프로토콜 및 원고에 관한 유용한 토론에 감사 Jolanta Chmielowiec 하 고. 우리는 또한 confocal 현미경에 접근을 위한 벤자민 Arenkiel 감사합니다. 이 작품은 NIH (P30-DK079638 M.B.)와 T32HL092332-13 마스와 M.B., 맥 네 어 의료 재단 (M.B.), 및 BCM 지적 발달 장애 연구 센터에서 confocal 코어에 의해 지원 되었다 (NIH U54 HD083092는 유 니스에서 케네디 슈 라이버 국립 연구소의 건강 그리고 인간 발달).

이 방법에 설명 된 모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 베일 러 대학의 약에 의해 승인 되었다.
1. 마우스 배아 일 10.5 췌 장 창시자의 준비
그러나 참고:이 프로토콜 않습니다 필요가 없습니다 2 단계까지 무 균 조건 하에서 지켜질 해 부 도구를 소독 하 고 사용 하기 전에 70% 에탄올 스프레이에 최적입니다.
<ol><li>해 부에 대 한 설정, 얼음 양동이 얼음에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 컨테이너를 놓습니다. 두 개의 뾰족한 집게 및 해 부가 위 70% 에탄올으로 청소. 컨테이너를 3 개 이상 붕 모 세관 튜브, 입 피 펫, 라이터와 1000 µ L 피 펫 팁을 필터링 해 부 지역 근처 설정.<ol>
<li>1.25 mg/mL 찬 dispase에 얼음에 12 잘 플레이트의 두 번째 잘 소독된 물에 희석의 적어도 1 mL를 준비 합니다. 첫 번째, 세 번째 및 네 번째에서 PBS를 넣어 12의 우물 잘 접시. 0.05%의 장소 1 mL Trypsin 1.5 ml에서 튜브 얼음에. 미리 따뜻하게 37 oc.에 떨고 인큐베이터</li>
	</ol>
</li>
	<li>E10.5 타임-임신 쥐 IACUC 지침에 따라 안락사 복 부 지역 V 자형 절 개를 성 기 영역에서의 위와 집게를 사용 하 여 마우스를 하기 전에 청소 하 고 횡 경 막까지 계속 70% 에탄올 스프레이. 참고:이 프로토콜에 질 플러그의 모양을 하루 0.5를 나타냅니다. 5-6 주 오래 된 마우스를 사용 하 여 이상의 2 g의 체중 증가 성공적인 임신의 보조 수단으로 역할을 합니다.<ol>
<li>조심 스럽게 반대편에 반복 하기 전에 생식 기 지역으로 위쪽으로 마우스, 그리고이 절에 따라 장기를 당겨 자 궁의 맨 측면 부분에 절 개를 함으로써 자 궁을 삭제할. 10 cm 차가운 PBS와 페 트리 접시에에서 놓습니다. 그러나 참고: 그것은 e10.5 pancreatoids와 달리이 organoids 특징 되지 않습니다 및 따라서 모든 세 가지 주요 췌 장 혈통으로 분화 하는 능력을 유지 하지 않을 수 있습니다 e11.5 해리 셀에서 organoids를 얻을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가벼운 해 부 현미경 페 트리 접시를 놓고 하 고 신중 하 게 각 태아 사이 두 집게 배치 하 노른자위 낭에서 조직을 박 리 하 여 자 궁 조직을 엽니다. 집게와 10cm 신선한, 페 트리 접시에서 부드럽게 노른자위 sac를 파악 하 여 배아를 전송 차가운 PBS. 얼음에 페 트리 접시를 놓습니다. 참고: 그것은 heedfully 강력한 제거 탯, 태아의 조직 고 구조적 무결성을 손상 시 키 지를 뽑을 수 선호 노른자위 낭 내에서 유지 하는 배아를 제거 하는 것이 중요.</li>
	<li>10 cm 배양 접시 뚜껑에 여러 PBS 방울을 배치 합니다. 이 방울을 사용 하 여 extraembryonic 조직 가시성을 보장 하기 위해 제거는 해 부 동안 배아를 전송. PBS 드롭 배아를 전송 하 고 나머지 배아 얼음 (그림 1A)에 PBS에 체류 하는 동안 집게를 사용 하 여 노 른 자 골목에서 부드럽게 제거 합니다. 가볍게 푸 하지 손상 조직 (그림 1B), 태아를 집게를 사용 하 여 새로운 PBS 드롭 배아를 이동 하기 전에 머리를 제거 합니다. 참고: 조직 액체의 불투명도 따라 여기서 설명한 것 보다 신선한 PBS 방울을 더 자주 전송 되도록 해야 합니다.<ol>
<li>새로운 PBS 드롭 forelimb 싹 집게 (그림 1B)를 사용 하 여 제거 합니다. 사지 새싹은 현재 오프닝으로 집게를 배치 하 고 부드럽게 anteriorly 가장 외부 조직만을 찢 어 (그림 1B). 배아를 회전 하 고 hindlimb 새싹에서 후부 방향으로 반복 합니다. 이 시점에서, 위장 표시 (그림 1B) 해야 합니다.</li>
		<li>위장의 후부 지역의 약간의 굴곡 (그림 1 층) 있다. 위장과 체 벽의 척추 지역 사이이 벤드 뒤에 집게를 삽입 합니다. 위장, 가장 앞쪽 영역 심장 지역 (그림 1B-E)를 연결 하는 곳에 도달할 때까지 천천히 위쪽으로 작업을 분리 합니다. 선택 사항: 원시 심장과 간 싹에서에서 제거만 연속 직감 튜브를 떠나 위 장관의 복 부 지역. 이 프로토콜을 수행 하는 처음 몇 번 그것은 두고 심장과 간 위장와 등 쪽 췌 장 새싹의 형태까지 복 부 랜드마크는 더 쉬울 수도 있습니다 (그림 1C 와 D 익숙한 ).</li>
		<li>신선한 PBS 물방울에 위장을 전송.</li>
		<li>집게를가지고 부드럽게 돌출 버드와 소장 아래 조직을 꼬 집 고 약간 들어올립니다 (그림 1D-F)을 외부 조직. 참고: 등 쪽 췌 장 새싹은 위장과 소장 (그림 1C G) 사이 있습니다. 아래 췌 장 새싹 라운드, 혹 구조 (그림 1G) 처럼 보이게 한다.</li>
		<li>꽃 봉 오리 핀치 위로 새싹 (그림 1G)을 완화 하 고 소장에 연결 집게에 놓습니다. 얼음에 차가운 PBS에 12 잘 플레이트의 첫 번째 우물에 꽃 봉 오리를 전송 하기 전에 새로운 PBS 거품에 한 번 씻어. 모든 새싹 및 배아에서 수집한 12 잘 플레이트의 첫 번째 우물에 배치 될 때까지 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가벼운 해 부 현미경 아래 12 잘 접시를 놓습니다. 성공적으로 나중에 분할 비율을 계산 해 부 췌 장 새싹의 수를 계산 합니다.<ol>
<li>장소는 모 세관 튜브 입 피 펫에 필터링 된 1000 µ L 피 펫 팁 첨부. 화 염 모 세관 튜브를 소독 하 고 사용의 용이성에 대 한 튜브에 벤드를 만듭니다. 모 세관을 사용 하 여 깨끗 한 PBS (그림 1G)와 세 번째 우물을 전송 하기 전에 2 분 동안 두 번째 잘 포함 하 찬 dispase 솔루션에 싹을 전송. 참고: 꽃 봉 오리를 dispase에서 PBS를 전송 하는 동안 조직 모 세관 튜브의 팁을 만지지 마십시오. 조직 관의 끝에 걸리면, 위쪽 및 아래쪽 플라스틱 또는 느슨하게 때까지 깨끗 한 PBS 솔루션에 흔들.</li>
		<li>꽃 봉 오리를 아래로, 플라스틱 그리고 깨끗 한 PBS 가진 4 잘 전송. 마지막으로, 0.05%는 1.5 mL 튜브에 새싹 모 세관 장치 전송 사용 하 여 트립 신. 미리 데워 진된 37 oC 셰이 커에 튜브를 놓고 4 분 1500 rpm에서 흔들어.</li>
		<li>약 10 소용돌이 s 다음 즉시 튜브에 배치는 원심 분리기와 200에서 5 분 동안 스핀 g. centrifuged 세포 (그림 1G)을 방해 하지로 조심 스럽게 솔루션의 모든 하지만 약 50 µ L를 제거.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 경작 Pancreatoids를 형성 하기 위하여 해리 창시자
참고: 다음는 표준 살 균 절차를 사용 하 여 표준 조직 문화 후드에 메 마른 분위기에서 수행 합니다.
<ol><li>수집 된 모든 새싹, centrifuged 셀 400 µ L organogenesis 미디어16,17 (표 1)를 추가 합니다. 펄스 소용돌이 세 번 하 고 플레이트 100 µ L 당 낮은 첨부 파일 96의 잘 잘 플레이트, 싹 (그림 1G) 1:4 비율로 분할.</li>
	<li>시각화를 해리 셀 (그림 1H)를 자유롭게 떠 현미경 아래에서 확인 하십시오. 중간 속도에서 로커에 5% CO2 와 37 oC 인큐베이터에서 문화 접시를 놓습니다.</li>
	<li>매일 pancreatoids의 진행 상황을 모니터링 합니다. 신선한 미디어 3 일 마다 미세한 제어 후드 우물에서 pancreatoid를 떠나 있는 동안 제거에 신중 하 게 pipetting 미디어의 100 µ L를 바꿉니다. 또는 신선한 100 µ L 미디어의 입 피 펫 및 1000 µ L에 연결 된 붕 규 산 세관 피 펫 팁 필터링 새로운 잘 사용 하 여 전송 하는 pancreatoid에 추가할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 처리 Pancreatoids Immunofluorescent 이미징
<ol><li>Immunofluorescent 이미지 pancreatoids를 처리 하려면 먼저 4 %paraformaldehyde / PBS, pH7.4 (PFA) 솔루션 준비 합니다. 4%의 장소 50 µ L PFA는 96의 우물에 잘 플레이트.<ol>
<li>Pancreatoids 4% 신선한 잘으로 가능한 작은 미디어를 복용 하는 문화 매체에서 전송 1000 µ L 필터링 된 피 펫 팁 붕 규 산 모 세관 튜브 및 입 피 펫을 사용 하 여, PFA. 15 분 동안 실내 온도에 로커에 설정 합니다.</li>
