저자 그의 지원 및이 분석 실험의 초기 개발에 대 한 지침에 대 한 변환 과학 발전, 건강의 국가 학회에 대 한 국립 센터에서 페 러 마크를 인정 하 고 싶습니다. 또한, 우리는 그들의 과학적인 입력 및 토론으로 프로젝트 팀 구성원에 대 한 앨리슨 프리먼, Mariela Jaskelioff, 마이클 애 커, Jacob Haling, 및 Vesselina 쿡을 감사 하 고 싶습니다.

1. 1536-좋은 3D 종양 Spheroids의 배양
<ol><li>Dulbecco의 수정 이글스 매체 (DMEM/F12)의 500 mL를 다음과 같은 시 약을 추가 하 여 신선한 3D 종양 회전 타원 체 중간 줄기 (셀 매체 녹아웃 혈 청 교체 + 인슐린-처리가-셀레늄) 준비: 1 x 페니실린/스, 인간의 10 ng/mL 기본적인 섬유 아 세포 성장 요소 (bFGF), 인간 표 피 성장 인자 (EGF), 0.4% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) (분수 V), 인슐린-처리가-셀레늄, 및 1% 녹아웃 (KO) 혈 청 교체 (할 하지 동결-해 동) x 1의 20 ng/mL.</li>
	<li>필터-소독 0.4 µ m 병 상단 필터 시스템을 통해 보충 교재를 가진 전체 매체.</li>
	<li>그들을 세척 하 여 전통적인 세포 배양 플라스 크에서 권장된 일상적인 문화 조건에 따라 성장 암 세포 라인 분리 3 x 1 x 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 0.25 %trypsin (1 mL의 적절 한 금액을 추가 5 cm2) 당 5 분 셀 위에 얇은 레이어를 만듭니다. 혈 청을 포함 하는 매체의 금액 x 5 트립 신을 중화 하 고는 셀 이동 합니다. 예를 들어 5 ml의 트립 신 매체의 25 mL를 사용 합니다.</li>
	<li>씨앗 잘 회전 타원 체 매체의 8 µ L 당 500 세포의 총 1536-잘 조직 문화 취급 판으로 위해 104 셀/mL x 62.5에 셀 용액의 농도 조정 합니다.</li>
	<li>생물 안전 캐비닛, 연동 펌프-기반 시스템으로 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트를 사용 하 여 셀을 시드하십시오. 다른 셀 라인 사이 PBS와 70% x 1 카세트의 튜브를 플러시 에탄올 10 s.</li>
	<li>또는, 종자 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트와 연동 펌프 또는 셀 줄 필요 번호판의 번호에 따라 연결 된 주사기 펌프를 사용 하 여 HEPA 필터 룸 내에 있는 액체 처리기를 사용 하 여 셀.</li>
	<li>수동으로 사용 하 여 통기성 접착 판 도장 중 또는 접시 마감재를 사용 하 여 접시를 봉인.</li>
	<li>10 rpm와 5% 이산화탄소 (CO2)와 95% 상대 습도 37 ° C에서 설정 회전 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 3 d 형태를 spheroids 수 있습니다.</li>
</ol>2. 1536-잘 2D 암 라인의 경작
참고: 1536-잘 2D 암 라인 3D 판 화합물의 추가 하기 전에 24 시간 배양 한다.
<ol><li>선택한 라인에 대 한 적절 한 성장 매체의 500 mL를 다음과 같은 시 약을 추가 하 여 2D 암 세포 매체를 준비: 페니실린/스와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) x 1.</li>
	<li>필터-소독 0.4 µ m 병 상단 필터 시스템을 통해 보충 교재를 가진 전체 매체.</li>
	<li>분리 그들을 세척 하 여 전통적인 세포 배양 플라스 크에서 권장된 일상적인 문화 조건에 따라 성장 암 세포 선, PBS와 0.25 %trypsin (5 c m2당 1 mL)의 적절 한 금액을 추가 하는 5 분 x 1 3 x 셀 위에 얇은 레이어를 만듭니다. 혈 청을 포함 하는 매체의 금액 x 5 트립 신을 중화 하 고는 셀 이동 합니다. 예를 들어 5 ml의 트립 신 매체의 25 mL를 사용 합니다.</li>
	<li>씨앗 잘 완전 한 매체의 8 µ L에서 당 500 세포의 총 1536-잘 조직 문화 취급 판으로 위해 104 셀/mL x 62.5에 셀 용액의 농도 조정 합니다.</li>
	<li>생물 안전 캐비닛, 연동 펌프-기반 시스템으로 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트를 사용 하 여 셀을 시드하십시오. 다른 셀 라인 사이 살 균 PBS와 70% x 1 카세트의 튜브를 플러시 에탄올 10 s.</li>
	<li>또는, 종자 소독, 작은 스테인레스 스틸 밀고 카세트와 연동 펌프 또는 셀 당 격판덮개의 볼륨에 따라 연결 된 주사기 펌프를 사용 하 여 HEPA 필터 로봇 룸 내에 있는 액체 처리기를 사용 하 여 셀 선 필요입니다.</li>
