우리는 교수 빈 첸, 닥터 유 장, 및 Kendy Hoang electroporation 시스템을 설정 하는 방법에 대 한 감사. 이 작품은 Z.A.W.에 산타 크루즈 암 혜택 그룹 및 NIH에서 교부 금에 의해 지원 되었다

여기에서 설명한 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 캘리포니아 대학 산타 크루즈의 지침에 따라 수행 했다.
1. 플라스 미드 및 도구 준비
<ol><li>각 방광 transfect에 대 한 DNA 플라스 미드 (1 µ g / µ L)의 적어도 20 µ L를 준비 합니다.</li>
	<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 플라스 미드 솔루션의 20 µ L을 Trypan 블루의 1 µ L를 추가 합니다. 잘 섞어 피 펫입니다.</li>
	<li>압력솥에 모든 수술 장비 및 작업 영역 70% 에탄올으로 소독. 자주 수술 기구와 장갑 70% 에탄올 스프레이 또는 무 균 상태를 유지 하기 위해 다음 단계를 수행할 때 유리 구슬 소독 기를 사용.</li>
</ol>2. 동물 anaesthetizing
<ol><li>테이블 상단 마 취 시스템을 사용 하 여 anesthetize isoflurane와 동물. O2 탱크를 켜고 1 L/min에 산소 유량을 조정.</li>
	<li>유도 실에서 성인 여성 C57BL/6J 마우스를 놓습니다. 설정 하 고 유도 3 %isoflurane 기화 기를 조정 합니다. 마우스 선제 무 통 유도 챔버에서 마우스의 제거에 따라 피하 마 취 2 분 관리 buprenorphine 진통제 (0.1 mg/kg) 이내에 있어야 한다. 참고:이 프로토콜에서 여성 쥐로 사용 됩니다, 그들은 요도 도관 법 동안에 함께 작동 하도록 쉽습니다. 프로토콜 또한 남성 마우스 작동 하지만 여분의 주의 3 단계를 수행할 때 필요 하다.</li>
	<li>건조를 방지 하기 위해 동물의 눈에 안과 연 고를 적용 합니다. 코 콘에 그것의 코를 가진 난방 패드에 향하도록 anaesthetized 마우스를 놓습니다. 공기 회로 스위치 isoflurane 코 콘을 통과 하도록 설정 합니다.</li>
	<li>머리와 접착 테이프로 코 콘 제 지. 유지 보수에 대 한 2 %isoflurane 기화 기를 조정 합니다.</li>
	<li>접착 테이프를 가진 사지를 제 지. 동물과 깊은 마 취에 복 부 영역을 면도 되도록 발가락-핀치 테스트를 수행 합니다.</li>
</ol>3. 소변 고갈 및 방광 세 정
<ol><li>카 테 터 (24 G, 2.11 c m의 길이, 0.045 cm의 외부 직경)에 윤활제를 적용 하 고 그것의 외부 표면 완전히 덮여 확인 합니다.</li>
	<li>요도 오프닝으로 카 테 터를 삽입 하 고 이때 소변 카 테 터를 통해 밖으로 흘러 한다 방광에 도달할 때까지 천천히 그것을 밀어. 부드럽게 소변 고갈 수 있도록 복 부를 누릅니다.<ol>
<li>카 테 터 삽입 됩니다 올바르게 방광에 자동 소변 흐름 밖을 관찰 하 여 확인 하십시오. 요도 방광 벽을 피어 싱을 방지 하 고 필요한 경우 윤 활 유를 여러 번 적용.</li>
	</ol>
</li>
	<li>폐기물 비 커에는 피 펫으로 소변을 삭제 합니다.</li>
	<li>방광에 여전히 다른 끝으로 카 테 터의 외부 끝에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 80 µ L 플라스틱. 신중 하 게 카 테 터를 1 mL 주사기를 연결 합니다. 부드럽게 PBS을 방광에 주입 하는 주사기를 밀어. 방광에 공기 방울을 만드는 피하기 위해 카 테 터에 일부 PBS를 남겨 주세요.</li>
	<li>주사기를 제거 합니다. PBS는 방광에서 배수를 기다립니다. 부드럽게 복 부 PBS 대피를 누릅니다.</li>
	<li>폐기물 비 커에는 피 펫으로 카 테 터에 PBS를 삭제 합니다.</li>
