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모든 동물 실험은 건강 지침의 국립 연구소에 따라 수행 톨레도 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인됩니다. pIL1-을 DsRed 마우스 1. 표현형 참고 : 자손은 야생형 (WT) C57BL6 마우스를 이형 pIL1-을 DsRed 마우스 번식에 의해 생성됩니다. 세 주 네 오래된 새끼는 표현형에 대한 준비가 간주됩니다. 마우스의 턱밑 출혈은 약간의 수정 (23) 설립 프로토콜을 따른다. <ol><li> 마우스 새끼 전혈에서 백혈구의 분리 <ol><li> 각 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 헤파린의 20 μl를 추가합니다. </li><li> 케이지에서 한 강아지를 획득. 강아지의 식별 태그를 기록합니다. 턱밑 정맥에서 채혈 전에 새끼를 마취 할 필요가 없습니다. </li><li> 목의 목덜미에 의해 강아지를 잡고 일에 턱밑 정맥을 관통5 밀리미터 란셋을 사용하여 전자 뺨 파우치. 혈액 방울 침투의 관점에서 스며 있도록 작은 구멍을 만들 충분한 힘을 적용합니다. 각각의 강아지에 대한 새 바늘을 사용합니다. </li><li> 헤파린 함유 microcentrifuge 관에서 강아지 당 혈액의 5 방울 - 3를 수집합니다. 펑크 사이트를 청소하고 지혈을 용이하게하기 위해 압력을 적용합니다. </li><li> 새 케이지에서 강아지를 넣고 동물 시설에 케이지를 반환하기 전에 30 분 동안 관찰한다. </li><li> 긍정적이고 부정적인 컨트롤로 알려진 표현형의 성인 쥐에서 혈액을 수집합니다. </li><li> 각 튜브, 소용돌이 튜브에 붉은 혈액 세포 용균 버퍼의 500 μl를 추가, 5 부화 - 얼음에 10 분. </li><li> 각 튜브에 세포 현탁액을 아래에 소 태아 혈청 (FBS) 500 μL - 천천히 400을 추가한다. 명확한 계면은 상층의 세포 현탁액 및 FBS의 하층 사이에서 관찰 될 수있다. </li><li> 캡 튜브와 원심 분리기 샘플을 5 분 동안 1,500 × g에서. </li><li> 모피에 1.1.9 - 반복 1.1.7 단계THER는 적혈구를 제거합니다. 용해 처음 충분한 경우 반복하지 않는다. 펠렛 원심 분리 후 식별하기 어려울 수 있습니다. </li></ol></li><li> 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 자극과 문화 <ol><li> 전체 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 1640 배지 200 μl의의를 Resuspend 세포. </li><li> 튜브 유세포에 세포 현탁액을 전송. </li><li> 완전 RPMI 1640 배지 990 μL와 LPS 스톡 용액 10 μL (1 ㎎ / ㎖)을 혼합하여 용액을 작동 LPS를 만든다. </li><li> 세포 현탁액 200 μL에 솔루션을 작업 10 μg의 / ml의 LPS의 20 μl를 추가합니다. </li><li> 캡 튜브는 느슨하게 5 % CO 2와 37 ° C에서 4 시간 동안 샘플을 품어. </li></ol></li><li> 유동 세포 계측법 분석 <ol><li> 유동 세포 계측법에 대한 데이터 취득 프로그램을 연다. 인수를 샘플링하기 전에 인수 템플릿을 설정합니다. </li><li> 도구 팔레트에서 도트 플롯 도구를 클릭합니다. FO 그리기사이드 분산 형 (SSC) 플롯 대 rward 산란 (FSC). 리니어 스케일에 FSC와 SSC 전압 매개 변수를 설정합니다. </li><li> 세포 계수기에 의해 허용 FSC와 SSC의 가장 낮은 임계 값을 선택합니다. 각각, FSC와 SSC에 대한 임계 값 200과 50을 적용합니다. </li><li> SSC 플롯을 대 FSC 내 파편 적혈구와 림프구, 단핵구, 과립구 및 수지상 세포를 포함하고, 배제 게이트 G1을 그린다. </li><li> 도구 팔레트에서 히스토그램 도구를 클릭합니다. FL2 (적색 형광 채널) 히스토그램을 그립니다. 모든 양을 DsRed 이벤트를 포함하는 게이트를 그릴 FL2 신호의 기준과 양성 대조군 샘플을 설정하는 대조군 샘플을 사용한다. </li><li> 사이토의 유체 제어 패널에서 유체 모드 &quot;RUN&quot;과 유량에 &quot;HI&quot;(약 60 μL / 분)을 설정합니다. 