이 작품은 신경-바이오 회사에 의해 투자 되었다 우리는 그들의 의견 및 조언을 원고에 대 한 박사 조반니 Ferrati와 박사 세르지오로 톤도 (신경-바이오) 감사 하 고 싶습니다.

모든 동물 연구 승인된 프로토콜에서 수행 되었습니다.
참고:이 섹션에서는 실험 절차 동안 수행의 주요 단계 순서와 제안된 시간 간격 (그림 1)를 제공 됩니다. 또한, 프로토콜에 대 한 단계별 설명 (그림 2) 잠복기 후 조직 균질 뇌 제거에서까지 중요 한 작업을 보여주는 설명 패널에 의해 보충 된다. 재료 및 기구 및 WB 분석에 대 한 후속 단계 지침에 관한 내용은 앞에서 설명한22있습니다.
1. 수술 도구, Vibratome 설정 및 치료 준비
참고: 실험 절차를 시작 하기 전에 다음 단계를 실행:
<ol><li>두 다른 인공 뇌 척추 액체 (aCSFs), 뇌 조각화에 대 한 사용을 준비 하 고 인큐베이션 단계에 대 한 다른 이전29설명. 짧게, 두 aCSFs의 (mmol)에서 작업 농도 "슬라이스" 실제는: 120 NaCl, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2.4 CaCl2, 2 MgSO4, 1.2 KH2포4및 10 포도 당; 6.7 HEPES 소금과 3.3 HEPES 산; pH: 7.1. "녹음" 실제 대: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1.3 KH2포4및 10 포도 당; pH: 7.1.</li>
	<li>솔루션을 잘 섞어 다음 얼음에 넣어 하 고 두뇌와 후속 단면을 제거 하는 동안 감기를 가지기 위해 조각화 실제 산소. 녹음 실제를 실 온 (RT)와 공급 산소에서 유지.</li>
	<li>잘린 및 뇌 제거, 즉, 단두대, 수술 해 부 키트 (가 위, 집게, 블레이드), 및 주걱 절 개 후드 악기를 놓습니다.</li>
	<li>슬라이스 두께 (이 준비에서 300 µ m)와 7에 주파수와 6 속도 선택 하 여 vibratome 매개 변수를 설정 합니다. Vibratome 챔버의 적절 한 공간에 삽입 하 고 그것을 포위 하는 얼음.</li>
	<li>"조각화" (실제) 뇌 단면 중 산소 carbogen (95% O2, 5% CO2) 밸브를 엽니다. 최소 유량 2 mL/min의 주위를 선택 합니다.</li>
	<li>테스트 조건을 준비 하 두 15 mL 튜브를 가져가 라. "녹음" 실제의 10 mL T30 2 µ M (대우 그룹)의 농도에 농축 한 튜브는 "기록" 실제 혼자 (제어 그룹) 10 mL와 다른,를 추가 합니다. 와 동 모두 튜브와 설치 준비 단계 (제 3)에서 사용까지 얼음에 그들을 유지.</li>
</ol>2입니다. 마 취, 뇌 추출 및 슬라이스
참고:이 연구에서 9 야생 타입 P14 남성 Wistar 쥐 사용 되었다. 뇌 추출 및 후속 슬라이스 이후 그들은 신속 하 게 수행 해야 (10 분) 이내 방지 하거나 적어도 조직 변성 과정 감속 프로토콜의 중요 한 부분을 구성 합니다.
<ol><li>유도 챔버로 면 레이어에 isoflurane의 100 %w / w 1.5 mL을 추가, 내부, 동물 놓고 뚜껑을 닫습니다. 동물 깊이 취 페달 반사의 부재를 확인 될 때까지 기다립니다 고 단두대를 사용 하 여 동물을 목을 벨.</li>
	<li>계속 차가운 남 비를 포함 하는 내에서 동물의 머리 두뇌 제거 단계 동안 실제 조각화 (그림 2A -C).</li>
	<li>외과 블레이드, 두개골을 통해 피부를 incise 다음 후부 부분에서 중간, 다음가 위를 사용 하 여 두개골을 잘라 고 anteriorly OBs (그림 2A) 위에 뼈를 도달할 때까지.</li>
	<li>옆 뇌 (그림 2B)에 액세스할 수 있습니다 한 쌍의 집게를 사용 하 여 두개골의 두 측면을 당겨. 뇌에 ventrally 주걱을 삽입, 그것을 밖으로, 그리고 그것은 약 5 분 (그림 2C)에 대 한 차가운 "슬라이스" 실제에 충분 한지 체크 해 계속 부드럽게 푸.</li>
	<li>필터 종이에 두뇌를 처분 하 고 (그림 2D) 블레이드를 사용 하 여 소 뇌를 잘라. Vibratome 디스크에 세로로 두뇌 접착제 및 단면 챔버 내부 삽입, 차가운 "슬라이스" 실제 그것을 채울 제공 되며 산소 (그림 2E).</li>
	<li>절단 간격을 조정 하 고 뇌 단면 (그림 2F)와 함께 진행. 앞에서 설명한22로 중간 심장 (MS), Broca (DBB), 그리고 substantia innominata (SI)의 대각선 밴드 등 관심 영역을 포함 하는 섹션을 수집 합니다. 위에서 아래, 3 조각 rostral (R), 중급 (I), 그리고 BF (그림 2G)의 꼬리 (C) 부분을 포함합니다.</li>
	<li>작은 위, 각 섹션 중간 선 따라 분할 취득 두 반사 hemislices (그림 2 H), 개별적으로 제어와 같은 해 부 비행기에서 대우 조건 사용.</li>