	<li>PBS (단계 3.4-3.6) 세척 두 번 더 반복 합니다. 참고: 이러한 세척 단계 동안 부드럽게 작동에 필수적입니다. 카 테 터 또는 자동의 실패에 피가 밖으로 액체의 흐름 일반적으로 요도 통해 피어 싱을 나타냅니다. 그들은 electroporation 효율성을 줄일 것으로 소개 하는 공기 방울을 피하기 위해 중요 한 이기도 합니다.</li>
</ol>4. 플라스 미드 배달
<ol><li>마우스 복 부에 70% 에탄올을 적용 하 고 메스를 사용 하 여 방광 위의 복 부 피부 열을 1 cm의 수직 절 개를 하 게.</li>
	<li>플라스 미드 플러스 Trypan 블루 솔루션의 적어도 20 µ L, 카 테 터의 외부 끝에 플라스틱 하 고 주사기를 연결 합니다.</li>
	<li>방광에 플라스 미드 솔루션을 삽입할. 방광 파란색 경우, 주사에 성공한 것입니다. 방광에 공기 방울을 만드는 피하기 위해 카 테 터에 어떤 액체를 남겨 주세요.</li>
	<li>핀셋을 사용 하 여 외부 요도 구멍을 카 테 터와 주사기를 제거. 문자열을 사용 하 여 외부 요도 구멍을 조여. 문자열 두 개의 루프를 확인 하 고 두 개의 매듭으로 묶어. 참고:이 요도의 강화 플라스 미드 액체의 역류를 방지 하기 위한 중요 합니다.</li>
	<li>다음 매개 변수 electroporation 발전기 설정: 33V, 작업 시간과 950 간격 시간 50 ms.</li>
	<li>핀셋으로 방광을 누른 두 전극으로 방광을 꼬집어. 수행은 electroporation에 발 페달을 밀어. 참고: 전기 펄스 각 페달 푸시 후 5 번 짧은 간격으로 발생 하도록 설정 됩니다. 마우스는이 과정에는 트 위치 수 있습니다. 발 페달을 여러 번 추진 전달 효율을 높일 수 있습니다 하지만 너무 많은 전기 펄스는 urothelium의 조직의 무결성을 손상 시킬 수 있습니다.<ol>
<li>불꽃 생성 됩니다 핀셋과 전극, 사이 어떤 접촉을 든 지 피하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5입니다. 복구
<ol><li>무 균 수술 봉합 및 클립 복 부와 피부 열기 봉합 요오드는 상처에 적용 됩니다.</li>
	<li>Isoflurane 시스템에서 동물을 제거 합니다. 수술 후 통증을 완화 시키기 위해 피하 buprenorphine 진통제 (0.1 mg/kg)를 관리 합니다.</li>
	<li>난방 패드에 동물을 유지 하 고 전체 복구 후 홈 케이지 돌아갑니다. 적어도 한 번 매일 정상적인 이동성, 음주와 절 개 치유 되 고 다음 클립 제거 될 때까지 동작 및 감염의 흔적을 먹이 대 한 동물을 확인 하십시오. 동물 손질, 공격 성, 그리고 발성 증가 감소와 같은 통증 증상을 표시 하는 경우 후속 buprenorphine 진통제 주사를 관리 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mighty+mouse:+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development.">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li><li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).</li><li>Yarmush, M. 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(6), e239 (2007).</li><li>Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+lentiviral+vectors.">Immune responses to lentiviral vectors.</a> Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).</li></ol>