각 샘플 10,000 이벤트를 취득. </li><li> G1은 게이트에서을 DsRed 양성 세포의 비율을 측정하여 강아지의 표현형을 결정합니다. </li></ol></li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. pIL1-을 DsRed 마우스에서 피부 염증의 유도 <ol><li> 100 밀리그램 / kg 케타민, 10 밀리그램 / kg 자일 라진 및 1 ㎎ / ㎏ 아세 프로 마진을 포함하는 마취 칵테일을 복강 내 (IP) 주사하여 마우스를 마취. 적절하게 마취 마우스는 발가락 핀치에 뒷 발 철수를 표시하지 않습니다. </li><li> 마우스의 양쪽 귀에의 지느러미 표면에 헤어 제거 크림을 적용합니다. 1 분 30 초를 기다립니다. 물에 적신 솜으로 귀 표면을 닦고 자연 건조를 할 수 있습니다. </li><li> 마이크로 미터를 사용하여 귀 두께를 측정하고 별도의 새장에 마우스를 교체합니다. (- 30 분 ~ 15) 마취에서 회복 될 때까지 관찰한다. 제모 제품에 의한 피부 염증을 해결하기 위해 상기 실험을 수행하기 전에 마우스를 3 일 동안 휴식을 허용한다. </li><li> 1 ml의 아세톤에 OX 16.7 mg의 용해와 올리브 오일의 250 μL와 OX / 아세톤 용액 750 μl를 혼합하여 1.25 % (w / v)의 OX를 준비합니다. 250과 아세톤 750 μl를 혼합하여 차량의 솔루션을 준비합니다# 181; 올리브 오일의 리터. </li><li> 마취 칵테일 (2.1)의 IP 주사로 마우스를 다시하는 것은-마취. 이전과 귀 두께를 측정한다. </li><li> 오른쪽 귀 양쪽에 1.25 %의 OX의 12.5 μl를 적용합니다. 왼쪽 귀 양쪽에 아세톤 / 올리브 오일 차량 액의 12.5 μl를 적용합니다. </li><li> 완벽하게 한 다음, 다른 마우스에 의해 귀에 모욕을 방지 원래의 새장에 마우스를 교체하고 동물의 주거 시설로 돌아 회복 될 때까지 마우스 케이지 동료로부터 분리하십시오. 참고 : 머리 제거 귀 두께의 변화에​​ 의해 다음과 같은 작은 피부 염증의 원인이 될 수 있습니다. 이 작은 염증 3 일 후 해결 정상적인 귀 두께에 의해 확인됩니다. 24 시간 동안 국소 도포 한 후, OX 처리 귀는 유의 한 (P &lt;0.01)에 비해 차량의 솔루션을 단독으로 처리 귀 부종을 보여줍니다. </li></ol> pIL1-을 DsRed 마우스에서 호중구의 3 라벨링 참고 : 저용량 F에 의한 호중구의 생체 표지에luorescence-결합 호중구 특정 단클론 항체는 최근에 개발 된 프로토콜 19을 따른다. 레트로 궤도 주사는 약간의 수정 (24)와 함께 설립 프로토콜에 따라 수행된다. <ol><li> 인산염 완충 식염수 (PBS)의 90 μl를 0.5 ㎎ / ㎖ 알렉사 플 루어 647 - 복합 안티 Ly6G 단클론 항체 (클론 1A8)의 10 μl를 희석 방지 Ly6G 단클론 항체 작업 솔루션을 준비합니다. </li><li> 28 게이지 바늘과 U-100 인슐린 주사기에 방지 Ly6G 단클론 항체 작업 솔루션 (50 μg의 / ㎖) 100 ㎕를 전송합니다. </li><li> 이전에 기술 된 마취 칵테일 (2.1)의 IP를 주입하여 성인 pIL1-을 DsRed 마우스를 마취. 깨끗한 작업 보드의 마취 마우스 복부를 내려 놓습니다. </li><li> 부분적으로 소켓에서 안구 돌출 한 마우스의 눈에 부드러운 아래 피부 지느러미에 압력과 복부를 적용합니다. </li><li> 조심스럽게 복고풍 궤도에 내측 눈구석에서 약 30 °의 각도로, 아래로 베벨, 바늘을 배치공동. 참고 : 운영자가 동에 바늘을 삽입 한 번 압력, 침투 및 안심 저항을 느낄 수 있습니다. </li><li> 천천히 부드럽게 마우스로 용액 (5 μg의 단클론 항체 / 마우스 / 분사)를 작동 방지 Ly6G 단클론 항체의 100 μl를 주입. 빨리 바늘을 제거합니다. 