		<li>4%에서 pancreatoids 전송 3 신선한 PBS 세척의 총에 대 한 5-10 분 반복에 대 한 상 온에서 신선한 PBS의 100 µ L로 잘으로 PFA 바위. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지, 여기 4 oC에서 PBS의 100 µ L에 최대 1 주일까지 저장 하는 pancreatoids와.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wholemount 이미징 (경우 항 체는 섹션 3.3에에서 적합 한 대체 접근 권장. 그리고 3.4에서 현미경 검사 법.), PBS에서 블록을 0.1% 비 세제 (PBST)로 1 x PBS에서 50 µ L 5% 당나귀 혈 청으로 전송. 4 oC에서 하룻밤 바위 또는 양자 택일로 실 온에서 4 시간.<ol>
<li>1 혈 청 5% 당나귀의 50 µ L에 희석 하는 주 항 체를 포함 하는 새로운 우물을 pancreatoids 전송 x PBST. 4 oC에서 24 시간 (36 h까지 하지만 적어도 12 h)에 대 한 최적의 바위. 참고: 항 체 Chga (1: 100), DBA (1:400), Vim (1:400), 및 Pdx1에 대 한 재료의 테이블에 에서 나열 된 (1: 100) wholemount 얼룩;에 적합 다른 항 체 최적화가 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>Pancreatoids 신선한 PBST 세척 하 고 실 온에서 30 분 동안 바위의 100 µ L를 포함 하는 잘 전송. 3 신선한 PBST 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>1 혈 청 5% 당나귀의 50 µ L에 희석 2 차 항 체를 포함 하는 새로운 우물을 pancreatoids 전송 x PBST. 빛에서 접시를 보호 하 고 4 oC, 락을 최적으로 24 시간 (36 h까지 하지만 적어도 12 h)에. 참고: 테이블의 재료 와 DAPI 핵 counterstain에 나열 된 모든 이차 항 체는 wholemount 얼룩 적합 합니다.</li>
		<li>Pancreatoids x PBST와 바위 1에 3 개의 세척의 총 30 분 반복에 대 한 실 온에서 1의 100 µ L를 포함 하는 새로운 잘 전송 x PBST. 제 3의 그리고 마지막 세척에 추가 300 nM DAPI.</li>
		<li>마지막으로, 깨끗 한 PBS의 저장소 4 oC 최상의 결과 즉시 얼룩 후 영상에서 온 confocal 현미경 검사 법에 의해 이미징 하기 전에 주일에 대 한 빛에서 보호에서 100 µ L을 넣으십시오. 이미징 동안 pancreatoids의 움직임을 방지 하지만 밖으로 건조 방지, PBS의 20 µ L 방울에 각 pancreatoid를 놓습니다. Pancreatoids 아직도 남아 있지, PBS 볼륨을 줄일 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>냉동된 섹션에 대 한 pancreatoids에서에서 전송할 PBS 30% 자당 해결책 하룻밤에 4 o3.<ol>
<li>해 부 현미경 거품에서 포함 미디어를 추가 합니다. 미세한 제어 집게를 사용 하 여 부드럽게 밀어 포함 미디어를 통해 여러 번 냉동 포함 미디어 조직 블록을 전송 하기 전에 잔여 자당을 제거 하 여 pancreatoids를 담근 다.</li>
		<li>8 µ m에서 cryostat에 고정 될 때까지 드라이 아이스에 조직 블록 및 섹션을 놓습니다. 참고: 섹션 저장할 수 있습니다-80 oC 또는 immunostained에 즉시.</li>
		<li>섹션-80 oC 건조까지 약 5 분 동안 실 온에서 해 동 하실 수 있습니다. 소수 성 장벽을 조직과 5% 당나귀 혈 청 1에서 희석을 사용 하 여 블록 주위 소수 pap 펜을 사용 하 여 그리는 실 온에서 30 분 동안 x PBST.</li>
		<li>미디어를 제거 하 고 기본 항 체 5% 당나귀 혈 청 1 x PBST에서 4 o3. 하룻밤에 희석에 희석 즉시 바꿉니다</li>
		<li>기본 솔루션을 제거 하 고 씻어 조직 세 번 1 10 분 x PBST. 이것 다음, 이차 항 체 솔루션 5% 당나귀 혈 청 1에서 희석에 희석 추가 실 온에서 1 h x PBST 빛에서 슬라이드를 보호 하 고.</li>
		<li>보조 솔루션을 제거 하 고 1에 슬라이드 세 번 씻고 10 분 x PBST. 마지막 세척에 추가 300 nM DAPI.</li>
		<li>미디어를 제거 하 고 설치 미디어와는 coverslip 추가. 스토어 이미지 준비까지 멀리 빛 4 oC에에서 슬라이드.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 대 본 분석에 대 한 Pancreatoids에서 RNA의 격리
<ol><li>Pancreatoids 1.5 mL 튜브에 산 guanidinium 안산 클로 페 놀 프롬-솔루션의 500 µ L로 불 임 및 장소에 대 한 필터링 된 1000 µ L 피 펫 팁 입 피 펫에 연결 된 붕 규 산 모 세관을 사용 하 여 수집 합니다. -80 oC에 저장 하거나 즉시 RNA 격리를 진행.</li>
	<li>RNA 격리에 대 한 필요한 경우 얼음 샘플을 해 동 하 고 클로 프롬의 100 µ L를 추가 합니다. 4 oC 15 분에 대 한 장소와 소용돌이 잘 미리 냉각 4 oc. 원심 분리기<ol>
<li>장소 튜브 원심 분리기 및 스핀 4 oc.에서 12000 g에서 20 분</li>
		<li>조심 스럽게 튜브 레이어 분리를 방해 하지 않는를 제거. 200 µ L 피 펫을 사용 하 여, 명확한 수성 해결책을 수집 하 고 흰색 단백질 층 및 분홍색 DNA 층에서 버퍼에 작은 금액을 뒤에 남겨두고 새로운 1.5 mL 튜브에 배치. 이 과정에서 아무것도 피 펫의 끝을 만지지 마십시오 하 고 1.5 mL 튜브의 벽을 만지지 마십시오.</li>
		<li>수성 층과 소용돌이 포함 하는 새 튜브를 100% 소 프로 파 놀의 500 µ L를 추가 합니다. 앉게 실 온에서 20 분, 얼음, 더 이상 또는 최대 강수량 하룻밤 사이에 두고-20 oc.</li>
		<li>4 oC를 작은 RNA에서 15 분 동안 12000 g에서 원심. 펠 릿을 방해 하지 않고는 소 프로 파 놀을 제거 합니다. 참고: pancreatoids는 작은, 그것은 가능성이 펠 릿 표시 되지 것입니다.</li>
		<li>감기, 75% 에탄올을 추가 하 고 여러 번 튜브를 반전. 원심 분리기에 놓고 에탄올과 9000 x g에서 2 분 동안 회전 4 oC. 제거에서 10 분 동안 9000 x g에서 회전 합니다.</li>
		<li>200 µ L 피 펫을 사용 하 여 지역에 거주 하는 펠 릿 하지 않고 튜브에 어떤 나머지 에탄올을 제거. 잔여 에탄올의 증발 되도록 실 온에서 5 ~ 10 분에 대 한 튜브에 뚜껑 열어 둡니다.</li>
		<li>깨끗 한, nuclease 무료 물 20 µ L에서 vortexing에 의해에 펠 릿을 resuspend. 선택 사항: 열 RNA 65 oC 3 분 하 고 즉시 얼음에 반환 합니다. RNA-80 oC에 저장 하거나 즉시 반전 녹음 방송 및 정량에 사용 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Akkerman, N., Defize, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dawn+of+the+organoid+era:+3D+tissue+and+organ+cultures+revolutionize+the+study+of+development,+disease,+and+regeneration.">Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration.</a> Bioessays. 39 (4), (2017).</li><li>Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+expressed+by+murine+embryonic+pancreatic+mesenchyme+enhance+generation+of+insulin-producing+cells+from+hESCs.">Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs.</a> Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).</li><li>Landsman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+mesenchyme+regulates+epithelial+organogenesis+throughout+development.">Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).</li><li>Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pancreatic+differentiation+by+signals+from+blood+vessels.">Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels.</a> Science. 294 (5542), 564-567 (2001).