	<li>5-10 분, vibratome 챔버에는 hemisections를 계속 한 다음 녹음 실제를 포함 하는 버블링 냄비에 유리 피 펫과 그들을 전송. 복구를 약 30 분 동안 RT에서 유지.</li>
	<li>한편, 혼자 녹음 실제의 3 mL (이전 단계 컨트롤 그룹에 대 한 1.6에서에서 준비)와 함께 3 개의 유리 튜브와 실제 T30 (이전 단계 1.6에서에서 준비) 대우 그룹에 대 한 강화의 3 mL와 함께 3 개의 튜브 작성.</li>
</ol>3. 설치 준비
<ol><li>제어 그룹 (녹색 프레임, 그림 2J) 3 연속 hemislices (rostral, 중간, 및 꼬리 BF 지역 포함) 순서는 hemisections 그들의 해당 유리 튜브 (그림 2I)로 전송 하 고 그들의 대우 그룹 (레드 프레임, 그림 2J)에 대 한 대응을 일치.</li>
	<li>조건 사이 어떤 오염 든 지 방지 하기 위해 제어 hemislices 및 다른 처리 대응에 대 한 두 개의 다른 붓과 뇌 조직의 전송.</li>
	<li>각 유리 유리병 oxygenating 바늘 (21 G) (그림 2J) 제시 해당 뚜껑을 봉인. Carbogen 소스 (그림 2 K) 기구의 주요 튜브를 연결 합니다. 실험 기간 동안 뇌 조직과 기계적 손상의 어떤 움직임을 피하기 위하여 2 mL/min의 최소 유량과 인큐베이션 기간 동안 hemislices에 산소를 제공 합니다. 5 h 부 화를 시작 합니다. 5 분 이내 3.1-3.3 단계를 실행 합니다. 참고: 체크 자주 (매 15-20 분) 모든 튜브에 산소 제공 여부와 흐름 아래에서 조직을 이동 하지 않습니다.</li>
</ol>4. 샘플 균질
<ol><li>부 화 후 산소 흐름을 중지 하 고 튜브에서 모든 뚜껑을 제거 합니다. Hemislices, 얼음 (그림 2 L)에 튜브를 유지 세포의 용 해 버퍼의 250 µ L을 포함 하는 1.5 mL 튜브에 적절 한 브러쉬를 사용 하 여 전송 합니다. 세포의 용 해 버퍼, PBS 1 인산 가수분해 효소와 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 모두에서 1: 100, 희석와 조직 샘플 중 오염을 방지 하기 위해 다른 pestles와 균질. 10-15 분 내에서 이러한 작업을 완료 합니다.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 1000 x g에서 lysate 뇌 원심 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 샘플-80 ° c.에 유지</li>
</ol>5. 단백질 농도 및 서쪽 오 점 분석의 읽기
<ol><li>각 샘플의 단백질 농도 확인 하 고 이후에 aliquots 앞에서 설명한22로 서쪽 오 점 분석을 위한 준비.</li>
	<li>단백질 표정에 치료의 효과 평가 하기 위해 통계 분석을 수행 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes.">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).</li><li>Schliebs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+forebrain+cholinergic+dysfunction+in+Alzheimer's+disease--interrelationship+with+beta-amyloid,+inflammation+and+neurotrophin+signaling.">Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's disease--interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling.</a> Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).</li><li>Schmitz, T. 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X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolically+active+rat+brain+slices+as+a+model+to+study+the+regulation+of+protein+phosphorylation+in+mammalian+brain.">Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain.</a> Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).</li></ol>