	<li>수동으로 사용 하 여 통기성 접착 판 도장 중 또는 접시 마감재를 사용 하 여 접시를 봉인.</li>
	<li>10 rpm 및 복합 추가, 5% CO2 와 95% 상대 습도와 이전 24 시간 동안 37 ° C 설정 회전 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
</ol>3. 복합 추가
<ol><li>10 m m 최고 농도와 액체 처리 로봇에 100% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에 MAPK 억제제의 8 포인트, 3-fold 직렬 희석을 준비 합니다. 프로테아좀 억제제 Bortezomib 분석 결과의 동적 범위를 결정 하기 위해 죽이 완전 한 셀에 대 한 긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다.</li>
	<li>빠른 스핀 모든 시험 접시와 든 수집을 100 x g에서 복합 플레이트. 각 접시에서 접착 씰을 제거 하 고 8 총을 추가 하는 음향 분배기 설정에 접시를 놓고 각 화합물/희석 대표 하는 잘 당 0.1 %DMSO 최종 농도 10 µ M의 최고 복합 복용량의 nL.</li>
	<li>화합물의 추가 완료 되 면, 주문 품, 스테인레스 스틸 셀 문화 뚜껑 접시에 증발을 방지 하 고 5d, 5% CO2 와 95% 상대 습도 대 한 37 ° C에서 회전 인큐베이터에 접시를 장소를 장소.</li>
</ol>4. 검출 시 약 추가 및 원시 데이터의 취득
<ol><li>전 따뜻한 실내 온도에서 세포 증식 또는 37 ° C 물 욕조에 아데닌 3 인산 염 (ATP)에서 변화 하 고, 따라서, 변화를 감지 하는 소를 포함 하는 셀 세포 시 약의 적절 한 볼륨. 검출 시 약의 3 µ L의 총 각 잘 연동 펌프를 사용 하 여를 추가 하 고 적어도 15 분 동안 실내 온도에 격판덮개를 품 어.</li>
	<li>플레이트 루미 노에 발광을 캡처하십시오.</li>
</ol>5입니다. 데이터 처리
<ol><li>악기에서 원시 데이터를 추출 하 고 중립 제어로 혼자 DMSO를 포함 하는 모든 우물의 평균 시험 화합물을 포함 하는 모든 필드를 정상화. 이 값에서 각 화합물의 백분율 성장 저해를 계산 합니다. 이 Microsoft Excel에서 수식 함수를 사용 하 여 완료 되 면 어디 f (x) = {(샘플 값은 상대적인 빛 단위 (RLUs) / (평균 DMSO 값 RLUs) * 100)}.</li>
	<li>그래프 프로그램을 사용 하 여 복합 농도 대 한 단계로 5.1에서 정규화 된 데이터의 값을 그래프에 의해 복용량 응답 곡선 및 금지 IC50s를 생성 합니다. 참고: 우리는 헬 리오스, 내부 NIBR 소프트웨어 도구를 사용 하 여 데이터를 분석. 이 기능을 완료 하려면 우리는 비패라메트릭 곡선 분석 도구를 선택.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lee, M., Vasioukhin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+polarity+and+cancer--cell+and+tissue+polarity+as+a+non-canonical+tumor+suppressor.">Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).</li><li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research:+Focus+on+tumor+spheroid+model.">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology &amp; Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li><li>Weigelt, B., Ghajar, C. 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Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice.</a> PLoS One. 5 (5), e10786 (2010).</li><li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li><li>Bhargava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Registered+report:+RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth.">Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Elife. 5, e09976 (2016).</li><li>Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. 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저자는 노바 티 스의 직원 그리고 일부 직원 들도 주주.