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro.">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li><li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+kidney+organoids+by+differentiation+of+human+pluripotent+cells+to+ureteric+bud+progenitor-like+cells.">The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Loftus, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinar+cell+apoptosis+in+Serpini2-deficient+mice+models+pancreatic+insufficiency.">Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency.</a> PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).</li><li>Kleeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pancreatitis.">Chronic pancreatitis.</a> Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).</li><li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+signals,+and+lineages+in+pancreas+development.">Genes, signals, and lineages in pancreas development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li><li>Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+pancreas+organogenesis+from+dispersed+mouse+embryonic+progenitors.">In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).</li><li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro.">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).</li><li>Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic-stem-cell-derived+progenitors+by+organ-matched+mesenchyme.">Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme.</a> Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).</li><li>Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+pancreatoids+with+native+mesenchyme+develop+Insulin+producing+endocrine+cells.">Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).</li><li>Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+multiple+steps+of+pancreatic+differentiation.">Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).</li><li>Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factors+Nkx6.1+and+Nkx6.2+possess+equivalent+activities+in+promoting+beta-cell+fate+specification+in+Pdx1++pancreatic+progenitor+cells.">The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells.</a> Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).</li><li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+is+required+for+maintenance+of+the+pancreatic+progenitor+cell+pool.">SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).</li><li>Kawaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+transcriptional+regulator+Ptf1a+in+converting+intestinal+to+pancreatic+progenitors.">The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors.</a> Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).</li><li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells.">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li><li>Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+binding+sites+for+Dolichos+biflorus+agglutinin+at+the+apical+aspect+of+collecting+duct+cells+in+rat+kidney.">Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney.</a> Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).</li><li>Reichert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+culture+and+genetic+manipulation+of+mouse+pancreatic+ductal+cells.">Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).</li><li>Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromogranins+A+and+B:+the+first+25+years+and+future+perspectives.">The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives.</a> Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).</li><li>Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+alpha-cell+dysfunction+in+diabetes.">Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes.</a> Diabetes and Metabolism. 34, 49-55 (2008).</li><li>Del Prato, S., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-+and+alpha-cell+dysfunction+in+type+2+diabetes.">Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes.</a> Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).</li><li>Piciucchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocrine+pancreatic+insufficiency+in+diabetic+patients:+prevalence,+mechanisms,+and+treatment.">Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment.</a> International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).</li><li>Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormalities+of+the+Exocrine+Pancreas+in+Type+1+Diabetes.">Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes.</a> Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).</li><li>Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+insufficiency+in+type+1+and+type+2+diabetics+of+Indian+origin.">Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin.</a> Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

