의 연구, DTT 분리 되는 세포 내용 했다 일관 된 샘플, 걸쳐 비균일 mucolytic 효율성과 필터의 막힘 때문에. 이것은 더 작은 볼륨으로 초기 샘플 및 상대적으로 두꺼운 기도 분 비 샘플의 준비에 대 한 중요 한 된다. 다른 한편으로, 마이크로 사용 하 여 메서드는 셀 내용 다른 유형의 환자 샘플 (그림 3C)의 일관 된 복구를 사용할 수 있습니다. 그림 3B에서 같이, 우리가 일관 되 게 원래 샘플 상태, 즉, 피 묻은, 끈기, 또는 물에 깨끗 한 버퍼에서 기도 분 비의 셀 내용을 분리 수 있습니다. 종래의 방법에 비해, 제안된 된 방법에 더 적은 파편 다운스트림 생화학 분석에서 파편의 가능한 간섭 최소화 복구 된 샘플 합니다.
NE 릴리스 두 농축 방법 (그림 3D)으로 캡처된 호 중구의 기능적 무결성을 평가 하기 위해 시험 되었다. 호 중구 제거 외국 NE 통해 유기 분자 출시23,,2425. PMA는 일반적으로 체 외에호 중구26를 활성화 하는데 사용 됩니다. 세포는 마이크로 및 mucolytic (DTT) 방법에 의해 분리 50 자극 했다 PMA의 nM. 우리 인간의 기도 분 비 샘플 (P173, P174, P176, P177, P181, 및 P182 표시) 각 메서드를 테스트 합니다. 마이크로 의해 집중 샘플 모든 6 샘플에 대 한 PMA 자극에 의해 북동에 증가 보여주었다. 반면, DTT 처리 샘플의 유일한 3 PMA 자극 후 NE 활동 증가 유발 수 있습니다. 또한, DTT mucolytic 방법에 의해 분리 하는 호 중구 마이크로 의해 고립 된 호 중구 보다 훨씬 더 높은 초기 활동을 보여주었다. 이 결과 보였다 NE 기계의 가능한 화학 소요 표면의 중단 즉, 바인딩된 항2,3, 마이크로 메서드는 보존 측면에서 개선된 방법 건의 하는 DTT 균질 보다 호 중구 기능입니다. 제안 된 분리 방법 또한 자동이 고 완벽 하 게 포함 된 방식으로, 외부 환경의 잠재적인 위험 환자 샘플의 노출을 최소화 작동 합니다.
그러나, 제안된 된 방법에는 높은 유량과, 따라서, 안정적인 유체 연결 필요합니다. 또한, 연동 순환 펌프의 내재 변동으로 인해 IW 콘센트 차원 아야 콘센트 크기 보다 커야 합니다, 그리고 그렇지 않으면 처리량이 저하 될 수 있습니다. 우리는 순환 펌프 보다 안정적인 유량을 제공할 수 있는 경우 제안된 된 방법 보다 높은 처리량을 제공할 것입니다 기대 합니다.
임상 기도 분 비 물에서 호 중구 잡으려고 분리 프로토콜을 제공 함으로써이 연구에서 제시 하는 방법은 폐 렴, 천식, 낭 성 섬유 증, 호흡기 질환에 대 한 임상 연구의 범위를 확장할 것으로 예상 하 고 만성 폐쇄성 폐 질환입니다.