출혈 소량 성공적인 주입 나왔다. </li><li> 바로 오른쪽 마우스 왼쪽 귀에 1.25 %의 OX 차량 솔루션을 적용 할 수 있습니다. </li><li> 8 시간 후, 동일한 마우스로 역 궤도 사출을 통해 새롭게 제조 방지 Ly6G 단클론 항체 작업 용액 (5 μg의 단클론 항체 / 마우스 / 분사) 100 μl를 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 즉시 이미징 전에 혈관을 시각화 30 ㎎ / ㎖ 플​​루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트 (FITC)의 100 μl를 관리하려면 복고풍 궤도 주입을 통해 덱스 트란 (150 kDa의)를 π 공역 계. </li></ol> PIL-1을 DsRed 마우스에서 호중구 초벌 4. 생체 내에 영상 <ol><li> 마취 칵테일 (2.1)의 IP를 주입으로 마우스를 마취.0; 동안 이미징을위한 마취하에 건조를 방지하기 위해 마우스 눈 수의학 연고를 적용합니다. <ol><li> PBS 동량 원래 마취 칵테일 500 ㎕의 희석하여 1 ml의 절반 - 용량 마취 칵테일을 준비한다. </li><li> 나비 27 게이지 바늘로 1 ML의 주사기에 절반 용량 마취 칵테일을 전송합니다. </li><li> 복강 마우스 복부에 나비 바늘을 삽입하고 테이핑에 의해 복부에 나비 날개를 고정합니다. </li></ol></li><li> 촬상 스테이지의 중심에 유리 커버 슬립을 놓는다. 제자리에 고정하는 커버 슬립의 가장자리를 테이프입니다. </li><li> 마우스 귀 복부 표면뿐만 아니라, 커버 슬립을 PBS 방울을 놓는다. </li><li> 위치는 커버 슬립을 통해 자사의 귀 마우스를 마취. 또한 테이프를 통해 장소에서 개최 된 커버 슬립과 유리 슬라이드 사이의 귀를 사이에 의해 아래로 귀 끝, 등쪽를 탑재합니다. </li><li> 멀티 레이저 형광 공 초점 현미경과 관련된 모든 전자 켭니다quipment. 주변 광에 노출을 최소화하기 위해 실내 조명을 끄십시오. </li><li> 이미지 수집 소프트웨어를 엽니 다. 염료 목록 메뉴에서 형광 염료의 검출을위한 레이저 채널을 선택합니다. </li><li> 접안 렌즈를 통해을 DsRed + 세포에서 혈관과 빨간 신호에서 녹색 신호를 관찰하여 염증이 귀 피부에 초점을 조정합니다. </li><li> 스캔 2 μS / 픽셀의 속도와 512 × 512 픽셀의 해상도와 빠른 검사를 수행합니다. 라이브 뷰 메뉴의 각 채널에 대한 사색을 선택합니다. 끝을 설정하고 검사의 위치를​​ 시작하는 데 초점 노브를 조정합니다. </li><li> 8 마이크로 초 / 픽셀 800 × 800 또는 1024 × 1024 픽셀의 해상도 - 스캔 (4)의 속도로 천천히 스캔을 수행합니다. 높은 전압 이득을 조정하고, 채도 (적색 화소)를 피하면서 신호의 세기를 최대화하기 위해 각 채널 오프셋. 각 채널에서 몇 빨간색 픽셀이 있어야합니다. </li><li> 제를 주사하여 입체 화상 세트를 만들전자 귀 피부, 635 μm의 × 635 μm의 × 30 μm의 (20X 목적), 또는 1270 μm의 ×를 각질층에서 표면적으로 시작하여 X, Y, 317 μm의 × 30 μm의 (40X 목표) × 317 μm의의 Z 볼륨으로 하향 진행 2 μm의 Z-단계에서 1270 μm의 × 50 μm의 (10X 목적). 주 : 각질층은 표피의 최 외층이고 용이 강한 자기 형광 신호에 기초하여 국부적 수있다. </li><li> 저속 촬상 실험에서, 레코드 3 차원 영상까지 8 시간마다 2 ~ 4 분. </li><li> 나비 바늘을 통해 절반 용량 마취 칵테일의 10 μL - 마우스가 마취에서 회복하기 시작 일시적으로, 경련 수염의 관찰에 기초하여 기록, 5를 관리 할 수​​ 있습니다. 참고 : 마취 량의주의하십시오 - 과다 복용 마우스 사망의 원인이 될 수 있습니다. 대안 적으로, 용기에 흡입 마취제 단기 마취 A의 마우스에도 적용 할 수있다노즈콘 장기 촬상에 사용될 수있다. </li><li> 이미징이 완료되면 무대에서 마취 마우스를 제거합니다. 테이프를 분리하고 마우스의 복부에서 나비 바늘을 제거합니다. 동물의 주거 시설에서 별도의 케이지에 마우스를 돌려줍니다. 참고 : - 3 시간 단기 영상 (&lt;1 시간)의 경우, 마우스는 완전히 1에 신속하게 마취에서 회복. 16 시간 - 장기 영상 (~ 8의 시간)의 경우, 마우스 (12)의 통상의 회복 기간을 서서히 회복. 따라서, 경구 투여 물은 심각한 탈수를 방지하기 위해 회복 기간 중 적어도 몇 회에서 추천된다. </li><li> 처리 영상 데이터 세트는 개별 셀을 추적 이동성 경로를 생성하고, 화상 해석 소프트웨어 (25)를 사용하여 세포 이동의 방향성 및 속도를 계산한다. </li></ol>