셀 문화 모델의 진행은 제대로 개발 모델, 임상 관련 세포 유형, 시험 약물 효능, 또는 심지어 이식 환자에 게 중요 합니다. 그러나, 인위적으로 업과 접시에 개발은 도전으로 우리는 여전히 organogenesis과 생리학의 메커니즘을 이해 멀리 vivo에서. 따라서 체 외에서 세포는 효율적으로 생성 된, 완전히 기능, 시간, 오랜 기간 동안 유지 될 또는 본문에 대 등 한 셀에서 다른 이상 항구 수 없습니다. 많은 다른 세포 유형 개발 및 생리학에 영향을 발생 하는 복잡 한 전체적 변화 하는 동안 상호 작용 하는 때문입니다. 체 외에서 의 편의 결합 하 여 개발 진행 하는 방법에 대 한 이해를 얻고 vivo에서 개발의 복잡성을 유지 하면서 시스템 것 이라고가 르 친다 생명 의학 연구를 위한 유용한 도구를.
Organoids의 개발은 개발의 복잡성을 모델링으로 유망한 애비뉴. 이 프로토콜에서 우리 췌 장 organoids, pancreatoids, 네이티브 mesenchyme 유지 하 고 pancreatoids 포도 당 응답을 전시 하지 않습니다 불구 하 고, 내 분 비 세포를 튼튼하게 생성 되 나를 확인 하는 방법을 설명 합니다. 이 도구는 vivo에서발견 하는 조직의이 질을 유지 하는 문화 시스템에서 기능 개발의 메커니즘을 조사를 사용할 수 있습니다. 또한,이 유전 화면 또는 화면 작은 분자 또는 약물을 사용할 수 있습니다. 이것은 흥미로운 특히 상대적으로 균질 성 세포 배양 시스템에서 테스트 후보 약물 다른 밀접 하 게 관련된 셀 형식에이 화합물의 효과 우회 수 있습니다.
이 프로토콜 중 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 첫째, 자 궁에서 태아의 주의 제거는으로 중요 한 복 부 영역을 추출 하 고 위장 췌 장 새싹 (1.3 단계)를 분별 하기 어려운 게 수 강제로 태아를 꺼내. 위장에서 췌 장 새싹의 두 번째, 깨끗 한 절 개는 중요 한, 다른 세포 유형 (단계 1.4.4)의 차별화로 이어질 수 있습니다 복용 초과 조직. 이렇게 하려면 췌 장 새싹 아래 공략 하 여 췌 장 새싹 분리 이전 overlaying 조직 리프트 중요 하다. 마지막으로, 이동할 때 꽃 봉 오리는 dispase에서 다시 씻어 PBS, 그것은 절대적으로 붕 규 산 모 세관 튜브를 사용 하 고 조직 관 개통의 가장자리를 터치 해 주세요, 그렇지 않으면, 조직 (단계 1.5.1) 튜브의 끝에 막대기 것입니다. 이 방지 하려면 꽃 봉 오리가 아닌 외부에 튜브에 새싹을 수 있도록 쪽으로 이동 하기 전에 입 pipetting 솔루션을 시작 합니다.
그러나이 메서드는 3 차원 pancreatoid 내 분 비 세포의 형성을 허용,, 상피 분기 다른 기존 프로토콜16,17보다 제한 합니다. 또한, 인슐린을 생산 하는 내 분 비 세포 형태, 하는 동안 그들은 할 전시 하지 포도 당 응답. 따라서, 추가이 세포의 성숙에 대 한 조사 정보 제공 합니다 귀중 한 모두 베타 세포 생성의 분야 뿐만 아니라 기능 pancreatoids의 생성에 일반적.
Pancreatoids의 생성 하는 내 분 비 세포, 개발 그리고, 나중에 포도 당 응답을 얻을, 당뇨병의 치료에 대 한 잠재적인 영향. 당뇨병은 췌 장 베타 세포 손실 또는 역 기능 그리고 잠재적으로 질병 합병증을 완화 수 있습니다 이러한 세포를 교체 재생 치료를 위한 주요한 후보자 이다. 그러나 당뇨병에서 베타 세포,,로 hPSCs를 차별화 진행 했다, 췌 장 베타 세포, 알파 세포 또는 포상 세포28,29, 등 함께 다른 셀 형식에 장애는 종종 30,,3132. 따라서,이 식 위한 새로운 췌 장 조직 생성 괴로움된 조직을 완전히 바꿀 수 있습니다. Murine pancreatoid 형성 및 기능 추가 조사와 함께 발달 궤적 hPSCs의 인간의 pancreatoids를 생성 하 유사 수 있습니다. 재생 치료를 위한 환자 특정 맥락에서 약물에 응답에 대 한 화면에 맞춤된 의학에 대 한 이러한 인간의 pancreatoids는 사용할 수 있습니다.