저자는 경쟁 관심을 선언합니다.

Electroporation 세포 막 침투성을 강화 하 고 유전자 electrotransfer16에 대 한 강력한 기술 이다. Electroporation에 의해 생활 설치류에 유전자 배달 신경 생물학 분야17,,1819,20,21에 자주 사용 되었습니다. 다른 많은 기관에 그것의 잠재적인 응용 프로그램 광범위 하 게 탐험 하지는. 우리의 지식, 우리의 여기 설명 된 방법은 방광 urothelium electroporation에 의해 성공적인 유전자 배달의 첫 번째 보고서입니다. 그것은 아 데 노 바이러스/lentivirus 기반 감염 방법에 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, electroporation 메서드, 더 안전한, 쉽고 저렴 비 바이러스 성 유전자 벡터 사용 되 고 특정 기관 사이트에 비보에 플라스 미드 DNA의 납품은 비교적 간단 하기 때문에 채택 하는. 둘째, 그것은 종종 바이러스 벡터22납품과 관련 된 바람직하지 않은 호스트 면역 응답을 피 한다. 셋째, 방광, 경우 그것은 일반적으로 차단 하는 urothelial 세포에 바이러스 바인딩 glycosaminoglycan 레이어의 화학적 전처리에 대 한 필요성을 부정 합니다.
이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 도관 법, 세 정, 및 플라스 미드 주입. 카 테 터 삽입을 수행할 때 요도 나 방광 벽을 통해 피어스 하지 않습니다 보장 하기 위해 필요한 여분 배려 및 부드러운 처리 및 주사기 연결/제거. 완전히 외부 커버에 충분 한 윤활제를 적용 테의 표면도 필수적 이다. 실패의 또 다른 원인 때문에 전기 전도도 줄어 헹 구 고 플라스 미드 주입 하는 동안 방광에 공기 방울의 소개입니다. 이러한 문제를 방지 하려면 이러한 단계를 수행할 때 항상 테에 어떤 액체를 떠나 하는 것이 좋습니다.
우리 젊은 (2 개월) 및 이전 (1 년) 쥐 사이 배달 효율에 차이 관찰 하지 않았다 때문에 우리의 프로토콜은 모든 나이의 성인 쥐에 대 한 작동 합니다. 여러 가지 요인 플라스 미드 배달 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다. 낮은 금액 수 있습니다 충분히 다루지 방광의 내부 표면으로 주입에 대 한 최소 볼륨으로 플라스 미드의 20 µ L이 좋습니다. 일반적으로 플라스 미드 볼륨 및 농도 증가 더 높은 침투 하지만 추가 이점이 없습니다 넘어 60 µ L. 더 많은 전기 펄스를 주는 볼륨에 대 한 관찰 되었다 사용할 수 있고 해야한다 전극 가진 방광의 다른 표면 영역을만 지는 전달 효율 향상에 가장 큰 영향을 미칩니다. 이 프로토콜에서 설명 electroporation 매개 변수 때문에 더 높은 전압 세포 죽음을 유도 하는 경향이 조직의 무결성을 유지 하면서 urothelial 세포의 permeabilization를 허용 하도록 설정 됩니다. 그것은 추가 최적화에 대 한 이러한 매개 변수를 조정할 수 있습니다. 마우스-마우스 변형 및 연구원의 처리 효율성을 크게 달라질 수 있습니다. 프로젝트의 목표에 따라 각 특정 실험에 대 한 최고의 매개 변수를 결정 하는 실험을 수행 하는 것이 좋습니다. 예를 들어 암 개시와 클론 성장 모델링, 낮은 침투를 원하는 수 있습니다.
원칙으로 서 증거-의-우리의 전달 방법에 대 한, GFP 식 36 h 이르면 electroporation, 후 방광에 구상 될 수 있다 하 고 적어도 2 주 동안 유지할 수 있습니다. 이 새로운 방법으로 신속 하 고 저렴 하 게 유전자 overexpression 또는 다운 레 귤 레이 션 및 게놈 편집과 마우스 방광을 DNA 플라스 미드를 제공할 수는 지금. 그것은 소설 autochthonous 방광 암 모델 건물 뿐만 아니라 방광 개발을 연구 하 고 질병, 새로운도 연다.