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Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).</li><li>Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+effects+of+domoic+acid+differ+between+in+vivo+and+in+vitro+exposure+in+mice.">Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice.</a> Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).</li><li>Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. 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Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window.">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung.">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).</li></ol>

The authors have no financial conflicts of interest.

본 연구의 목적은 아직 현재의 기술에 의해 실현되지 않은 살아있는 동물의 호중구 프라이밍의 과정을 모니터링하는 기술을 개발하는 것이다. 이 목표를 달성하기 위해 세 가지 설정 방법이 수행됩니다 : 피부 염증의 1) 유도 IL-1β 프로모터 기반을 DsRed 기자 마우스에서 프라이밍의 측정, 형광 접합 된 항 Ly6G의 낮은 복용량으로 호중구의 2) 생체 표지로 단클론 항체, 3) 생체 내에 공 촛점 현미경 이미지. 이 세 가지 방법의 조합은 염증성 피부 병변에서 준비하는 호중구 (을 DsRed + / Ly6G +)의 운동성 활동의 시각화를 가능하게한다. 프라이머 작업 호중구의 이동 방향과 속도는 더 철새 경로 추적을 통해 정량화된다. 시간 경과 비디오 시리즈를 기록함으로써, 프라이밍 호중구 출현 실시간 동역학 I에 의해 염증성 사이트을 DsRed 발현 습득 모니터링ndividual 호중구는 혈관 외 공간에서 관찰된다. 따라서, 호중구 프라이밍의 동적 과정이 성공적으로 여기에 제시된 기술을 사용하여 처음으로 살아있는 동물에서 가시화되었다. 이 기술은 몇 가지 중요한 단계에서 사용된다. 먼저, 피부 조직을 생체 내에 이미징을위한 가장 편리한 신체 부위이다. 마우스 귀 OX의 국소 적용은 공 초점 현미경 아래에 염증이 피부의 면역 세포 행동의 직접 시각화 할 수 있습니다. 둘째, 마우스를 마취의 반복 주사를 필요로 촬영하는 동안 끊임없이 진정해야합니다. 그러나, 과도한 진정 작용 이미징 동안 마우스 다이의 원인이 될 수 있습니다. 과다 복용을 방지하기 위해 마취 (절반 또는 전체 용량의 세 번째)의 저용량 장기 이미징을 권장합니다. 셋째, 형광 공역 호중구 특정 단클론 의한 뮤린 호중구 (30 ~ 10 시간의 반감기)의 짧은 수명에 간헐적으로 주입한다. 마지막으로, 초점 박사IFT는 온도 변화, 마우스 본체의 움직임, 귀는 시간이 지남에 부종 및 장비 (31)의 동작에서 발생하는 진동 등의 여러 요인에 의해 발생 될 수 시간 경과 이미징 동안 큰 문제입니다. 몇 가지 방법이 진정으로 산소 및 온기를 제공하는 환경 챔버를 설치하는 단계에서 그 위에 유리 슬라이드 테이핑에 의해 제자리에 마우스 귀 고정 등 촬상 동안 진정의 일정 용량을 투여로, 리프팅을 방지하기 위해 개발되어왔다 유기체뿐만 아니라, 수동에 의해 다시 포커싱 범위를 필요 32,33. 이 프로토콜의 한계를 명시 똑같이 중요하다. 우선, 느린 마우스 복구 - 길이 촬상 기간을 8 시간 후 (12 ~ 16 시간)는이 프로토콜은 오랜 실험에 적합하지 않을 수 있음을 나타내는 인해 지속적인 진정으로 관찰된다. 다른 방법은 U보다는 촬상 기간 동안 순차적으로 여러 마우스를 사용하는하나의 노래. 둘째, 순환 FITC 덱스 트란 점진적 누출 가능성 염증 상태 (34)에 피부 혈관 투과성의 증가에 의해 발생되는 시간에 따른 촬상 동안 관찰된다. 따라서, 혈관의 시각화가 현저 촬상 이후 단계에서 순환 감소 형광을 주어 손상된다. 대안 적으로, 하나의 이러한 혈관 내피 세포 (35) 부착으로 혈관을 표시하는 등의 동종 렉틴 B4 같은 형광 공액 렉틴을 사용할 수있다. 염증성 피부 병변 호중구 프라이밍 프로세스의 시각화에 더하여, 여기에서 설명 된 기술은 다른 많은 실험 설정에서 적용될 수있다. 최근에 개발 된 이미징 윈도우와 함께, 준비하는 호중구의 행동을 서술 생체 내에 현미경 뇌, 유방 동맥, 폐, 복부 장기 36 ~ 39를 포함하여 깊은 조직 및 기관에서 평가 될 수있다. 프림의 또한, 시각화예컨대, 단핵구 및 대 식세포와 같은 다른 세포 유형 ING / 활성화를 통해 생체 표지와 함께 pIL1을 DsRed - 마우스를 사용하여 얻을 수있는 형광 - 공액 관심의 세포 유형에 특이 단클론 항체. 종합적뿐만 아니라이 기술은 살아있는 동물의 호중구의 프라이밍 처리의 생체 내에 이미징을위한 기본 틀을 제공 할뿐만 아니라 다른 조직에서 전개 각종 염증 상태의 다른 면역 세포의 동작 및 기능을 연구하기위한 새로운 접근 방법을 공개 않는다.