여기에 제시 된 방법을 대규모 복합 검 진을 위해 1536-잘 접시에 종양 spheroids를 생산 하는 방법에 대 한 상세한 프로토콜을 보여 줍니다. 이러한 방법은 종양 spheroids 유전 종속성 및 복합 감도13, 에 대 한 질문 6-잘, 96 잘 접시에 낮은 처리량 분석 실험에서 성장 했다 국립 암 연구소에 직장에서 처음 적응 했다 14 , 15.이 프로토콜의 중요 하 고 독특한 기능은 spheroids 1536-플레이트를 사용 하 여 정의 된 전통적인 2D 조직 배양 세포에서 형성 되는 미디어 SCM + 코 + ITS 라고. 일단 셀에 씨를 뿌리고, 그들은 3 d 회전 타원 체 형성의 기간 동안 어떤 증발을 방지 하기 위해 숨 접착제 열판으로 봉인 됩니다. Spheroids 사용 하 여이 접근16시간의 긴 기간 동안 또한 배양 수 있습니다. 구체 형성의 3 d, 후 화합물 용균성 기반 확산 시 약으로 세포 성장에 변경 시 금 전에 5 d에 대 한 추가 됩니다. 제어 우물과 2D 대 에서 경작 하는 세포 사이 IC50s의 계산을 정규화 후 3D, 화합물 취급 셀에 변경 내용을 제어 처리 셀에 비교 됩니다.
1536-잘 접시는 일반적인 조직 처리 접시 고 아니라 하이드로 겔 코팅 또는 셀-구 충 제 접시,이 프로토콜의 한계는이 프로토콜의 성공적인 실행에 중요 한 요소는 정의 된 매체를 사용 하 여. 고 혈 청 대체 처음 성공적으로 3D17 에서 배아 줄기 세포의 성장에 도움이 하는 기능에 대 한 테스트 및이 프로토콜에 맞게 조정 되었습니다 많은 종양 회전 타원 체 라인13,15, 의 성장에 대 한 18 , 19. 마약 감도의 차동 효과 성장 형식에 의해 중재는 시연, 미디어 조건이 다른 2D의 성장 세포 대 3D spheroids에 대 한, 비록 우리는 이전 주의 하 고 단순히 미디어 구성9차이.
문제 해결 단계와이 프로토콜의 성공을 보장 하는 일련의 분석 결과 개발 실험 처음 대형 화면에 착수 하기 전에 각 셀 라인을 최적화 하기 위해 실시는 좋습니다. 이 예제에서는 모든 셀 라인 분석 처음 그들이 잘 당 500 세포의 동일한 시작 밀도에 시드 수 경우 확인 하려면 평가 했다. 그들은 다음 DMSO 전용 번호판을 표준 편차 (SD)와 성장 기의 기간에 대 한 분산 (CVs)의 계수 검사로 분석 했다. 심지어 장소에서이 분석 결과 개발, 특정 다른 사람 보다 더 빨리 성장와 시드 밀도이 더 어려운 라인의 실험 기간을 더욱 최적화에 도움이 되었을 것 이다. 마지막으로, 여기에 제시 된 데이터는 경향 보다는 보편적인 현상, 특정는 NSCLC 같은 셀 라인 라인 Calu-6 차원에서 성장 그에 비해 3d에서 MAPK 통로 대상으로 하는 화합물에 고유 하 게 더 민감한 보여 줍니다. 추가 실험 어떤 생물 학적 메커니즘 크롤링으로 조절 감도이 눈에 띄는 차이를 확인 하려면 진행 되 고 있습니다.
울트라-HTS 설정에서 화면 spheroids 수 초기에 약물 검색 프로세스에서 사용 될 3D 문화를 허용 하 고는 3D 설정에서 활성화 하는 새로운 화학 물질의 식별을 가능 하 게 수 있습니다. 너무 많은 임상 후보 성장 억제에 시험관 및 회귀에 vivo에서보여주는 이기는 하지만 결코 환자에 효능의 부족으로 인해 시장에 도달, 팀 시작 했습니다 심문 여부 분석 실험 3D를 구현 할 수 있었다 검색 프로세스 동안 이전이 간격을 연결 합니다. 96-잘 또는 384-잘 방법을 사용 하 여 때 다른 접시 종류의 숫자 문화 셀 3D에 존재 합니다. 여기, 우리는 개별 spheroids의 여러 foci 생산 1536-잘 방법을 제시 했습니다. 미래에 이러한 결과 셀 상품, 교수형으로 성장할 수 있습니다.는 1536-잘 접시 또는 격판덮개는 하이드로 겔/Matrigel 코팅 되 있으며 라운드-하단, 같은 개발 하는 새로운 기술을 사용 하 여 비슷한 화면 비교 될 수 있습니다. 잘 당 한 구의 형성에 대 한 수 있습니다. 이러한 조건 심사, 심지어 더 순수 관련, 그들을 만들기 위해 사용 하는 문화 조건에 복잡성의 추가 레이어를 소개 것 및 잠재적으로 소설에 대 한 머리 맡에 벤치에서 번역의 증가 속도 나타내는 수 있습니다. 요법입니다. 이러한 기술 더 큰 spheroids의 사용을 요구 하는 저 산소 증 또는 확산 그라디언트를 포함 하는 과학적인 질문을 설정할 것.
방법 제시 여기 이들이 spheroids 화합물의 분자 라이브러리에 대 한 심사에 초점. 미래에 이러한 방법을 수 소설 biologics 및 bi-특정 항 체 또는 항 체 약물 어원이 같은 말, 3D 문화 더 순수 관련 항 체 항 원 상호 작용을 제공할 수 있습니다 같은 biotherapeutics에 대 한 화면을 확장 합니다. 또한, 3D spheroids 사용 하 여 이해 목표와 신흥 면역-종양학 공간21개입 질병 관련 분석 실험 개발에 중요 한 있을 수 있습니다.