유전자 조작된 마우스 모델 (GEMMs) 동물 개발, 유전자 기능에서 vivo에서및 질병 진행1,2의 메커니즘에 대 한 우리의 지식을 확장에 필수적인 역할을 연주 하고있다. 생식 GEMMs는 전통적으로 두 가지 방법으로 개발 됩니다. 첫 번째 pseudopregnant 여성에 zygotes의 이식 뒤 DNA 플라스 미드의 pronuclear를 주입 하 여 유전자 변형 생쥐의 창조 이다. 다른 노크-아웃/노크-에서 생쥐 배아 줄기 세포에서 동종 재결합에 의해의 생성 및 키메라의 개발 이다. 특정 조직 또는 세포 유형의 관심 있는 유전자의 조건부 녹아웃 포함 여러 세대에 대 한 Cre flox 사이트와 대립 유전자 조작된 유전자의 번 식을 한다. 전체 프로세스는 비싸고 시간이 많이 걸리는, 목표는 조직 특히 여러 유전자를 대상으로 하는 경우에 특히 될 수 있습니다. 최근, 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 같은 유전자 편집 기술 학위 암3, 모델링에 대 한 조직의 특정 유전 변경 유도를 쥐의 여러 장기에 적용 된 4,5,,67 또는 정확한 병 변이 라8, 에서9. 이러한 연구에서 gRNA 벡터의 전달 기관 또는 유체역학 꼬리 정 맥 주입의 adenoviral 또는 lentiviral 감염을 통해 일반적으로 달성 되었다. 폐와 간 CRISPR 부품의 납품의 상대적 용이성은 편리 하 고 암 전통적인 Cre Lox 기반 마우스 모델에 비해 이러한 기관에서 모델링의 효율성에 크게 향상 됩니다.
방광 urothelium 대부분 방광 종양의 발원지 이다. 암 모델링 이나 유전자 치료에 대 한 방광 urothelium DNA 벡터의 배달 glycosaminoglycan 레이어 전염 성 바이러스10,11의 준수에 대 한 장벽 역할 꼭대기 urothelial 표면에 의해 방해 된다. Syn3 라우릴-β-d-maltoside 등 여러 가지 전처리 에이전트 하이 배리어를 중단 하 고 아 데 노비 루스 감염 효율12,,1314강화 사용 되었습니다. Adeno 관련 바이러스 (AAVs) 효과적으로 방광을 감염 수 있습니다 여부 하지 보고 되었습니다. 전반적으로, 비 바이러스 성 기반된 전달 방법 바람직한 것입니다. 여기는 요도 도관 법 및 electroporation 통해 마우스 urothelium 효율적인 DNA 플라스 미드 배달 위한 실험실에서 개발 된 새로운 방법에 설명 합니다. 우리의 접근 glycosaminoglycan 레이어 또는 바이러스 생산의 화학 전처리를 포함 하지 않습니다, 때문에 그것은 크게 마우스 방광 urothelium로 DNA 플라스 미드의 납품을 간소화 하 고 다양 한 생체 내에서 연구를 촉진 해야 방광 질환의.

<table><tbody><tr><td>BD 1mL TB Syringe</td><td>Fisher</td><td>148232E</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Sigma</td><td>B9275-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Tweezers</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5005</td><td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td></tr><tr><td>ECM830 SQ Wave Electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-21</td><td>24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter</td></tr><tr><td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5135</td><td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet one</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>K&amp;amp;H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>Cover the heat mat with paper towels</td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment</td><td>Fisher</td><td>NC0849514</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips 200 &amp;micro;L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 &amp;micro;L</td><td>Fisher</td><td>02707438(CS)</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P2</td><td>Gilson</td><td>F144561</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P200N</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>plasmid CAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>16664</td><td></td></tr><tr><td>Platinum tweezertrode 5 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450489</td><td>5 mm diameter</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5880</td><td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td></tr><tr><td>String cord</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord</td></tr><tr><td>Tape, Scotch</td><td>Fisher</td><td>19047257</td><td></td></tr><tr><td>Therio-gel Veterinary Lubricant</td><td>PBS animal health</td><td>353-736</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>V-1 Table top system anesthesia</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl violet suture 18&quot; FS-2 cutting 5-0</td><td>Fisher</td><td>NC0578475</td><td></td></tr><tr><td>Walgreens Povidone Iodine 10%</td><td>Walgreens</td><td>953982</td><td></td></tr><tr><td>Wound clip</td><td>Fisher</td><td>018045</td><td></td></tr><tr><td>Wound clip applier</td><td>Fisher</td><td>01804</td><td></td></tr></tbody></table>

novel method of plasmid dna delivery to mouse bladder urothelium by electroporation