호중구는 순환에서 가장 풍부하고 단명 한 백혈구 수 있습니다. 그들은 신속하게 그들이 항균 펩타이드 및 단백질 분해 효소 1을 포함하는 과립과 함께 활성 산소와 질소 중간체의 출시를 통해 같은 전문 식세포를 제공 감염이나 부상의 사이트에 채용된다. 그들의 채용 동안 호중구 염증 (2)의 위치에 도착하면 현저하게 향상 식세포 기능의 결과로, 미생물 제품, 화학 유인 물질 및 염증성 사이토킨을 포함하는 다양한 에이전트 &quot;프라이밍&quot;된다. 호중구 프라이밍 메커니즘은 광범위하게 연구 시험 관내 3,4-되었다; 그러나, 생체 내에서 처리를 동적으로 모니터링은 현재까지 불가능 하였다. 최근 생체 내에 영상은 시각화 및 생물에 생물학적 과정의 세포 역학을 정량화하기위한 중요한 기술이되고있다. Intravi탈 촬상는 종래의 광자 현미경 여기를 통해 (예를 들어, 공 초점)을 수행하거나 다 광자 현미경 (5)에 접근 할 수있다. 시간이 지남에 상당한 개선이 증가 영상 해상도 개선 촬상 깊이를 가능하게이 기술에서 달성되어, 광 손상 조직, 향상된 이미지 안정화 -6,7- 감소. 시간이 지남에 따라 세포 마이그레이션 및 상호 작용의 동적 시각화를 가능하게하는 독특한 능력을 감안할 때, 생체 내에 현미경 광범위 면역학 8 연구의 다양한 분야에 적용되고있다. 생체 내에 영상은 더 잘 이해하고 동물 모델 생활에서 모두 세포 및 분자 수준에서 면역 반응을 상황화하는 면역 학자 수 있습니다. 최근 유전자 변형의 발전뿐만 아니라 노크에서 기자 마우스 등 살아있는 동물에서 호중구의 동적 행동을 모니터링하기위한 유용한 도구를 제공하고 있습니다. 라이소자임 M 프로모터 기반의 강화 된 녹색 형광 단백질 노크에서생쥐는 크게 넘쳐, 세균 감염 및 염증 멸균 9-15 포함한 다양한 염증 과정 동안 호중구, 단핵구 및 대 식세포의 운동성을 특성화하는데 사용되어왔다. 또한, 세포질 형광 공명 에너지 전달, 바이오 센서를 발현하는 형질 전환 마우스는 염증 부위 내에 16 호중구 세포 미토 겐 - 조절 키나아제 및 단백질 키나아제 A의 활동을 연구에 사용되었다. 호중구의 형광 발현 특이성을 가진 쥐 모델 자체 림프구 항원 6G (Ly6G) (17) 식으로 결합되는 형광 단백질 tdTomato,뿐만 아니라 Cre 호텔 재조합 효소를 생산시 Catchup 녹아웃 마우스이다. 이 모델을 통해 Ly6G 결핍 호중구의 시각화는 이러한 세포에서 멸균 또는 감염성 생체 내 염증 다양한 상황에서 정상적인 기능을 발휘 있음을 보여 주었다. 을 DsRed 형광 페이지를 발현하는 형질 전환 마우스호중구 염증 단핵구 활성화 대 식세포를 포함 할 것으로 - - (IL-1β) 프로모터 (pIL1-을 DsRed)는 IL-1β 생산 세포의 운동성 동작을 시각화하는데 이용 된 interleuikin-1β 마우스의 제어하에 유전자 rotein 신흥 염증이 피부 십팔인치 생체 내에서 라벨은 염증 조직에서 호중구의 세포 및 분자 행동을 추적하는 또 다른 방법이 될 수 있습니다. 안티 GR-1 단일 클론 항체 (단클론 항체) 라벨 형광의 낮은 용량의 정맥 주사, GR-1 + 호중구의 모집 캐스케이드 후 황색 포도상 구균 (19)에 감염된 마우스의 피부 병변에 가시화되고있다. streptavidin-를 포함하는 복합체의 생체 내 투여 결합 705 nm의 양자점과 바이오틴 안티 Ly6G 단클론 항체는 특히 순환 호중구 (20) 레이블을 붙입니다. neutroph에 이러한 접합체 또한, 엔도 시토 시스IL 소체는 간질로 이주 호중구 고속 소낭 수송의 추적을 허용한다. 생체 P- 셀렉틴 대 형광 복합 항체 αM 인테그린 리간드 -1 (PSGL-1), L 셀렉틴 (CD62L)을 당 단백질로 표지 (는 CD11b를 TNFα에 의한 염증 모델)과 케모카인 (CXC 모티브) 수용체 2 (CXCR2)는 초기 염증 21시 놀이 규제 메커니즘을 해명했다. 편광 호중구는 CD11b를하고 CXCR2, 호중구의 이동을 유도하고 염증을 시작 수용체의 재분배 결과, 활성화 된 혈소판에서 CD62L 존재와 상호 작용하는 uropods을 PSGL-1이 풍부한 돌출. IL-1β는 준비하는 호중구 (22)에 상승 서명 유전자 중 하나입니다. pIL1-을 DsRed 기자 마우스에서,을 DsRed 형광 신호 (예., IL-1β의 프로모터의 활성화) 긍정적으로 mRNA 발현과 IL-1β 단백질 생산 IL-1β와 상관 관계. &lt;SUP&gt; 18 호중구 프라이밍의 프로세스를 모니터링하기 위해, 생체 내에 현미경 방법은 형광 접합 된 항 Ly6G 단클론 항체와 호중구의 생체 표지 다음 pIL1-을 DsRed 마우스 모델에서 옥사 졸론 (OX)와 피부 염증의 유도를 포함하는 개발되었다. 이 모델을 통해 다양한 질병과 질환의 동물 모델에서 호중구 뇌관의 동작 및 기능을 연구 할 수있다.