지난 10 년간에서 점점 더 많은 연구는 성장 하는 세포 차원에서 플라스틱에 의해 완전히 지 하지 개념 이해 3D 셀 문화 모델의 사용을 구현 했습니다. 이러한 개념의 예 생존 및 세포 운명 조절에 세포 외 매트릭스의 역할 뿐 아니라 정상 상피 세포 극성1 셀의 꼭대기와 기저 계층의 공간적 방향이 손실에 교대를 포함 합니다. 종양학 연구, 특히, 암 세포와 2D 및 3D 셀 문화 시스템3,4간의 차이의 기본적인 생물학을 이해 하 3D 모델을 사용 했다. 더 정교한 셀 문화 기술과 멀티 잘 포맷을 더 그들의 적응의 개발은 3D 설정에서 새로운 약물에 대 한 검색을 활성화 하 고 있다. 셀과 달리 성장 조건 하에서 2D, 3D 모델 종양 범위 복잡 한 계층화 된 셀룰러 시스템5 에서 다양 한 크기의 단일 셀 유형 분야에서에서의 복잡 한 cell 타입 분야6,7, 8. 소설 화합물 또는 potently 이러한 3D 모델 시스템에 세포 죽음을 유도 하는 생물 의약품의 발견은, 따라서, 약물 개발 캠페인에 높은 관심의. 이 분석 실험의 끝점 종종 세포 증식에 변화를 평가 하기 위해 2D 문화에서 그와 동일 하지만 더 순수 관련 설정에서 실시 하는 때 그들은 대상 유전자 나 통로가 되는 종속성의 진정한 수준을 드러낼 수 있습니다. 심문.
대부분 중 96 또는 384-잘 결정 접시를 사용 하 고 높은 처리량 검열 (HTS) 형식에서 자주 사용 한다에 쉽게 적응 하지 않습니다 하지만 모델 시스템의 다양 한 3D 문화 시스템에 약물 응답 공부 하 개발 되어 위의 도입, 약물 발견 심사 캠페인입니다. 이러한 시스템 물방울 기술, 회전 타원 체 문화, 공중 부양, 그리고 자연 또는 합성 젤 콜라겐, Matrigel, 또는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)2 등을 통합 하는 문화를 유도 하기 위해 마그네틱 입자와 셀 pulsating 매달려의 사용을 포함 . 여기, 우리는 1536-잘 접시 형태로 설립된 암 세포 선에서 3D 회전 타원 체 문화 생산 이전 개발 기술의 상세한 방법 제시. 이 프로토콜 높은 정의 매체 사용 일반적으로 부착 셀 라인9의 부착을 방지 합니다. 이 시스템에 제한 사항 (즉, 그것은 완전히 암의 복잡 한 모델 시스템 정리 수 없습니다), 하지만 그럼에도 불구 하 고,이 분석 실험 작은 분자의 대규모 컬렉션 및 약 응답의 십자로 비교의 높은 처리량 검열 다양 한 세포 및 화합물에 대 한 2D 및 3D 문화 사이
셀 라인 MAPK 신호 통로, 통로 높은 암, dysregulated에 관련 된 유전자의 모든 항구 돌연변이 들이 문서의 방법 보여 선택 하 고 있는 많은 치료제에 대 한 사용할 수 있습니다. 라인의 많은 키 얼 스 틴 쥐 육 종 바이러스 라고도 KRA, 신경 RAS 또는 NRAS, 하 비 쥐 육 종 바이러스 oncogene 또는 HRA, 및 관련된 kinases 빠르게 가속 Fibrosarcomas, 일컬어 종양 돌연변이 활성화 Raf는. 최근 문학이이 통로의 다른 노드의 억제제 셀 라인 3D 조건9,10에서 성장 될 때의 하위 집합에 고유 하 게 더 효능을 제안 합니다. 때 활성 RAS와 암 세포 차원에서 교양 있었다, 그들은 증가 감도 MAPK 억제제를 시연 하 고 또한,이 접근 경로 확인할 수 및 전통적인 2D에서 놓친 억제제를 대상으로 한 연구 발견 설정합니다. 이 연구의 목표는 이러한 셀 라인 문화 하는 데 사용 하는 방법을 제시 하 고 또한, 차등을 보여 주기 위해 3D를 사용 하는 경우에 관찰 될 수 있는 이러한 억제제에 대 한 응답 문화 시스템 세포.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2006</td>
			<td>Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-604F</td>
			<td>Purchased as a prepared solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-115Q</td>
			<td>Purchased as a prepared solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Seradigm</td>
			<td>1500-500</td>
			<td>Purchased as a prepared solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td>Purchased as a prepared solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td>Purchased as a prepared solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Resuspend in sterile water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644</td>
			<td>Resuspend in sterile water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td>Resuspend in sterile PBS and filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Insulin Transferrin Selenium (ITS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% KnockOut (KO) Serum Replacement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Add fresh right before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276855-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G7573</td>
			<td>Purchased as a prepared solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Combi Cassette</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>24073295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Multiflow Cassette</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>294085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1536-well sterile TC plates (white)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1536-well sterile TC plates (black)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scivax Plates</td>
			<td>MBL International</td>
			<td>NCP-LH384-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesives seals</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Incubator</td>
			<td>LiCONiC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Lids</td>
			<td>The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATS Acoustic Dispensor</td>
			<td>EDS Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo Acoustic Dispensor</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Envision-Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump- Multidrop Combi</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Handler-Multiflow FX</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of high-throughput three-dimensional tumor spheroids for drug screening