정상적인 개발 및 생리의 메커니즘을 묘사 하는 것은 질병 병 인을 이해 하 고 궁극적으로 치료 방법을 육성에 답해야 합니다. 배양 및 분화 줄기 세포 개발의 신속 하 고 높은 처리량 분석을 수 있습니다, 그것은 기존의 신체의 세포 운명 조절 메커니즘에 관한 지식에 의해 제한 됩니다 고 인위적으로 개발에이 상대적으로 균질 성, 2 차원 상태1,2. 뿐만 아니라 vivo에서 개발 틈새와 환경에서 서로 다른 세포 유형으로 외부 영향에 의해 영향을 받는 paracrine 신호 및 조직 지원 organogenesis, 가이드를 제공 하는 있지만 이러한 세포의 기능에 의존 하 고 또한 그들의 주변 지도3,,45. 이러한 외부 단서의 중요성, vivo에서 마우스 모델의 힘 드는 자연과 분화 프로토콜의 한계를 감안할 때, 새로운 시스템 기본 개발 프로세스 및 생리학을 실험적으로 조사 필요 합니다.
Organogenesis, 생리학, 약물 효능 및 심지어 pathogenesis. 을 편리 하 고 적합 한 시스템을 제공 하는 3 차원, 복잡 한 organoids를 생성 하는 프로토콜의 출현 대 위6 과 대 장7 다른 시스템 organogenesis에 대 한 우리의 이해를 확장 했다 murine organoids를 설립, 연구 개발 복잡성 vivo에서 보다 적게 제한 하는 도구를 제공 하 그리고 생체 외에서 모델입니다. Murine organoid이 진보 때문 형성과 인간 만능의 출현 줄기 세포, 인간의 장8, 망막9, 신장10,11, 그리고 대뇌12 organoids 생산 되어,이 레 퍼 토리만 개발 메커니즘에 관한 기존의 지식에 의해 제한 됩니다.
질병의 무수 한 재앙 다른 췌 장 세포 유형, 외 분 비 췌 장 불충분13,14, 췌 장 염 포상 세포에에서 포상 세포와 덕트를 포함 한 췌 장 organoids의 생성은 특별 한 관심의 고 15당뇨병 베타 세포입니다. 이러한 서로 다른 세포 유형의 개발에 관한 지식을 얻고 고 또한, 맞춤된 약물 검사 또는 이식에 대 한 플랫폼 역할을 할 수, 있습니다. 그들의 병 리를 이해에 도움이 수 있습니다. 이전, Greggio 외. 만들 murine 췌 장 organoids morphogenesis vivo에서 정리 하 고 모든 주요 췌 장 상피 세포의 구성 하는 조직, 3 차원, 복잡 한 구조를 개발 하는 방법 개발 유형16,17. 이것은 췌 장 분야에서 앞으로 중요 한 단계 이다, 특히 만드는 세포에 생체 외에서 베타 세포 개발의 생물 학적 조사를 설정할 수 있습니다. 그러나, 내 분 비 세포의 부족은 organoids 조직, 틈새 상호 작용 수 및 교육용 신호17제공으로 이식 했다 하지 않는 한이 프로토콜에서 형성 했다. 틈새 시장, 무 겁 게 내 분 비 박 등 차별화3,4, 후기에 organogenesis의 초기 단계에서 개발 상피를 뒤 덮 었의 가장 큰 부분을 구성 하는 mesenchyme 18. 개발 췌는 mesenchyme의 상호작용은 아직 외부 신호 및 생체 내에서 세포 복잡성을 유지의 중요성 organogenesis 연구의 또 다른 예.
여기, 우리는 3 차원 췌 장 organoids, pancreatoids, 해리 e10.5 murine 췌 장 창시자에서 불리를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 pancreatoids 네이티브 mesenchyme 유지, 부동성 조건에서 자기 조립 및 내 분 비 하는 베타 세포19의 강력한 수를 포함 한 모든 주요 췌 장 세포 종류를 생성. 이 방법은 이전 프로토콜 강력한 내 분 비 차별화 부족으로 내 분 비 발달의 분석을 위해 가장 적합 하다. 그러나, 췌 장 organoids에 대 한 프로토콜을 사용 하 여 Greggio 외. 췌 장의 상피 분기 및 morphogenesis의 분석에 대 한 더 적합에 의해 설명 된 대로 분기로 더 제한 됩니다 pancreatoids.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">M6250</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A5177</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BarnStead NanoPure Nuclease-free water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Borosilicate Capillary Tubes</td>
			<td style="width:123px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:344px;">GB1007515</td>
			<td style="width:167px;">O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">C5080</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Cell-Repellent 96-Well Microplate</td>
			<td style="width:123px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:344px;">650970</td>
			<td style="width:167px;">U-bottom</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Centrifuge 5424 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">233306</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chromogranin-A antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Compact, Modular Stereo Microscope M60</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Countess Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">C10310</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Countess Cell Counter Slides</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">C10312</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CryoStar NX70</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>957000L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">G7528</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DAPI (4&#39;,6-Diamidine-2&#39;-phenylindole-dihydrochloride)</td>
			<td style="width:123px;">Roche</td>
			<td style="width:344px;">10 236 276 001</td>
			<td style="width:167px;">Powder</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DBA antibody</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>RL-1032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dispase II, Powder</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">17105041</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DMEM/F-12, HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">11330032</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dnase I</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">18068-015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:344px;">11251-10</td>
			<td style="width:167px;">0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">EGF (Epidermal growth factor)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">E9644</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Ethanol, 200 Proof</td>
			<td style="width:123px;">Decon Laboratories</td>
			<td style="width:344px;">2716</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Forma Steri Cycle CO2 Incubators</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:344px;">370</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Fluoromount-G</td>
			<td style="width:123px;">Southern Biotech</td>
			<td style="width:344px;">OB10001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">H3149-10KU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">INSM1 Antibody</td>
			<td style="width:123px;">Santa Cruz BioTechnology</td>
			<td style="width:344px;">sc-271408</td>
			<td style="width:167px;">Polyclonal Mouse IgG</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher</td>
			<td style="width:344px;">a4164</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isothesia Isoflurane, USP</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Insulin Antibody</td>
			<td style="width:123px;">Dako</td>
			<td style="width:344px;">A056401</td>
			<td style="width:167px;">Polyclonal Guinea Pig</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">KAPA SYBR FAST Universal</td>
			<td style="width:123px;">KAPA Biosystems</td>
			<td style="width:344px;">KK4618</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:123px;">KaryoMax</td>
			<td>10575090</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">10828028</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">442615</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mouse C-Peptide ELISA</td>
			<td style="width:123px;">ALPCO</td>
			<td style="width:344px;">80-CPTMS-E01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA</td>
			<td style="width:123px;">ALPCO</td>
			<td style="width:344px;">80-INSMSU-E01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">MX35 Microtome Blades</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:344px;">3052835</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">S7653</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">S3817</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Normal Donkey Serum</td>
			<td style="width:123px;">Jackson Immuno Research</td>
			<td style="width:344px;">017-000-121</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">158127</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">21-040-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pdx1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>F6A11</td>
			<td>Monoclonal Mouse MIgG1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td>
			<td style="width:123px;">VWR</td>
			<td style="width:344px;">15160-157</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">MT30002CI</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate)</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">P1585</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:344px;">22431081</td>
			<td style="width:167px;">1.5mL Capacity</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recombinant Human FGF-10 Protein</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">345-FG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recombinant Human FGF-Acidic</td>
			<td style="width:123px;">Peprotech</td>
			<td style="width:344px;">100-17A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Recombinant Human R-Spondin I Protein</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:344px;">4546-RS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">BenchRocker 2D</td>
			<td style="width:123px;">Benchmark</td>
			<td style="width:344px;">BR2000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sucrose 500g</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">S0389</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">SuperFrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">12-550-15</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Super Pap Pen</td>
			<td style="width:123px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:344px;">71310</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Thermomixer R</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:344px;">05-412-401</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Tissue Tek O.C.T. Compound</td>
			<td style="width:123px;">Sakura</td>
			<td style="width:344px;">4583</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">T8787</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">TRIzol Reagent</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">15596018</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">TrypLE Express</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">12604039</td>
			<td style="width:167px;">(1x), no Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Trypan Blue Stain</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:344px;">15250061</td>
			<td style="width:167px;">For cell counting slides</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:344px;">25-052-CI</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>25200072</td>
			<td style="width:167px;">Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Ultra-Low Attachment 24-Well Plate</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td>4520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Vimentin Antibody</td>
			<td style="width:123px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:344px;">AB5733</td>
			<td style="width:167px;">Polyclonal Chicken IgY</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Vortex Genie</td>
			<td style="width:123px;">BioExpres</td>
			<td style="width:344px;">S-7350-1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Y-27632 Dihydrochloride</td>
			<td style="width:123px;">R&#38;D Systems</td>
			<td>1254</td>
			<td style="width:167px;">Also known as ROCK inhibitor</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Zeiss 710 Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of scaffold-free, three-dimensional insulin expressing pancreatoids from mouse pancreatic progenitors in vitro