이후 셀 기도 분 비 물에 점액의 다량에 캡슐화, 생체 외에서 시험에 의해 백혈구의 기능 평가 방해 되었습니다 있다. Dithiothreitol (DTT)는 해리 cytological 분석 및 격리 된 셀1,2의 쾌활 생존을 제공 하면서 중재자의 검출에 대 한가 래를 균질 하 가장 일반적인 세포의 용 해 버퍼. 그러나, DTT 방해할 수 있습니다 기도 중 성구의 표면 바인딩된 항 같은 elastase myeloperoxidase (MPO) 릴리스2,3호 중구 기능 장애의 결과로. 따라서, 인간의 기도 호 중구 기능 몇 가지 연구와 말 초 혈액 호 중구, 폐4의 생리 적 특성을 드러내지 수 있습니다 실시 되었습니다. 한편, 관성 마이크로 다양 한 환자 biomatrices5,6에서 세포를 분리 하는에서 발전을 했다. 딘 끌어서 관성 리프트 힘 사이 평형 입자/셀 라벨 무료 입자 분리7를 수 있는 그들의 크기에 따라 정렬 합니다. 우리의 그룹은 이전 순환 종양 세포8,9, 혈액8병원 체, 세포는 현 탁 액 문화10,11, 를 위한 샘플 준비 방법 소개 12, 및 polymorphonuclear 백혈구 (PMNs) 혈액13,14에서.
여기, 다운스트림 시험관에서 분석 결과, 같은 호 중구 elastase (NE) 분석 결과 대 한 폐쇄 루프 관성 마이크로 사용 하 여 환자의 기도 분 비 물에서 면역 세포를 준비 하는 프로토콜을 소개 합니다. 셀/입자의 있는 셀/입자-의-관심은 제거 되어야 하는 임상 견본에서 일반적으로 관찰 되는 측면 방향에 상당한 중복 하는 경우에 특히 높은 농도 및 복구,이 메서드를 제공 합니다. 내부 벽 (IW)를 재순환 하 여-작은 mucin 집계 배경 액체 폐기물 저수지를 통과 하는 동안 큰 입자 또는 셀 입력된 샘플 튜브, 입자 또는 원래 저수지에서 셀의 관심 집중에 다시 집중. 임상 샘플의 이종 유체 속성에도 불구 하 고 제안된 된 방법 1,000-fold 희석 하는 기도 분 비 샘플에서 호 중구의 95% 이상 일관 되 게 복구 솔루션과 깨끗 한 식 염 수 (~ 1 mL). 대조적으로, 세포의 용 해 방법 샘플 조건에 따라 회수율 PMNs의 넓은 범위를 제공합니다. 제안 된 프로토콜 임상 도전 최소한 침략 적 절차와 생체 인식에서 섬세 한 세포 수확에 물리적 또는 화학적 중단 없이 레이블 없는 방식으로 백혈구를 캡처합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PDMS precursor</td>
			<td>Dow corning</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 3.9KG</td>
			<td>10:1 ratio of base and curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR gravity convection oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414005-128</td>
			<td>PDMS precursor to be cured in 90 deg.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89000-324</td>
			<td>Fabrication of PDMS Supporting layer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-core puncher</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>WHAWB100076</td>
			<td>2mm diameter or other depending on the tubing size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air plasma machine</td>
			<td>Femto Science</td>
			<td>Cute</td>
			<td>Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8221; x 3&#8221; glass slide</td>
			<td>TED PELLA, INC.</td>
			<td>2195</td>
			<td>To support PDMS device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-96410-14</td>
			<td>Tubing for microfluidics and peristlatic pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16 inch Luer connector, male</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>PC2 72-1443</td>
			<td>Connector for fluid guide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21008-940</td>
			<td>sample collection &#38; preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-446&#160;</td>
			<td>Buffer solution to dilute sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm</td>
			<td>HALYARD HEALTH</td>
			<td>22113</td>
			<td>Tracheal seceation suction catheter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe</td>
			<td>BD PosiFlush</td>
			<td>NHRIC: 8290-306547</td>
			<td>For tracheal seceation collection from the patients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SecurTainer&#8482; III Specimen Containers, 20mL</td>
			<td>Simport</td>
			<td>1176R36</td>
			<td>Sterile sputum (airway secretion) collection container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>BD309604</td>
			<td>To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160; Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok&#160; Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td>To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#181;m nylon cell strainer&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>21008-949</td>
			<td>To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>HV-07522-30</td>
			<td>operation of microfluidics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSR II flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>LSR II flow cytometer</td>
			<td>Quantification of cell recovery ratio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561927</td>
			<td>Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>561864</td>
			<td>Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td>Varioskan</td>
			<td>Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutrophil elastase assay kit</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>600610</td>
			<td>Neutrophil functionality assessment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoresbrite YG Microspheres 10.0&#181;m</td>
			<td>PolyScience, Inc.</td>
			<td>18140-2</td>
			<td>Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

label-free neutrophil enrichment from patient-derived airway secretion using closed-loop inertial microfluidics

기도 분 비의 면역 관련 세포, 예, 호 중구, 대 식 세포, 림프 톨, 폐 질환, 연구 및 임상 목적을 위해 둘 다의 다양 한 평가를 주요 자원으로 사용 될 수 있는 큰 숫자를 포함. 그러나, 이기종 및 점성의 특성상 환자 점액, 거기 현재 없습니다 신뢰할 수 있는 분리 방법이입니다 환자 기도 분 비에서 호스트 면역 세포를 손상 하지 않는다. 이 연구에서 우리는 환자의 면역 평가 대 한 관성 마이크로 사용 하는 샘플 준비 방법 소개. 임상 샘플의 이종 유체 속성에 제안된 된 방법 1,000-fold 희석 하는 기도 분 비 샘플에서 호 중구의 95% 이상 복구와 깨끗 한 식 염 수의 밀리 리터. 초기 샘플 저수지에 집중된 출력 스트림에 재순환 하 여 높은 농도, 복구, 및 면역 세포의 순도 제공 됩니다; 재순환 관성 마이크로의 단일 실행 주사기 기반 작업에 교환으로 간주 됩니다. 나선형 마이크로의 폐쇄 루프 작업 제공 물리적 또는 화학적 방해 없이 백혈구 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)에 의해 증명-정렬 된 호 중구 elastase 출시를 유도.