암 세포는 정기적으로 플라스틱 표면에 2 차원 (2D)에서 경작 되었습니다. 그러나이 기술은,, 부족 진정한 환경 종양 질량에 비보에 노출 됩니다. 단단한 종양 시트 플라스틱, 첨부로 성장 하지만 3 차원 (3d) 클론 셀의 컬렉션으로 대신 그들의 이웃, 그리고 정상적인 세포 극성의 파괴와 같은 독특한 공간 속성의 상호 작용 공간. 이러한 상호 작용 종양 vivo에서 더 관련 된 형태학 및 세포 특성을 얻으려고 3 차원 배양 세포를 발생할. 또한, 종양 질량은 다른 세포 유형 stromal 및 면역 세포 뿐만 아니라 다른 모든 세포 유형에 서 세포 외 매트릭스와 직접 접촉에. 입금 매트릭스 고분자 콜라겐과 fibronectin 같은 구성 되어 있습니다.
머리 맡에 벤치에서 종양학에서 연구 결과의 번역을 증가 하는 시도에 많은 그룹 그들의 약 개발 전략에서 3D 모델 시스템의 사용을 조사 하기 시작 했습니다. 이러한 시스템은 종양의 복잡 하 고 이기종 환경 정리 하려고 하기 때문에 더 많은 생리 적으로 관련 된 것으로 생각 된다. 그러나 이러한 시스템은,, 매우 복잡할 수, 그리고, 비록 의무가 96 잘 형식과 384에도 지금 일부에서 성장, 그들은 대규모 성장 및 심사에 대 한 몇 가지 옵션 제공. 이 관찰 간격 여기 문화 종양 spheroids 1536-잘 접시의 높은 처리량 용량에 세부 사항에서 설명 하는 방법의 개발을 주도하 고 있다. 이 메서드는 매우 복잡 한 매트릭스 기반 시스템, 화면, 그리고 기존의 2D 분석 하기 어려운 타협을 나타냅니다. 은닉 다른 유전자 돌연변이 암 세포 라인의 다양 한은 성공적으로 상영 Mitogen-Activated 단백질 키 니 아 제 또는 MAPK 통로 대상으로 하는 화합물의 큐레이터 라이브러리를 사용 하 여 복합 효능을 검사. 회전 타원 체 문화 응답 그런 다음 2d, 성장 하는 세포의 응답에 비교 하 고 차동 활동 보고 됩니다. 이 메서드는 복합 활동 높은 처리량 3D 설정에서 테스트를 위한 고유 프로토콜을 제공 합니다.