<table>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Heparin sodium</td>
			<td style="width:165px;">APP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:139px;">NDC 63323-540-31</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">ACK lysing buffer</td>
			<td style="width:165px;">Lonza</td>
			<td style="width:139px;">10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:165px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Lipopolysaccharides</td>
			<td style="width:165px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">L4391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">Ketamine hydrochloride</td>
			<td style="width:165px;">Hospira</td>
			<td style="width:139px;">NDC 0409-2051-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylazine</td>
			<td style="width:165px;">LLOYD Laboratory</td>
			<td style="width:139px;">NADA #139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acepromazine</td>
			<td style="width:165px;">Boehringer Ingelheim</td>
			<td style="width:139px;">ANADA 200-361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hair-removal cream</td>
			<td style="width:165px;">Church &#38; Dwight</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetone</td>
			<td style="width:165px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">A16P4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxazolone</td>
			<td style="width:165px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">E0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:196px;">Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td style="width:139px;">127610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:196px;">U-100 insulin syringe with 28 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:196px;">FITC-CM-Dextran, 150 Kda</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">74817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:196px;">Butterfly infusion set (27 G needle)</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:139px;">387312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACSCalibur cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellQuest Pro software</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metamorph Software</td>
			<td>Universal Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital imaging of neutrophil priming using il-1&#946; promoter-driven dsred reporter mice

호중구는 인간의 혈액 순환에서 가장 풍부한 백혈구하고 신속하게 염증 사이트에 채용된다. 초벌은 중성 백혈구의 식세포 기능을 향상시키는 중요한 이벤트입니다. 광범위한 연구는 감염과 부상 중에 존재와 호중구 프라이밍의 중요성을 발표했지만, 사용할 수 있었다 생체 내에서이 과정을 시각화의 의미합니다. 형광 접합 된 항 - 림프구 항원을 주입함으로써 달성 - 2) 생체 호중구 라벨링 프라이밍의 척도로 사용 - 1)을 DsRed 리포터 신호는 제공된 프로토콜은 세 가지 방법을 조합함으로써 살아있는 동물에서 프라이밍 호중구의 동적 프로세스의 모니터링을 가능하게 6G (Ly6G) 단일 클론 항체 (단클론 항체), 3) 생체 내에 공 촛점 이미징. 몇 가지 중요한 단계는이 프로토콜에 관련된 : 옥사 졸론 유발 마우스 귀 피부 염증, 동물의 적절한 진정 작용, 항 Ly6G 단클론 항체의 반복 주사 및 이전을촬영시 초점 드리프트의 ention. 몇 가지 제한이 그러한 한 마우스에서의 연속 촬영 시간 (~ 8 시간)의 한계 및 형광 염료 덱스 트란 염증 상태의 혈관에서의 누설로 관찰되었지만,이 프로토콜의 생체 내에 이미징을위한 기본 틀을 제공한다 쉽게 마우스 염증 모델에서 다른 면역 세포의 검토로 확장 될 수 프라임 호중구 동작 및 기능.