췌 장 혈액 포도 당 항상성 및 소화를 함께 작동 하는 많은 다른 세포 유형의 구성 하는 복잡 한 기관 이다. 이 셀 형식 효소를 은닉 포상 세포는 arborized ductal 시스템 본질적인, 그리고 호르몬 생산 하는 내 분 비 세포에 효소의 수송에 대 한 책임을 포함합니다.
내 분 비 하는 베타 세포는 낮은 혈액 포도 당 수준에 인슐린을 생성 하는 본문에 유일한 셀 유형입니다. 당뇨병, 손실 또는 베타 세포의 기능 장애를 특징으로하는 질병 전염병 비율에 도달입니다. 따라서, 파생 약물 및 세포 기반 치료제 심사 목적으로 사용할 수 있는 베타 세포 개발 조사를 프로토콜을 확립 필수적 이다. 마우스 개발의 실험 조사는 필수, vivo에서 학문은 힘들고 시간이 많이 소요. 배양된 세포 검사;에 대 한 더 편리한 플랫폼을 제공 그러나, 그들은 세포 다양성, 건축, 조직과 세포 상호 작용 발견 유지할 수 없습니다 vivo에서. 따라서, 췌 장 organogenesis 및 생리학 조사 하는 새로운 도구를 개발 하는 것이 필수적입니다.
세포 구성 하 고 복잡 한, 순수 유능한 성인 기관으로 분화 췌 장 상피 세포는 organogenesis의 발병에서 mesenchyme와 가까운 협회에서 개발. 췌 장 mesenchyme 내 분 비 개발에 대 한 많은 이해 되지 않는다 잘 아직, 따라서 생체 외에서 문화 동안 정리 하기 어려운 중요 한 신호를 제공 합니다. 여기, 우리 유지 mesenchyme, pancreatoids 라고 하는 문화 3 차원, 셀룰러 복잡 한 마우스 organoids에 프로토콜을 설명 합니다. E10.5 murine 췌 장 새싹은 해 부, 해리, 및 비 계 없는 환경에서 경작. 이러한 셀을 떠 자기 mesenchyme 개발 pancreatoid 및 내 분 비 베타 세포에는 포상 및 덕트 세포 개발의 강력한 수 포와 함께 조립. 이 시스템은 organogenesis, 또는 약물 이나 작은 분자, 유전자 검사에 대 한 세포 운명 결정, 구조, 조직과 morphogenesis, 세포-세포 상호 작용을 공부 하 사용할 수 있습니다.