유전자 조작된 마우스 모델 (GEMMs)은 암과 같은 인간의 질병의 개시 그리고 진행 성 메커니즘에 새로운 생물 학적 통찰력을 공개에 매우 중요 합니다. 유전자 변형 및 조건부 녹아웃 쥐 유전자 overexpression 자주 사용 되었습니다 또는 특정 조직 또는 세포 제거에 비보유형. 그러나, 생식 마우스 모델 생성 시간과 비용이 많이 드는 수 있습니다. 최근 발전 기술과 DNA 플라스 미드 바이러스 성 감염에 의해 제공의 타당성을 편집 진에 여러 장기에 대 한 비 생식 autochthonous 마우스 암 모델의 빠른 생성을 활성화 했습니다. 방광 액세스, 취재는 urothelium glycosaminoglycan 계층의 존재 때문에 바이러스 성 벡터에 대 한 어려운 되었습니다 기관 이다. 여기, 우리가 마우스 방광 urothelium 비보에 플라스 미드 DNA의 효율적인 배달에 대 한 실험실에서 개발 된 새로운 방법을 설명 합니다. PCAG-GFP DNA 플라스 미드의 intravesical 주입 및 수술 노출된 방광의 electroporation를 통해 우리는 DNA 플라스 미드 방광 urothelial 셀 과도 식으로 구체적으로 전달 될 수 있습니다 보여줍니다. 우리의 방법은 overexpression 및 마우스 방광에 유전자의 최저 신속 하 고 편리한 방법 이며 방광 암 및 다른 비뇨기과 질환의 GEMMs를 건물에 적용할 수 있습니다.

설명 하기 위해 방광 urothelium로 유전자 배달의 성공, 우리 electroporation pCAG GFP15 플라스 미드 사용. 20 µ L 플라스 미드 및 Trypan 블루 솔루션의 요도 통해 주입 했다 그리고 5 전기 펄스 관리 되었다. 48 h 후 마우스 방광을 해 부 하 고 부정적인 electroporation 보여주었다 (그림 1A) GFP 신호를 받아야 하지 않았다 방광을 제어 하는 반면 해 부 형광 현미경 GFP 형광의 패치를 관찰. 우리 면역 형광 염색 sectioned 방광 조직 cytokeratin (CK) 5, CK18의 수행 될 때 GFP 항 체, 우리는 찾았지만 GFP 우산, 중간, 존재 하 고 기저 세포 신호는 근육 안에 레이어 (그림 1B), 그리고 플라스 미드는 urothelium에 배달의 좋은 특이성을 나타내는. Urothelial 셀의 약 15%는 GFP+, 그리고 같은 클론 자연 암 종양은 일반적으로 개별 셀에서 시작 하는 때문에, 모델링에 적합 해야 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57649/57649fig1.jpg"> 그림 1: 마우스 방광 urothelium pCAG GFP 플라스 미드의 성공적인 납품. (A) (오른쪽) (왼쪽) 그 electroporation 성공적으로 녹색으로 켜져 방광 보여주는 부정적인 제어 방광을 electroporation 수술 방광의 비교. (B) 면역 형광 sectioned 방광 조직 우산에 GFP+ 세포의 모자이크 식 패턴을 보여주는의 얼룩 (CK18+), 중간 (CK5+CK18+), 그리고 기저 (CK5+) urothelial 레이어. 눈금 막대에 에서 해당 1 m m, b에서 50 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57649/57649fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

마우스 방광에서 vivo에서 요도 도관 법 및 electroporation 통해의 urothelial 세포로 DNA 플라스 미드의 배달에 대 한 새로운 방법을 설명합니다. 그것은 방광 질환의 학위 마우스 모델을 생성 하기 위한 신속 하 고 편리한 방법을 제공 합니다.

새로운 방식의 마우스 방광 Urothelium Electroporation에 의해 플라스 미드 DNA 전달

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.4K 조회수.  University of California, Santa Cruz. 마우스 방광에서 vivo에서 요도 도관 법 및 electroporation 통해의 urothelial 세포로 DNA 플라스 미드의 배달에 대 한 새로운 방법을 설명합니다. 그것은 방광 질환의 학위 마우스 모델을 생성 하기 위한 신속 하 고 편리한 방법을 제공 합니다.

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Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

연구

신경과학

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

유전자 전달 연구 동소 방광암 모델

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

의학

Neonatal Pial Surface Electroporation

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and gliogenesis, including after injury. However, methods for genetically interrogating these progenitor populations and tracking their lineages had been limited owing to a lack of specificity or time consuming production of viruses. Thus, progress in this region has been relatively slow with only a handful of investigations of this location. Electroporation has been used for over a decade to study neural stem cell properties in the embryo, and more recently in the postnatal brain. Here we describe an efficient, rapid, and simple technique for the genetic manipulation of pial surface progenitors based on an adapted electroporation approach. Pial surface electroporation allows for facile genetic labeling and manipulation of these progenitors, thus representing a time-saving and economical approach for studying these cells.