pIL1-을 DsRed 마우스의 선별은 유세포 분석기를 사용하여 말초 혈 백혈구에 의해 생산 된 표현형을 DsRed 형광 신호에 기초하여 수행된다. LPS 자극은 호중구, 단구, 수상 세포 및 26-28을 포함하여 골수 세포에서 IL-1β 생산을 유도하는 것으로 알려져있다. 따라서, 고립 된 백혈구 분석 유동 세포 계측법하기 전에 4 시간 동안 LPS와 함께 배양한다. 다음으로, 게이트는이 게이트 인구 측정 셀 사이즈 (FSC) 내부 복잡성 (SSC) (도 1A) 29을 DsRed 및 신호에 기초하여 골수 세포를 순환 설정된다. pIL1-을 DsRed 마우스에서 같은 세포가 구별을 DsRed 신호 (그림 1B)를 표현하면서 WT 생쥐에서 순환 골수 세포는 최소한으로,을 DsRed을 표현한다. 표현형이 방법에 의해 확인 된 pIL1-을 DsRed 마우스 후속 실험에 사용된다. 완전한 표현형 프로세스가 몇 소요 주목해야한다시간 - 조직 수확, 소화 효소, DNA 분리, PCR과 전기 영동을 포함한 기존의 유전자형 방법보다 훨씬 짧다. IL-1β의 프로모터 활성화는 최근 호중구의 마커 (22)를 프라이밍로 확인되었습니다. 따라서, 호중구 프라이밍의 동적 프로세스를 가시화하고 pIL1-을 DsRed 마우스를 사용하여 살아있는 동물에서 평가 될 수있다. 피부 염증을 유도하는, 피부 증감 OX 국소 단독 같은 동물의 왼쪽 귀에인가 pIL1-을 DsRed 마우스 및 차량 우측 귀에인가된다. 살아있는 동물의 호중구 라벨을, 최근에 개발 된 프로토콜이 작은 직전 형광 표지 항 Ly6G 단클론 항체 량 OX 애플리케이션 후 8 시간을 투여함으로써 수행된다. 혈관을 찾으려면, FITC-덱스 트란은 촬영 직전에 주입된다. OX 애플리케이션, 후 24 시간에서을 DsRed 많은 수의 + / Ly6G + 셀 혈관 외 공간 (그림 2A)에서 발견되고 호중구를 뇌관을 나타냅니다. 소수을 DsRed / Ly6G + 세포는 대부분 휴식 호중구를 대표하는 발견된다. 더욱이을 DsRed + / Ly6G 작은 집단 - 세포가 관찰되는 염증성 단핵구 및 대 식세포 활성화를 포함 할 수있다. 40 분 시간 경과 비디오에서 염증성 피부 병변 내에서 신흥 Ly6G + 호중구는 전형적인 아메바 같은 크롤링 운동 (보충 영화 1)을 나타낸다. / Ly6G + 호중구 인구 (그림 2B) - 셀 철새 경로는을 DsRed + / Ly6G + 및을 DsRed이의 운동성 행동을 비교하기 위해 추적됩니다. 트랙 플롯은 세포 외 공간 (그림 2C)를 입력 한 후 모두 호중구 인구를 표시하는 것이 &quot;임의의&quot;마이그레이션을 공개 분석한다. 재미있게,/ Ly6G + 대응 (그림 2D) - 자신을 DsRed와 비교을 DsRed + / Ly6G + 호중구 전시 상당히 높은 속도. 이 염증성 병변에서 호중구 프라이밍과 가속 운동 사이의 관계를 의미한다. OX 처리 (- 4 보충 영화 2) 다음과 같은 서로 다른 시간에 시작 기록 된 호중구 프라이밍, 시간 경과 비디오의 일련의 타이밍을 모니터링 할 수 있습니다. 을 DsRed는 - OX 신청 후 12 시간과 번호는 (그림 2E, 기업 영화 3, 4) 이후 상대적으로 낮게 유지 - / Ly6G + 세포, 휴식의 호중구는 빠르면 8과 혈관 외 공간에서 검출된다. OX 애플리케이션 후 16 시간 - 반대로을 DsRed + / Ly6G + 세포 수는 프라임 호중구 14에서 시작하여, 이후의 시점에서 점진적으로 증가한다. 일부을 DsRed <s최대&gt; - / Ly6G + 세포는 점차적으로이 기간 (그림 2 층, 보충 영화 5) 동안 혈관 외 공간으로 채용 후을 DsRed 신호를 획득. 16 - 20 시간의 혈관 외 Ly6G +의 호중구의 대부분은 자신을 DsRed 표현에 따라 &quot;끝났다&quot;로 간주됩니다. 이러한 관찰은 살아있는 동물에서 염증성 병변에서 발생하는 호중구 프라이밍의 크기, 템포, 및 위치를 알 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54070/54070fig1.jpg" /> 그림 1 :. pIL1-을 DsRed 마우스의 표현형 (A) 세포 계측법 흐름은 FSC와 SSC 매개 변수를 기반으로 골수 세포 (G1)를 순환의 인구를 보여 분석한다. FL2 채널에서 (B) 히스토그램을 DsRed PIL - 마우스 (레드)에서 세포의 G1 게이트 내에는 DsRed + 세포의 백분율을 표시하거나 WT 마우스에서 (청색). 데이터 르의 대표3 개의 독립적 인 실험 AST. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54070/54070fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54070/54070fig2.jpg" /> 그림 2 :. 염증성 피부 병변을 DsRed + / Ly6G + 호중구의 운동성 활동의 시각화 (A) 정적 공 초점 현미경 이미지 즉, 혈관 외 공간에서 OX 치료 쇼 후 3 백혈구 인구를 24 시간을 기록을 DsRed + / Ly6G + 세포를. (별표)을 DsRed - / Ly6G + 세포 (삼각형), 및을 DsRed + / Ly6G - 세포 (화살표). 바 = 20 μm의. 을 DsRed가 + / Ly6G + 세포 (적색)과을 DsRed - / Ly6G + 세포 (파란색) migrato에 대한 비교OX 응용 프로그램 (보충 영화 1) 후 24 시간을 시작 공 초점 현미경으로 촬영 한 40 분 시간 경과 영화에서 공예 경로 (B), 트랙 플롯 (C) 및 속도 (D). (D) 바 속도 값을 의미 나타냅니다. *** P &lt;0.001. (E)을 DsRed + / Ly6G + 세포의 숫자을 DsRed - / Ly6G + 세포 OX 응용 프로그램 (보충 영화 4까지 2) 후 다른 시간 지점에서 기록 된 시간 경과 영화의 시리즈에서 계산됩니다. 표시된 데이터는 세 개의 연속 된 이미지로부터 계산 된 세포 수 / mm 2 (± SD 수단)이다. (F) 정적 이미지는 OX 그림 (보충 영화 5) 후 14.5 시간에 11에서 기록 된 시간 경과 영화에서 만들어집니다. 화살표는 관찰 기간 동안 혈관 외 공간을 DsRed 식을 취득하는 Ly6G + 세포를 나타낸다.