마우스 배아 자 궁 경적에서 e10.5에서의 주의 해 부 추가 해 부 (그림 1A)에 대 한 PBS에 손상 되지 않은 배아 항복 한다. 위장은 배아 (그림 1B), 내장 및 위 (그림 1C F)의 교차점에서 등 쪽 췌 장 새싹의 분별을 허용에서 효율적으로 제거할 수 있습니다. E10.5 췌 장 새싹 이전 특징 되었습니다; 창시자는 Pdx1, Sox9, Ptf1a, 및 Hes120,21,,2223을 표현 한다. 조직 처리 단계에 따라 천연된 췌 장 단일 세포 또는 세포의 작은 그룹 가벼운 현미경 검사 법 (그림 1G H)에 의해 구상 될 수 있다.
Organogenesis 미디어에서 이러한 부동성, 비 계 없는 셀 자체 조립 하 고과 문화 (그림 2A)에서 적어도 10 일 동안 계속 성장 하는 3 차원 pancreatoids로 구성. pancreatoids vivo에서 췌 장, 분기 morphogenesis 발생과 형태학 유사성이 있다. 유전자 변형 쥐를 사용 하 여, 실시간으로 다른 세포 유형 또는 과정을 모니터링할 수 있습니다. 예를 들어 Ins1 eGFP24 마우스를 사용 하 여 내 분 비 하는 베타 세포의 형성을 표시를 pancreatoids 수 수 몇 군데 베타 셀 개발 (그림 2B)을 시각화 하기 위해 매일. 또한, 문화 조건 변경, 추가 작은 분자, 약물, 또는 게놈을 조작, 뿐만 아니라 세포 운명 결정 평가 될 수 있다 그러나 구조 및 형태학에 있는 변화는 또한 조사 수 있습니다. 여기에 우리가 높은 농도에서 키 니 아 제 C 활성 제 단백질 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)의 응용 프로그램 표시 (160 nM), 상피 세포를 연결 하 고 분기 증가 pancreatoids, 느슨하게 이어지는 개발의 형태를 변경 19 (그림 2C).
췌 장의 상피 세포와 췌 장 mesenchyme 조직의 협회 평가, immunostaining 각 조직의 표식에 대 한 수행할 수 있습니다. 덕트 마커, DBA25,26, 내 분 비 표식, Chga27및 핵 DAPI에 의해 표시의 Immunostaining pancreatoids (그림 3A)에서 멀티 혈통 형성 공개. Mesenchyme 마커, Vimentin, 공동 췌 장의 조상 표식으로 물 (약 e15.5 e9.0)에서 Pdx1, 보여준다는 mesenchyme pancreatoid (그림 3B) 봉투. Immunostaining는 또한 종류의 세포의 다른 마커 뿐 아니라 Pdx1 공개 분기 구조, 형태를 검사 하 사용할 수 있습니다. 그림 3C, 우리는 상피 마커 Pdx1 및 베타 세포 마커 기능 사용 하 여 정량 분석, 창시자의 녹취 록에 대 한 얼룩 및 세포 분화에 의해 베타 셀 개발을 시각화 한 조상 유전자 등 평가 Pdx1 와 Hes1, 그리고 차별화 된 마커 Prss1, Prss3, Hnf6, Isl1, Nkx6-1, 및 Ins1 (그림 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57599/57599fig1.jpg"> 그림 1: 해 부, 분리, 및 pancreatoid 세대에 대 한 e10.5 췌 장 창시자의 도금의 개요. (A) e10.5 배아의 명시 이미지. (B) 왼쪽 상단에서 시작 해 부 절차의 회로도 빨간색, 파선 영역 잘라내기, 녹색 지역은 위장을 나타냅니다. 첫째, 머리 forelimb 새싹의 제거 및 유기 체의 측면의 개통 다음 제거 됩니다. (C) 위장은 신중 하 게 제거, 관의 복 부 지역에서 튀어나와 심장과 간 싹. 복 부, 등 쪽 췌 장 새싹 및 장 수 될 시각, 대물 이미지와 같이. (D) 심장 및 간 새싹의 제거. 회로도 왼쪽에 고 명시 이미지 오른쪽에 있습니다. 등 쪽 췌 장 새싹의 주위 조직 (E) Pinching 버드 해 부에 대 한 노출 회로도 왼쪽에 고 명시 이미지 오른쪽에 있습니다. (F)는 위장 요로 명시 야 현미경 아래 등 쪽 췌 장 새싹으로. 왼쪽에 있는 이미지, 소장에서 벤드는 표시, 척추 지역에서 위장 분리 때 집게를 배치 될 수 있습니다. 오른쪽에 고배율 대물 이미지 모두 등 쪽과 복 부 췌 장 새싹을 보여 줍니다. (G) 등 쪽 췌 장 새싹 및 조직의 분리, organogenesis 미디어 물의 resuspension 전에 처리 및 도금의 제거. (H) 대물 이미지 도금 직후 해리 셀을 보여 줍니다. <a href="/files/ftp_upload/57599/57599fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57599/57599fig2.jpg"> 그림 2 : Pancreatoids 시간이 지남에 모니터링. (A) 주 1, 주 2, 및 3 일에서 pancreatoids의 명시 이미지. 바 규모 = 100 um. (B) 췌 장 morphogenesis 조사 문화 조건의 조작. 여기, PMA의 높은 레벨의 추가 하루 1과 2에서 명시 야 현미경 검사 법에 의해 시각으로 불린된 상피 구조와 증가 분기를 지도 한다. 스케일 바 하루 4, 5 일, 6 일, 하루 7, 및 eGFP 녹색에서으로 표시 된 베타 세포의 개발 일 9, 100 µ m. (C) Ins1-eGFP 마우스 pancreatoids =. 바 규모 = 100 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57599/57599fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57599/57599fig3.jpg"> 그림 3 : Pancreatoids의 Immunostaining. (A) Immunostaining pancreatoid 녹색, 및 핵 DAPI에서 파란색으로 표시 Chga 여 빨간색, 내 분 비 세포에서 DBA에 의해 덕트를 표시 하려면 5 일에. (B) Immunostaining pancreatoid Pdx1 여 녹색에서 빨간색과 췌 장 창시자에 의해 Vimentin mesenchyme 표시 하려면 7 일에. (B) Immunostaining pancreatoid Pdx1 여 녹색에서 빨간색과 췌 장 창시자에 의해 인슐린 베타 세포를 7 일에. <a href="/files/ftp_upload/57599/57599fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57599/57599fig4.jpg"> 그림 4 : 대 본 분석. 창시자와 차별화 세포의 표식에 대 한 하루 7 pancreatoids의 양이 많은 PCR Vivo에서 murine 조직 비교 Scavuzzo 외 에 표시 됩니다. (2017). 결과 Gapdh으로 정규화 됩니다. N = 2, 스케일 바는 SEM. <a href="/files/ftp_upload/57599/57599fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
			<td>약어</td>
			<td>최종 농도</td>
		</tr>
<tr>
<td>페니실린-스</td>
			<td>P/S</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">FBS-무료 미디어 보충</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td>베타-Mercaptoethanol</td>
			<td>공학</td>
			<td>0.1 m m</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phorbol Myristate 12 13-아세테이트</td>
			<td>PMA</td>
			<td>16 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632 또는 바위 억제제</td>
			<td>RI</td>
			<td>10 음</td>
		</tr>
<tr>
<td>표 피 성장 인자</td>
			<td>EGF</td>
			<td>25 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin1</td>
			<td>-</td>
			<td>500 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>산 성 섬유 아 세포 성장 인자, 섬유 아 세포 성장 인자 1</td>
			<td>aFGF, FGF1</td>
			<td>25 ug/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>헤 파 린 나트륨 소금</td>
			<td>헤 파 린</td>
			<td>2 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>섬유 아 세포 성장 인자 10</td>
			<td>FGF10</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dulbecco의 수정이 글 매체/영양소 혼합 F-12</td>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>5 mL를</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. Organogenesis 미디어입니다.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro at JoVE.com