여기에 설명 된 방법을 사용 하 여 2D 문화 조건 하에서 잘 성장 하는 것으로 알려져 라인 테스트 설립된 암 세포의 다양 한. 대표 이미지 MAPK 돌연변이 암의 다양 한 세포 라인 (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-멜-30:NRAS, 및 학회-62:HRAS) 그림 1에서 볼 수 있습니다. 이러한 이미지는 셀 라인을가지고 있지만 다양 한 형태학, 각각 형성 3D 구조 분석 결과 1536-잘 접시에서 보여 줍니다. 그림 2 는 보여줍니다, 대규모 심사를 위해 사용 될 때 3D에서 2D 대 에 성장 하는 문화 사이의 차동 복합 감도 관찰할 수 있습니다. 그래프에 각 점 대표 한 화합물의 억제 농도 50% 셀 살인 나 두 설정에서 화합물의 IC50 응답. 효과 다른 미디어에 의해 전적으로 중재 하지 보여, Calu-6 셀 2D 조직 배양 플레이트 또는 첨부 파일을 방지 하는 3D Scivax biofilm 접시를 사용 하 여 동일한 미디어에 교양 있었다. 감도 증가 또는 3D 성장 조건에 대 한 더 낮은 IC50 같은 미디어에 두 화합물에 대 한 보충 그림 1 에 표시 됩니다. Calu-6 같은 라인 SK-멜-30 같은 라인은 3d 2D에 비해 덜 민감한 3D 조건 하에서 성장 될 때 화합물에 증가 된 감도 보여줍니다. 표 1이이 화면에 사용 된 모든 셀 라인에 대 한 추가 배경 정보를 포함 합니다.
대표 복용량 응답 곡선의 예는 그림 3에서 시각화 됩니다. 이 그림의 두 화합물, RAF265 차동 효능을 보여 줍니다 (그림 3A)와 RAF709 (그림 3B)는 RAF kinases의 활동을 억제. 두 화합물은 3D에 더 강력한 Calu-6, 비 작은 세포 폐 암은 조건 라인 은닉 Q61K, KRA 단백질에 활성화 돌연변이. 같은 시간에 두 화합물 3D spheroids 및 HCT116 대 장 암 선, KRA의 G13D 활성화 돌연변이 포함에서 2D 문화에서 마찬가지로 강력한 있습니다. 감도 증가의 효과 의해 중재가 입증을 3D 와 2D와 단순히 다른 미디어 조건, Calu-6 셀의 성장 조건 FBS를 사용 하 여 두 조건 하에서 성장 했다. 2D 및 3D 조건 FBS를 사용 추가 그림 1, 본, 3D 문화는 여전히 낮은 IC50 생산 화합물에 감도 증가 보여 줍니다.
마지막으로, 3D 분석 결과 또한 RAF 이합체 이합체-독립적인 통로 그리고 매우 활성화 된 RAS 돌연변이 라인에의 한 불완전 한 저해 때 발생 알려져 역설적 성장 활성화의 현상의 관찰을 허용 활성화 BRAF V600E 돌연변이11,12에서 발견. 그림 4에서 볼 수이 활성화 치료 학회-62에서 3D 조건 하에서 BRAF 억제 물 Dabrafenib, HRAS 돌연변이 작은 세포 폐 암 선 고도 비정형 BRAF 돌연변이 췌 장 세포에 라인 BxPC-3. 성장, 약의 낮은 농도에서 활성화 되 고 성장만 약물 (그림 4B)의 높은 농도에서 억압 된. 이 활성화 되지 놀랍게도 KRA 돌연변이 라인 Calu-6에 보였다 이며 BRAF V600E 돌연변이 라인 A375 예상 될 것이 지. 우리는 다른 3D 성장 모델 (데이터 표시 되지 않음)를 사용 하 여 Calu 6의 역설적인 활성화를 관찰 했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57476/57476fig1.jpg"> 그림 1: 3D 1536-잘 접시에서 성장 하는 암 세포의 대표 이미지. 셀 시 약 디스펜서 및 작은 카세트를 사용 하 여 1536-잘 접시에 3 d의 총에 대 한 도금 했다. 브라이트 필드 이미지를 4 X 렌즈를 사용 하는 거꾸로 한 현미경에 인수 설명 MAPK 돌연변이 세포 라인 Calu에서 다양 한 3D 형태학-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-멜-30:NRAS, 및 학회-62:HRAS. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57476/57476fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57476/57476fig2.jpg"> 그림 2: 점도 셀 라인에 걸쳐 2D- 대 3D 복합 효능 비교. 복합 효능은 결정 하기 전에 이전에 생성 된 3 d, spheroids 다음 추가 5 d에 대 한 화합물으로 치료 했다. 각 원형 독특한 복합 응답을 나타냅니다. 