우리 모두 DTT mucolysis 및 마이크로 분리 (그림 3A)와 투명 한 면역 세포 정지 달성. 마이크로 분리 수집 105 PMNs x 4.40 평균 (2.1 x 10 x 105 PMNs 5.604 n = 6) 기도 분 비 샘플에서 1,000-fold 희석 (50 mL 전체 볼륨) 깨끗 한 서 스 펜 션의 1 mL. 94.0 %PMNs 초기 희석제에 비해 (CD66b+/CD45+) 6 임상 샘플 작은 볼륨에서 지속적으로 복구 했다. 그러나, DTT mucolysis 메서드 보여 53.5% 복구 평균 중요 한 샘플--예제 유사 (30.8 96.0%) (그림 3B)입니다.
다음, elastase의 릴리스 상업 NE 분석 결과 키트 개념 증명으로 시험 되었다. 외부 자극 없이 mucolytic 메서드에 의해 준비 샘플 보여 높은 NE을 마이크로 메서드에서 샘플 보다 수준. PMA는 마이크로 mucolytic 분리 방법 NE 릴리스 하에서 결과 정지에 추가 되었습니다. 6 다른 환자에서 기도 분 비 샘플 각 방법을 테스트 했습니다. 면역 세포 마이크로 구분 제시 그대로 기능, 네브라스카의 양이 증가 보여주는 PMA 자극에 의해 해제. 다른 한편으로, 셀 mucolytic 분리 방법에 의해 준비 NE 릴리스 (그림 3C)의 일관성이 증가 보였다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57673/57673fig1.jpg"> 그림 1: 나선형 미세 장치 및 실험 설정. 사진 이미지 (A) 나선형 마이크로 및 (B) 소자의 유체 어댑터와 함께 조립. (C) 나선형 관성 마이크로 사용 하 여 폐쇄 루프 분리의 회로도. 원래 샘플 저수지로 다시 집중 하는 입자/셀 스트림 (IW 콘센트)를 재순환 하 여 면역 관련 세포는 mucin 집계를 포함 하는 배경 액체 동안 작은 볼륨에 집중 했다 그리고 사소한 Rbc 지속적으로 아야 콘센트에 연결 하는 폐기물 관을 통해 서 제거. (D) 실험 설정 및 10 µ m 입자 궤적 (녹색), 나선형 채널 (오른쪽 위)의 콘센트의 형광 이미지. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57673/57673fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57673/57673fig2.jpg"> 그림 2: 폐쇄 루프 관성 마이크로 사용 하 여 기도 분 비 샘플 준비의 회로도. 임상 기도 분 비 버퍼 솔루션의 1000 x 볼륨에 기계적으로 분산 유도. 희석제 ~ 1 mL 분명 배경 가진 세포 현 탁 액의 결과로 마이크로 의해 집중 된다. 류 외., 저작권 (2017) 미국 화학 사회17허가 적응. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57673/57673fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57673/57673fig3.jpg"> 그림 3: 미세 분리 방법에 DTT mucolytic 방법의 대표적인 비교. (A) Tracheal 분 비 물 샘플 (왼쪽)와 미세 분리 후 현미경 이미지. (B) 원본과 결과 정지의 사진 이미지. (C) mucolytic 및 마이크로 메서드 사이 PMN 회수율의 비교. (D) 마이크로 PMA 자극 전후 DTT mucolytic 방법에 의해 분리 된 호 중구의 NE 출시의 비교. 북동 릴리스 미세 분리에서 샘플에 PMA에 의해 크게 촉발 되었다 (p < 0.0001). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57673/57673fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

이 연구에서 임상 기도 분 비 물이 나선형 관성 마이크로의 폐쇄 루프 작업에서 레이블 없는 호 중구 분리 방법을 설명 합니다. 제안된 된 방법 분석 실험 임상 생체 외에서 다양 한 호흡기 질환에 대 한 확장 이라고 합니다.

폐쇄 루프 관성 마이크로 사용 하 여 환자 파생 기도 분 비에서 레이블 없는 호 중구 농축

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...

label-free-neutrophil-enrichment-from-patient-derived-airway

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.3K 조회수.  Massachusetts Institute of Technology. 이 연구에서 임상 기도 분 비 물이 나선형 관성 마이크로의 폐쇄 루프 작업에서 레이블 없는 호 중구 분리 방법을 설명 합니다. 제안된 된 방법 분석 실험 임상 생체 외에서 다양 한 호흡기 질환에 대 한 확장 이라고 합니다.