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

여기, 선물이 해리 했다 부동성 e10.5 췌 장 창시자와 관련된 mesenchyme 3D murine pancreatoids을 표현 하는 인슐린을 생성 하는 프로토콜.

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

generation-scaffold-free-three-dimensional-insulin-expressing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

9.0K 조회수.  Baylor College of Medicine. 여기, 선물이 해리 했다 부동성 e10.5 췌 장 창시자와 관련된 mesenchyme 3D murine pancreatoids을 표현 하는 인슐린을 생성 하는 프로토콜.

비디오: Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

연구

발생학

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of pancreatic progenitor cells that can be used for the study of and future treatment of diabetes. This article outlines a four-stage differentiation protocol designed to generate pancreatic progenitor cells from human embryonic stem cells (hESCs). This protocol can be applied to a number of human pluripotent stem cell (hPSC) lines. The approach taken to generate pancreatic progenitor cells is to differentiate hESCs to accurately model key stages of pancreatic development. This begins with the induction of the definitive endoderm, which is achieved by culturing the cells in the presence of Activin A, basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and CHIR990210. Further differentiation and patterning with Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) and Dorsomorphin generates cells resembling the posterior foregut. The addition of Retinoic Acid, NOGGIN, SANT-1 and FGF10 differentiates posterior foregut cells into cells characteristic of pancreatic endoderm. Finally, the combination of Epidermal Growth Factor (EGF), Nicotinamide and NOGGIN leads to the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ cells. Flow cytometry is performed to confirm the expression of specific markers at key stages of pancreatic development. The PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors at the end of stage 4 are capable of generating mature &#946; cells upon transplantation into immunodeficient mice and can be further differentiated to generate insulin-producing cells in vitro. Thus, the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors, as demonstrated in this protocol, is of great importance as it provides a platform to study human pancreatic development in vitro and provides a source of cells with the potential of differentiating to &#946; cells that could eventually be used for the treatment of diabetes.

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Here we describe a 4-stage protocol to differentiate human embryonic stem cells to NKX6-1+ pancreatic progenitors in vitro. This protocol can be applied to a variety of human pluripotent stem cell lines.

능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

마우스에서 초기 임신 특성에 대 한 3 차원 높은-주파수 초음파의 새로운 사용

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human developmental processes. Stepwise directed differentiation that recapitulates developmental processes is one of the major ways to generate pancreatic cells including pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) pancreatic progenitor cells. Conventional protocols initiate the differentiation with small colonies shortly after the passage. However, in the state of colonies or aggregates, cells are prone to heterogeneities, which might hamper the differentiation to PDX1+ cells. Here, we present a detailed protocol to differentiate hPSCs into PDX1+ cells. The protocol consists of four steps and initiates the differentiation by seeding dissociated single cells. The induction of SOX17+ definitive endoderm cells was followed by the expression of two primitive gut tube markers, HNF1&#946; and HNF4&#945;, and eventual differentiation into PDX1+ cells. The present protocol provides easy handling and may improve and stabilize the differentiation efficiency of some hPSC lines that were previously found to differentiate inefficiently into endodermal lineages or PDX1+ cells.

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Here, we present a detailed protocol to differentiate human pluripotent stem cells (hPSCs) into pancreas/duodenum homeobox protein 1+ (PDX1+) cells for the generation of pancreatic lineages based on the non-colony type monolayer growth of dissociated single cells. This method is suitable for producing homogenous hPSC-derived cells, genetic manipulation and screening.

효율적인 세대의 췌 장/십이지 Homeobox 단백질 1+ 뒤 Foregut/췌 장 창시자 접착 문화에 hPSCs에서

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

Generation of First Heart Field-like Cardiac Progenitors and Ventricular-like Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is a pre-requisite for cell-based cardiac therapies and disease modeling. We have recently shown that Id genes are both necessary and sufficient to specify first heart field progenitors during vertebrate development. This differentiation protocol leverages these findings and uses Id1 overexpression in combination with Activin A as potent specifying cues to produce first heart field-like (FHF-L) progenitors. Importantly, resulting progenitors efficiently differentiate (~70&#8211;90%) into ventricular-like cardiomyocytes. Here we describe a detailed method to 1) generate Id1-overexpressing hPSCs and 2) differentiate scalable quantities of cryopreservable FHF-L progenitors and ventricular-like cardiomyocytes.

Here we describe a scalable method, using a simple combination of Activin A and lentivirus-mediated Id1-overexpression, to generate first heart field-like cardiac progenitors and ventricular-like cardiomyocytes from human pluripotent stem cells.

첫 번째 심장 필드 같은 심장 창시자와 같은 심 실 Cardiomyocytes 인간 만능 줄기 세포에서의 세대

The generation of large amounts of functional human pluripotent stem cells-derived cardiac progenitors and cardiomyocytes of defined heart field origin is ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have no effective therapeutic options. Tools to study EHBD are very limited. Our purpose was to develop an organ-specific, versatile, adult stem cell-derived, preclinical cholangiocyte model that can be easily generated from wild type and genetically engineered mice. Thus, we report on the novel technique of developing an EHBD organoid (EHBDO) culture system from adult mouse EHBDs. The model is cost-efficient, able to be readily analyzed, and has multiple downstream applications. Specifically, we describe the methodology of mouse EHBD isolation and single cell dissociation, organoid culture initiation, propagation, and long-term maintenance and storage. This manuscript also describes EHBDO processing for immunohistochemistry, fluorescent microscopy, and mRNA abundance quantitation by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol has significant advantages in addition to producing EHBD-specific organoids. The use of a conditioned medium from L-WRN cells significantly reduces the cost of this model. The use of mouse EHBDs provides almost unlimited tissue for culture generation, unlike human tissue. Generated mouse EHBDOs contain a pure population of epithelial cells with markers of endodermal progenitor and differentiated biliary cells. Cultured organoids maintain homogenous morphology through multiple passages and can be recovered after a long-term storage period in liquid nitrogen. The model allows for the study of biliary progenitor cell proliferation, can be manipulated pharmacologically, and may be generated from genetically engineered mice. Future studies are needed to optimize culture conditions in order to increase plating efficiency, evaluate functional cell maturity, and direct cell differentiation. Development of co-culture models and a more biologically neutral extracellular matrix are also desirable.

This protocol describes the production of a mouse extrahepatic bile duct 3-dimensional organoid system. These biliary organoids can be maintained in culture to study cholangiocyte biology. Biliary organoids express markers of both progenitor and biliary cells and are composed of polarized epithelial cells.

Organoids 마우스 Extrahepatic 담 즙 덕트에서의 세대

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

다능성 줄기 세포에서 3차원 인간 간구의 혈청 무료 생산

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...