세포 증식에 변화 용균성 셀 확산 시 약을 사용 하 여 검색 된 그리고 IC50s 헬 리오스 라는 내부 소프트웨어와 함께 4-매개 변수 로지스틱 회귀 분석을 사용 하 여 계산 했다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57476/57476fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57476/57476fig3.jpg"> 그림 3: 복용량 응답 곡선 비교 2D와 3D 화합물 효능. 복용량 응답 곡선 DMSO 컨트롤에 비해 복합 효능을 보여 줍니다. KRA 돌연변이 Calu-6 그리고 HCT116 세포 2 개의 RAF 억제제, RAF265 및 RAF709, 치료의 곡선 여기 표시 되는 DMSO에 비해 셀 성장 (% 성장 억제)에 변경에 백분율로 제어 우물. 2D 조건 하에서 성장 된 세포의 인구 빨간색으로 나타나고 3D spheroids로 성장 이들은 파란색. 데이터 주위 실선 각 데이터 집합에 대 한 95% 신뢰 간격을 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57476/57476fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57476/57476fig4.jpg"> 그림 4: 특정 3D 문화 캡처 역설적 성장 활성화의 현상. 복용량 응답 곡선 DMSO 컨트롤에 비해 복합 효능 (% 성장 억제)을 보여 줍니다. KRA 돌연변이 Calu-6, BRAF V600E 돌연변이 A375, HRAS 돌연변이 학회-62, Dabrafenib 여기 표시 됩니다 역설적 활성기 치료 불규칙 BRAF 돌연변이 BxPC-3 셀의 곡선. 2D 조건 하에서 성장 된 세포의 인구 빨간색으로 나타나고 3D spheroids로 성장 이들은 파란색. 데이터 주위 실선 각 데이터 집합에 대 한 95% 신뢰 간격을 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57476/57476fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/57476/57476figS1.jpg"> 보충 그림 1: 2D- 대 3D 복합 효능 미디어를 포함 하는 FBS에 비교 하는 복용량 응답 곡선. 복용량 응답 곡선 DMSO 컨트롤에 비해 복합 효능을 보여 줍니다. 2 개의 영국 공군 억제제, RAF265 및 RAF709, 치료 KRA 돌연변이 Calu-6 셀의 곡선 여기 표시 됩니다 백분율 셀 성장 (% 성장 억제)에 변화는 DMSO에 비해 우물을 제어. 2D 조건 하에서 성장 된 세포의 인구 빨간색으로 나타나고 3D spheroids로 성장 이들은 파란색. 두 조건 FBS 포함 된 미디어를 사용합니다. 오차 막대 2 개별 데이터 세트에서 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57476/57476figS1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>셀 라인 이름</td>
			<td>계보</td>
			<td>BRAF</td>
			<td>RAS</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-375</td>
			<td>흑색 종</td>
			<td>V600E</td>
			<td>WT</td>
		</tr>
<tr>
<td>BxPC-3</td>
			<td>췌 장</td>
			<td>V487-P492 > A</td>
			<td>WT</td>
		</tr>
<tr>
<td>Calu6</td>
			<td>비 작은 세포 폐 암</td>
			<td>WT</td>
			<td>KRA Q61K</td>
		</tr>
<tr>
<td>HCT 116</td>
			<td>대 장</td>
			<td>WT</td>
			<td>KRA G13C</td>
		</tr>
<tr>
<td>IPC-298</td>
			<td>흑색 종</td>
			<td>WT</td>
			<td>NRAS Q61L</td>
		</tr>
<tr>
<td>학회-62</td>
			<td>편평 상피 폐암</td>
			<td>WT</td>
			<td>HRA Q61L</td>
		</tr>
<tr>
<td>NCI H1299</td>
			<td>폐</td>
			<td>WT</td>
			<td>NRAS G12D</td>
		</tr>
<tr>
<td>PANC-1</td>
			<td>췌 장</td>
			<td>WT</td>
			<td>KRA G12D</td>
		</tr>
<tr>
<td>SKMEL-30</td>
			<td>흑색 종</td>
			<td>WT</td>
			<td>NRAS Q61K</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 셀 라인 정보입니다.