저자는 경쟁 금융 관심사를 선언합니다. 수잔 A. 그린 필드는 설립자 이자 신경-바이오 제한, 개인 소유의 회사, 및 보유 주식 회사의 사장. 에마누엘레 땋 고 Antonella Cogoni는 신경-바이오 회사의 직원

잘 설립 비보 전 뇌 기술에 따라,이 프로토콜의 주요 측면 동기적으로 특정의 신청 후에 그들의 응답을 모니터링 같은 해 부 비행기에서 얻은 두 개의 반사 hemislices 테스트를 수합니다 조건 제어 (치료를); 이 따라서 최대한으로 엄격 하 게 제어 하는 실험 패러다임을 제공 합니다. 시간-, 복용량-및 특정 방식으로 서로 다른 neurochemicals 신경 장애에 관련 된 신경 이벤트22, 동안 본 평가의 가능성 필수적인 기능을 나타냅니다. 이 방법론 그 시험관에서 준비, 관심 영역 및 이상적인 extracellular 컨텍스트를 만드는 정확도 등의 생체 내에서 생리 적 환경의 장점을 연결 합니다. 이 프로토콜 나타냅니다 비보 전 electrophysiological 녹음25,,2627 및 광학 이미징28, 널리 이용 되는 절차를 자르는 일반적인 뇌의 적응 29,30또는 생체 외에서 organotypic 조각, 둘 다 구조와 시 냅 스 조직23,24 의 보존 함으로써 가까이 vivo에서 상황을 시뮬레이션 하는 ,3132.
또한,이 절차는 vivo에서부분적으로 복제 하기 때문에 행동 연구에 사용 하는 동물의 수를 줄일 도울 수- 체 외에서 데이터, 세포 배양 등을 확인 하는 채택 했다 수 상태 처럼 고 immunohistochemical 분석 다음 vivo에서 실험을 기대 하 고.
제안 된 방법론 또한 몇 가지 제한 섹션 두께 하지 때 최종 결과 변경할 수 있습니다 무결성 등을 제공 합니다. 보육 시간 그것은 제어 그룹 및 대우 한 사이 비교에 영향을 줄 수 있기 때문에이 기술의 기본 구성 요소 이기도 합니다. 또한, 일련의 절차적 또는 기술적인 문제 발생할 수 있습니다 프로토콜의 모든 단계와 같은: 추출 또는 조직;의 정확 하 고 부드러운 처리에 의해 피할 수 있다 뇌 단면 (1) 기계적 손상 (에 따라서 그것의 무결성에 영향을 미치는 실제 침수 2) 때문에 의하여 바늘을 접촉 하는 경우는 조직 손상 기계적으로 할 수 있는 과도 한 산소 흐름, 외피 동안에 hemislices의 부동. 이 버블링; 최소 속도를 조정 하 여 방지 될 수 있다 (3) 부재 또는 변덕 스러운 산소 흐름, 어떤 관련이 있을 수 있습니다 빈 용기, 손상 또는 단절 튜브 시스템, oxygenating 바늘에 플러그 또는 때 그것은 하지 제대로 몰입에 실제. 이후 지속적인 산소와 절차를 통해 그것의 흐름이이 프로토콜의 가장 중요 한 측면 중 하나를 나타냅니다, 그것은 자주 조사 그룹 간의 균질 상태를 유지 하기 위해 이러한 모든 매개이 변수를 모니터링 하는 것이 중요.
다른 중요 한 단계는 프로토콜에 표시 되는 각 작업을 수행 하는 데 필요한 시간 창이 때 뒤 지 보존 가능한 무결성 및 조직의 기능 만큼. 또한, 이러한 매개 변수를 평가 하 immunohistochemical 분석 앞에서 설명한23,29신경 생존 및 electrophysiological 녹음에 관련 된 특정 마커 검출을 수행할 수 있습니다.
여기서 설명 하는 결과 넘어이 메서드는 디자인 임시 특정 조사에 대 한 될 수 있습니다. 예를 들어, 그것은에 적용 될 수 있습니다: (1) 모니터와 여러 다른 화합물의 활동 비교 뇌 영역, 선택한 솔루션의 실제 등 Neurobasal 매체; 잠복기 (2) 수행 연구에 저 산소 증, 산소 흐름을 각 hemisection;에 선택적으로 제어할 수 있기 때문 (3) 조사; 다른 질병의 유전자 변형 동물 모델에서 뇌 조직 속성 (4) 동시에 같은 해 부 수준에서 vivo에서 일방적인 뇌 주사의 영향을 탐구 하 고 제어 반구;와 그들을 비교합니다 (5) 다른 장기 또는 조직 속성, 따라서 잠재적으로 촉진 및 마약 재판 심사의 길이 줄이고 탐구.