바 = 50 μm의. 이미지가 권한 (저작권 2015 년 면역학의 미국 협회, 사)와 참조 (22)에서 재생된다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54070/54070fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> . 기업 영화 1 : - / Ly6G + 세포 (파란색)에서 (OX 그림 후 24 시간에서) 염증성 피부 병변을 DsRed + 호중구의 운동성 행동 공 초점 현미경 영상을 DsRed + / Ly6G + 세포 (분홍색)과을 DsRed의 운동성을 보여 혈관 외 공간. 혈관이 녹색으로 볼 수 있습니다. 바 = 20 μm의. 비디오가 권한 (저작권 2015 년 면역학의 미국 협회, 사)와 참조 (22)에서 재생됩니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54070/54070video1.mov" target="_blank">카스티하세요</a>이 비디오를 보려면 여기를 ICK. . 보충 영화 2 : - 혈관 외 공간에서 / Ly6G + 세포 (파란색) (OX 그림 후 4 시간에서) 염증성 피부 병변을 DsRed + 호중구의 운동성 행동 공 초점 현미경 영상을 DsRed + / Ly6G + 세포 (분홍색)과을 DsRed을 보여 . 혈관이 녹색으로 볼 수 있습니다. 자기 형광은 현재와 모낭과 관련된 것입니다. 바 = 100 μm의. 비디오가 권한 (저작권 2015 년 면역학의 미국 협회, 사)와 참조 (22)에서 재생된다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54070/54070video2.mov" target="_blank">이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 보충 영화 3 : Inf를에을 DsRed + 호중구의 운동성 행동. 혈관 외 공간에서 / Ly6G + 세포 (파란색) - lammatory 피부 병변은 (OX 그림 후 8 시간에서) 공 초점 현미경 이미지 (분홍색)을 DsRed + / Ly6G + 셀을 DsRed을 보여줍니다. 혈관이 녹색으로 볼 수 있습니다. 자기 형광은 현재와 모낭과 관련된 것입니다. 바 = 100 μm의. 비디오가 권한 (저작권 2015 년 면역학의 미국 협회, 사)와 참조 (22)에서 재생된다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54070/54070video3.mov" target="_blank">이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 보충 영화 4 : 운동성 염증성 피부 병변을 DsRed + 호중구의 행동 (11시 - OX 그림 후 19 시간) 공 초점 현미경 이미지 (핑크)을 DsRed + / Ly6G + 세포를 보여을 DsRed -에서 / Ly6G + 세포 (파란색). extravascular 공간. 혈관이 녹색으로 볼 수 있습니다. 자기 형광은 현재와 모낭과 관련된 것입니다. 바 = 100 μm의. 비디오가 권한 (저작권 2015 년 면역학의 미국 협회, 사)와 참조 (22)에서 재생된다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54070/54070video4.mov" target="_blank">이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 기업 영화 5 Ly6G + 호중구을 DsRed 신호 획득이 고배율 비디오 (화살표로 표시) Ly6G + 세포가 혈관 외에을 DsRed 식을 취득하는 프로세스를 도시 기업 비디오 4에 도시 된 시간 경과 영화에서. 관찰 기간 (OX 그림 후 11-14.5 시간) 동안 공간. 바 = 50 μm의. 비디오는 권한 (저작권 2015 년 필자의 미국 협회 기준 22 재생munologists, 주식 회사). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54070/54070video5.mov" target="_blank">이 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

IL-1β의 발기인 기반을 DsRed 기자 마우스를 사용 호중구 초벌의 생체 내에 영상

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

intravital-imaging-neutrophil-priming-using-il-1-promoter-driven

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K 조회수.  University of Toledo College of Medicine and Life Sciences. This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals. 

비디오: Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

연구

면역학 및 감염병학

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

CXCR6.Gfp 기자 마우스를 사용하여 건강하고 병에 걸린 간에서 면역 세포의 장기 생체 내에 다중 광자 현미경 이미징

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

기자 마우스를 사용하여 IL-22 발현 림프구의 시각화

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

호중구 Phagosome 이미징 및 세포질은 비례의 pH 표시기를 사용하여

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

기자 효소 형광와 쥐에서 이미징 결핵균

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

영상 셀 상호 작용 Tracheal 점 막에서 2 광자 Intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...