비디오: Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

연구

면역학 및 감염병학

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

인간 호중구 유량 용기 접착 분석

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will die from the disease. The human leukocyte antigen (HLA) class I samples peptides derived from proteasomal degradation of cellular proteins and presents these fragments on the cell surface for interrogation by circulating cytotoxic T lymphocytes (CTL). Generation of T-cell receptor mimic (TCRm) monoclonal antibodies (mAbs) which recognize breast cancer specific peptide/HLA-A*02:01 complexes such as those derived from macrophage migration inhibitory factor (MIF19-27) and NY-ESO-1157-165 enable detection and destruction of breast cancer cells in the absence of an effective anti-tumor CTL response. Intact class I HLA/peptide complexes are shed by breast cancer cells and represent potentially relevant cancer biomarkers. In this work, a breakthrough biomarker screening system for cancer diagnostics incorporating T-cell receptor mimic monoclonal antibodies combined with a novel, label-free biosensor utilizing guided-mode resonance (GMR) sensor technology is presented. Detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated. The impact of this work could revolutionize personalized medicine through development of companion disease diagnostics for targeted immunotherapies.

Intact class I HLA/peptide complexes are shed by cancer cells, representing a potential relevant cancer biomarker. Utilizing label-free sensor technology and T-cell receptor mimicking monoclonal antibodies, detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated, enabling development of a novel cancer diagnostic platform.

라벨이없는 바이오 센서 기술을 활용 유방암 인간 백혈구 항원 바이오 마커의 검출

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

사이토 카인 캡처 시스템을 사용하여 임상 응용 프로그램에 대한 거대 세포 바이러스 고유의 자동화 된 세포 농축은 T 세포

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

IL-1β의 발기인 기반을 DsRed 기자 마우스를 사용 호중구 초벌의 생체 내에 영상

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

호중구 Phagosome 이미징 및 세포질은 비례의 pH 표시기를 사용하여

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil migration and chemotaxis owing to their advantages in real-time visualization, precise control of chemical concentration gradient generation, and reduced reagent and sample consumption. Recently, a growing effort has been made by the microfluidic researchers toward developing integrated and easily operated microfluidic chemotaxis analysis systems, directly from whole blood. In this direction, the first all-on-chip method was developed for integrating the magnetic negative purification of neutrophils and the chemotaxis assay from small blood volume samples. This new method permits a rapid sample-to-result neutrophil chemotaxis test in 25 min. In this paper, we provide detailed construction, operation and data analysis method for this all-on-chip chemotaxis assay with a discussion on troubleshooting strategies, limitations and future directions. Representative results of the neutrophil chemotaxis assay testing a defined chemoattractant, N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), and sputum from a chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patient, using this all-on-chip method are shown. This method is applicable to many cell migration-related investigations and clinical applications.

This article provides the detailed method of performing a rapid neutrophil chemotaxis assay by integrating the on-chip neutrophil isolation from whole blood and the chemotaxis test on a single microfluidic chip.

혈액 방울로부터의 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을위한 올 온칩 (all-on-chip) 방법

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

Label-Free Identification of Lymphocyte Subtypes Using Three-Dimensional Quantitative Phase Imaging and Machine Learning

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification of lymphocyte subtypes is important for the study of immunology as well as diagnosis and treatment of various diseases. Currently, standard methods for classifying lymphocyte types rely on labeling specific membrane proteins via antigen-antibody reactions. However, these labeling techniques carry the potential risks of altering cellular functions. The protocol described here overcomes these challenges by exploiting intrinsic optical contrasts measured by 3D quantitative phase imaging and a machine learning algorithm. Measurement of 3D refractive index (RI) tomograms of lymphocytes provides quantitative information about 3D morphology and phenotypes of individual cells. The biophysical parameters extracted from the measured 3D RI tomograms are then quantitatively analyzed with a machine learning algorithm, enabling label-free identification of lymphocyte types at a single-cell level. We measure the 3D RI tomograms of B, CD4+ T, and CD8+ T lymphocytes and identified their cell types with over 80% accuracy. In this protocol, we describe the detailed steps for lymphocyte isolation, 3D quantitative phase imaging, and machine learning for identifying lymphocyte types.

We describe a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and a machine learning algorithm. Measurements of 3D refractive index tomograms of lymphocytes present 3D morphological and biochemical information for individual cells, which is then analyzed with a machine-learning algorithm for identification of cell types.

라벨-무료 3 차원 양적 위상 이미징 사용 하 여 림프 구의 식별 및 기계 학습

We describe here a protocol for the label-free identification of lymphocyte subtypes using quantitative phase imaging and machine learning. Identification ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

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