광고는 점진적 신경 장애 entorhinal 외피 (EC), BF, 해 마 (HC), 및 후 각 전구 등의 서로 다른 뇌 영역에 영향을 미치는 만성 병 리 특징 (OB)1,2,3, 4,5. 광고 개발의 후반 단계에서 만드는이 질병 약 모든 경우6의 70%를 차지, 치 매의 가장 일반적인 형태는 진보적인 인식 쇠퇴에 리드. 광고에 발생 하는 초기 단계를 이해 하 광범위 한 시도도 불구 하 고 되지 않습니다 현재 그들 elucidating 정의 실험 표시. 또한, 가장 인기 있는 이론-"녹말 체 가설은"-점점 문제 시 된다 광고 pathobiology도 효과적인7,8 입증 제약 대상 설명에 완전 한 단면도 제공 하지 않기 때문 ,9.
증가 주목 받고 있는 대체 이론 neurodegeneration 중 발생 하는 초기 메커니즘 광고3,,1011 에 주로 감염 신경 클러스터에 관련 된 제안 , 12 , 13 , 14. EC, HC, 및 산부인과15,16등 여러 영역에 BF, midbrain, 및 brainstem, 프로젝트 내에서 포함 하 고이 다른 유형의 세포 허브. 신경 형태학 및 신경 전달 물질 합성에 그것의 다양성에도 불구 하 고 셀의이 핵심 표현 하는 통증 또한 비 효소 기능17,18을 가질 수 있는 일반적인 기능을 공유 합니다. 신호 분자 중재 Ca2 + 복용량, 가용성, 그리고 신경 나이17,18 에 관하여 영양 또는 독성 이벤트를 받을 수 있는 신경 세포로 칼슘 (캘리포니아2 +) 흐름 소설이 아닌 클래식 역할 , 19.
Neurodegeneration, 동안 관찰된 셀룰러 손실 수 있습니다 따라서 연결 될이 비 효소 기능17,,1820는 이다 30mer 펩타이드 (T30) 통증 C-말단은 에서 죽 습에 기인 20. 세포 배양 및 광학 이미징18,21 에 이전 결과 따라 우리 시연, ex vivo 쥐 뇌 조각 T30 유도 하는 BF 구조를 포함에 따라 새로운 접근 방식을 통해 광고 같은 프로필22. 특히,이 새로운 방법론까지 해부학에서 회로 보존, 이기는 하지만 시간의 시간 창 그대로 직물의 특성의 많은 유지 이후 세포 배양 보다 더 생리 적인 시나리오를 제공 합니다. 우리는 T30 응용 프로그램에 심각한 응답을 모니터링 neurodegeneration의 초기 단계에서 일어나는 이벤트를 탐험이 프로토콜을 적용 했다.
뇌를 사용 하 여 문학의 큰 신체에도 불구 하 고 분자 경로 조사 하는 조각 신경 손상에 대 한 묵시적인 또는 신생23,24이 프로토콜 보다 즉각적인 처음으로 제공 하 고 밖으로 읽기에 민감한 비교 organotypic 조각의 일반적인 사용 하. 그러나, 사건으로 organotypic에 대 한 뇌 섹션,이 심각한 슬라이스 절차 또한 채택 될 수 특정 프로세스에서 발생 하는 주요 분자 변화의 발견 신경 또는 신경 분자의 평가 등 여러 가지 목적 immunohistochemical 분석, 및 중앙 신경 조직에 대 한 약리학 적인 분석 실험 병 리 관련.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>S7653</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>P9333</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>S5761</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O))</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>63138</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>P5655</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Hepes salt</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>H7006</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Hepes acid</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>H3375</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>G7528</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Calcium chloride dehydrate</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>223506</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>T30 peptide</td><td>Genosphere Biotechnologies, France</td><td></td><td>AChE-derived peptide tested</td></tr><tr><td>Surgical dissecting kit</td><td>World Precision Instruments, USA</td><td>Item #: MOUSEKIT</td><td>Brain removal step</td></tr><tr><td>Surgical blades</td><td>Swann-Morton, UK</td><td>BS 2982</td><td>Brain removal step</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>11566873</td><td>Brain preparation for slicing</td></tr><tr><td>Glue</td><td></td><td></td><td>Brain preparation for slicing</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, Germany</td><td>VT1000 S</td><td>Slicing</td></tr><tr><td>Brushes</td><td></td><td></td><td>Tissue handling</td></tr><tr><td>Oxygen canister</td><td></td><td></td><td>Sectioning and incubation phase</td></tr><tr><td>1x Phosphate buffer saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>BP2438-4</td><td>Homogenization step</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitors</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>1284-1650</td><td>Homogenization step</td></tr><tr><td>Protease inhibitors</td><td>Roche complete PIC, USA</td><td>4693116001</td><td>Homogenization step</td></tr><tr><td>Pestles</td><td>Starlab, UK</td><td>I1415-5390</td><td>Homogenization step</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660 nm Protein Assay</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>22660</td><td>Protein concentration</td></tr></tbody></table>