The pial surface is a unique progenitor zone in the CNS that is receiving increasing attention. Herein, we detail a method for rapid genetic manipulation of this progenitor zone using a modified electroporation method. This procedure can be used for cellular and molecular investigations of cell lineages and signaling pathways involved in cell differentiation and to elucidate the fate and properties of daughter cells.

신생아 Pial 표면 에레

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

마우스 고환의 생체 내 미세 주입 및 Electroporation에에서

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

생물학

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

플라스미드 DNA를 마우스 골격근으로 전기천공

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense and transmit information about its environment to the underlying tissues, promoting voiding function and behavior. Disruption of the urothelial barrier, or its sensory/transducer function, can lead to disease. Studying these complex events is hampered by lack of simple strategies to alter gene and protein expression in the urothelium. Methods are described here that allow investigators to generate large amounts of high-titer adenovirus, which can then be used to transduce rodent urothelium with high efficiency, and in a relatively straightforward manner. Both cDNAs and small interfering RNAs can be expressed using adenoviral transduction, and the impact of transgene expression on urothelial function can be assessed 12 h to several days later. These methods have broad applicability to studies of normal and abnormal urothelial biology using mouse or rat animal models.

Methods are described for the generation of large amounts of recombinant adenoviruses, which can then be used to transduce the native rodent urothelium allowing for expression of transgenes or downregulation of endogenous gene products.

아데노바이러스 매개 형질도입을 이용한 천연 방광 요로상피에서의 형질전환 유전자의 발현

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Electroporation-Mediated In Vitro Gene Delivery: An Electric Pulse Technique to Introduce Fluorescent Reporter Protein-Encoding Plasmids Into Cultured Cells

Source: Lo, J. C. W. et al., <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/63283">Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2021)
This video demonstrates the electroporation technique that introduces fluorescent protein-encoding plasmid DNA into mouse primary cerebellar granule cell precursors.

전기천공법 매개 체외 유전자 전달: 배양된 세포에 형광 리포터 단백질 인코딩 플라스미드를 도입하는 전기 펄스 기술

Source: Lo, J. C. W. et al., Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Gene Transfer Techniques

Transfection

Urine Depletion and Bladder Rinsing in Mouse Model: A Catheter-based Procedure to Empty and Wash Murine Urinary Bladder

Source: Yu, C. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/57649" target="_blank">Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we describe a catheter-based procedure to empty and rinse the urinary bladder of a mouse model. The prepped mouse can then be used for further experimental procedures.

마우스 모델의 소변 고갈 및 방광 헹굼: 쥐 방광을 비우고 씻는 카테터 기반 절차

Source: Yu, C. et al. Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation. J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we describe ...

암 연구학

Urinary Tract Cancer

In vivo studies

Delivery of DNA Plasmids into Urothelium of Mouse Bladder: An Electroporation-based Procedure to Efficiently Deliver DNA Plasmids into Urothelial Cells of Murine Bladder to Generate Genetically Engineered Models

Source: Chuan, Y. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/57649" target="_blank">Novel method of plasmid DNA delivery to mouse bladder urothelium by electroporation.</a> J. Vis. Exp.&#160; (2018)
This video demonstrates the delivery of DNA plasmid into the urothelium of the mouse bladder using a combination of urethral catheterization and electroporation techniques. The described procedure allows the generation of mouse bladder cancer models.

마우스 방광의 요로텔륨으로 DNA 플라스미드 전달: 유전자 조작 모델을 생성하기 위해 DNA 플라스미드를 쥐 방광의 요로텔륨 세포로 효율적으로 전달하기 위한 전기천공 기반 절차

Source: Chuan, Y. et al. Novel method of plasmid DNA delivery to mouse bladder urothelium by electroporation. J. Vis. Exp.&#160; (2018)
This video ...

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection: A Technique to Directly Deliver DNA into Kidney Cells of Murine Model

Source: Woodard, L. E. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/56324" target="_blank">Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we present the protocol for hydrodynamic injection of plasmids into the renal pelvis of the mouse kidney for nucleic acid transfection. This technique allows organ-specific delivery of plasmids by utilizing the principle of high hydrostatic pressure, which forcefully drives the plasmids into the specific site without causing tissue injury.

유체역학적 신장 골반 주사: 쥐 모델의 신장 세포에 DNA를 직접 전달하는 기술

Source: Woodard, L. E. et al. Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney. J. Vis. Exp. (2018)
In this video, ...