an alternative approach to study primary events in neurodegeneration using ex vivo rat brain slices

기본 neurodegeneration을 처리 하는 기본을 반영 하는 신뢰할 수 있는 동물 모델 개발을 시도 하는 수많은 연구에도 불구 하 고 거의 널리 허용 되었습니다. 여기, 우리는 유명한 비보 전 뇌 조각 기술는 가까이 vivo에서제공에서 적응 하는 새로운 절차 제안- 생체 외에서 준비로 세포 변성을 트리거링 초기 이벤트 조사에 대 한 보다 시나리오 처럼 Alzheimer의 질병 (광고)에서 관찰 됩니다. 선택 된 두뇌 지구 및 생리 적인 환경에서의 로컬 기능 해 부 cytoarchitecture의 보존을 가능 하 게 간단 하 고 쉽게 재현 가능한 단계,이 변이 의하여 이루어져 있다. 다른 해 부 지역 사이트-, 복용량-및 시간에 따른 방식으로 문제의 치료와 여러 실험을 수행할 수 있는 기회를 제공 하는 동일한 뇌에서 얻을 수 있습니다. 이 방법론에 관련 된 결과 영향을 미칠 수 있는 잠재적인 제한 조직, 즉, 자국과 인큐베이션 단계와 섹션 두께 동안 해부학의 무결성의 유지 관리의 보존에 관련 된 어떤 생화학 및 immunohistochemical 분석을 좌우할 수 있다. 이 방법은 생리 적 또는 병 적인 조건, 마약 검사, 또는 복용량 응답 분석 실험에 참여 하는 분자 메커니즘을 탐구 하는 등 다른 용도로 사용할 수 있습니다. 마지막으로,이 프로토콜 또한 동물 행동 연구에서의 수를 줄일 수 있습니다. 여기에서 보고 된 응용 프로그램은 최근 설명 되었고 슬라이스에 비보 전 쥐 뇌 기저 개 (BF)는 광고에 주로 영향을 대뇌 영역 중 하나를 포함 하는 처음으로 테스트. 특히, 그것은 입증 되었습니다 acetylcholinesterase (통증)의 C-말단에서 파생 된 독성 펩 티 드의 트리거링, BF의 antero 후부 축 차동 식의 광고와 같은 프로 파일을 프롬프트 수 있습니다. 단백질 alpha7 nicotinic 수용 체 (nAChR α7), 등의 광고에서 변경 phosphorylated (p-타우), 타우 및 아 밀 로이드 베타 (Aβ).

여기에 제시 된 프로토콜 나타냅니다 독성 펩 티 드, T30, 관리 사이트-종속 방식에서 p α7 nAChR의 표현을 변조-타우, 그리고 Aβ BF-포함 된 섹션 (그림 3A). Nicotinic 수용 체의 제어 대응에 비해 rostral 처리 hemislice에서는 크게 증가 (슬라이스 1, p = 0.0310) (그림 3B), 동안 중간 슬라이스 두 가지 조건 (사이 어떤 변화를 공개 하지 않습니다 슬라이스 2, p = 0.1195) (그림 3B). 후부 섹션에서 상당한 감소의 제어 측면에 T30 노출 부분에는 (슬라이스 3, p = 0.0476) (그림 3B). T30 응용 프로그램에 따라 p-타우 레벨은 측면을 일치 하는 컨트롤에 대 한 전방 지역에서 크게 증가 한다 (슬라이스 1, p = 0.0158) (그림 3C). 다른 한편으로, 다른 두 BF 포함 된 섹션 조건 사이 상당한 차이 표시 하지 않습니다 (슬라이스 2, p = 0.1014; 슬라이스 3, p = 0.6405) (그림 3C). T30 노출, Aβ는 크게 향상 된 rostral와 중간 hemisections 그들의 치료 contralateral 부분에 비교 될 때에 (슬라이스 1, p = 0.0136; 슬라이스 2, p = 0.0109) (그림 3D). 꼬리 조각에는 2 개의 처리 사이 변화가 없습니다 (슬라이스 3, p = 0.1231) (그림 3D). P-타우에 대 한 1 차적인 항 체 epitope phosphorylated Ser202 잔류물을 포함 하는 인식 합니다. Aβ에 대 한 1 차적인 항 체 여러 isoforms, Aβ37에서 Aβ42까지를 검색 합니다. 데이터는 2를 사용 하 여 앞에서 설명한22 쌍체 t검정으로 분석 되었다-테스트 및 SEM. N으로 표현 =은 (그룹 당 hemislices 쥐) (27, 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57507/57507fig1.jpg"> 그림 1: 시퀀스 및 주요 단계를 나타내는 타이밍 실험 절차 동안 수행. 첫 번째 및 세 번째 단계를 완료 하는 시간 간격 연산자의 경험 수준에 관하여 달라질 수 있습니다. <a href="/files/ftp_upload/57507/57507fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57507/57507fig2.jpg"> 그림 2: 프로토콜 진행을 보여주는 일련의 단계. (A-D) 두개골과 두뇌의 나머지에서 소 뇌의 분리에서 두뇌의 추출. Vibratome 디스크에 전송 해 부 챔버, 얼음으로 둘러싸인 고 가득 찬 실제 끊임없이 부 러 뜨 리는 하는 동안 산소에 두뇌의 (E) 첨부 합니다. (F) 코로나 뇌 단면입니다. (G) rostral (R), 중급 (나), 그리고 기저 개의 꼬리 (C) 구조과는 조각의 컬렉션입니다. (H) 두 일치 hemislices에 섹션의 분리. (나) 각 hemisection는 해당 유리병에 배치 됩니다. (J) 튜브 지원 장치 상자 안쪽에 배치 하 고 별도로 폐쇄 합니다. (K) 인큐베이션 기간 산소 소스 (검은 원) 시스템의 연결 시. 치료 후 샘플 (L) 균질 이 그림22에서 수정 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57507/57507fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57507/57507fig3.jpg"> 그림 3: T30 중재 p α7 nAChR의 특정 표현-타우, 그리고 BF rostro 꼬리 축 Aβ. (A) 뇌 코로나 조각 기저 개 핵 (흰색 점선), 두 개의 보완적인 부분에서 분할 하 고 서로 다른 조건에 노출 등의 표현입니다. (B) 후 T30 노출, nicotinic 수용 체 앞쪽 서브 (T30 1)와 하나 (T30 3) 해당 제어 측면 (ctrl 1 및 ctrl 3)에 비해 뒷부분에 표시 된 감소에 상당한 증가 보여줍니다. 중간 조각 팬 들은 두 가지 조건 (ctrl 2, T30 2) 사이의 변경의 정보를 표시 하지 않습니다. (C) p-타우 식이 끝났습니다 치료 rostral 부분 (T30 1)에 상당히 높은 제어 일치 대응 (ctrl 1), 반면 다른 두 조각 (슬라이스 2와 슬라이스 3) 두 그룹에 어떤 차이 공개 하지 않습니다. (D) Aβ는 앞쪽에 및 중간 처리 세분 (T30 1과 T30 2)의 해당 치료 면 (ctrl 1 및 2 ctrl)에 비해 크게 증가 표시 됩니다. 꼬리 부분에서는 두 그룹 사이의 아무 변화입니다. 오차 막대 표시 SEM. * p < 0.05.n =은 (그룹 당 hemislices 쥐) (27, 9). 눈금 막대는 1 m m 이다. 이 그림22에서 수정 되었습니다. <a href="/files/ftp_upload/57507/57507fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

선물이 추가 neurodegeneration 기본 초기 이벤트에 대 한 통찰력을 제공할 수 설립된 전 비보 두뇌 기술에 기반 한 메서드가 vivo에서 그리고 생체 외에서 실험의 장점이 결합. 또한, 같은 해 부 비행기에서 치료 및 치료 그룹의 직접 비교를 위한 독특한 기회를 나타냅니다.

Neurodegeneration Ex Vivo 쥐 두뇌 분할 영역을 사용 하 여 기본 이벤트를 공부 하는 양자 택일 접근

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

6.9K 조회수.  Culham Science Centre. 선물이 추가 neurodegeneration 기본 초기 이벤트에 대 한 통찰력을 제공할 수 설립된 전 비보 두뇌 기술에 기반 한 메서드가 vivo에서 그리고 생체 외에서 실험의 장점이 결합. 또한, 같은 해 부 비행기에서 치료 및 치료 그룹의 직접 비교를 위한 독특한 기회를 나타냅니다.

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Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

출생 후 신경 발생의 연구 Organotypic 슬라이스 문화

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

연구

발생학

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

노화와 아밀로이드 병리 동안 시냅틱 얼터 레이션의 연구에 대한 고양이와 트렌스 제닉 마우스의 급성 Hippocampal 조각의 준비

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

신경과학

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

쥐 뇌 조각에서 뉴런의 Vibrodissociation는 시냅틱 전송 및 이미지 Presynaptic 터미널 공부

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

의학

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

뇌 슬라이스 바이오 티 닐화 :<em&gt; 전의 VIVO</em성인 뉴런에서 지역 고유의 플라즈마 막 단백질 인신 매매를 측정하는&gt; 접근

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

에서 신경 혈관 리모델링의 분석 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

최적화 된 N를 사용 하 여 급성 뇌 조각의 준비-메 틸-D-glucamine 보호 복구 방법

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

<meta charset="utf8"></head><body>성체 설치류에서 해마의 등쪽 극에서 급성 뇌 절편 준비

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

성체 설치류에서 해마의 등쪽 극에서 급성 뇌 절편 준비

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

급성 마우스 뇌 슬라이스 자발적인 해 마 네트워크 활동을 조사

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