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Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

다양 한 질병의 표시 더 순수 관련 모델 개발 및 구현에 약물 발견 프로그램 되. 여기에 설명 된 새로운 모델 시스템 spheroids를 경작 하 고 종양학 신약에 대 한 검색 하는 높은 처리량 1536-잘 접시 기반 시스템에서 상영 될 수 방법을 3 차원 종양을 보여 줍니다.

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

generation-high-throughput-three-dimensional-tumor-spheroids-for-drug

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.5K 조회수.  Novartis Institutes for Biomedical Research. 다양 한 질병의 표시 더 순수 관련 모델 개발 및 구현에 약물 발견 프로그램 되. 여기에 설명 된 새로운 모델 시스템 spheroids를 경작 하 고 종양학 신약에 대 한 검색 하는 높은 처리량 1536-잘 접시 기반 시스템에서 상영 될 수 방법을 3 차원 종양을 보여 줍니다.

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A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

연구

암 연구학

Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, high-throughput imaging modalities utilizing bright field or fluorescence detection, are unable to resolve the overall 3D structure of the tumor spheroid due to limited light penetration, diffusion of fluorescent dyes and depth-resolvability. Recently, our lab demonstrated the use of optical coherence tomography (OCT), a label-free and non-destructive 3D imaging modality, to perform longitudinal characterization of multicellular tumor spheroids in a 96-well plate. OCT was capable of obtaining 3D morphological and physiological information of tumor spheroids growing up to about 600 &#181;m in height. In this article, we demonstrate a high-throughput OCT (HT-OCT) imaging system that scans the whole multi-well plate and obtains 3D OCT data of tumor spheroids automatically. We describe the details of the HT-OCT system and construction guidelines in the protocol. From the 3D OCT data, one can visualize the overall structure of the spheroid with 3D rendered and orthogonal slices, characterize the longitudinal growth curve of the tumor spheroid based on the morphological information of size and volume, and monitor the growth of the dead-cell regions in the tumor spheroid based on optical intrinsic attenuation contrast. We show that HT-OCT can be used as a high-throughput imaging modality for drug screening as well as characterizing biofabricated samples.

Optical coherence tomography (OCT), a three-dimensional imaging technology, was used to monitor and characterize the growth kinetics of multicellular tumor spheroids. Precise volumetric quantification of tumor spheroids using a voxel counting approach, and label-free dead tissue detection in the spheroids based on intrinsic optical attenuation contrast, were demonstrated.

경도 형태 및 생리 적인 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 3 차원 종양 Spheroids의 모니터링

Tumor spheroids have been developed as a three-dimensional (3D) cell culture model in cancer research and anti-cancer drug discovery. However, currently, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

다리에 대 한 3 차원 뼈 세포 외 매트릭스 모델

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

3 차원 세 포스 페 로이드 침입 분석에서 완전 한 인간 종양 기반 매트릭스

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of anti-cancer therapeutics in a physiologically representative microenvironment. We outline the formation of patient derived cancer stem cell spheroids, as well as, the manipulation of these spheroids for thorough analysis following drug treatment. Specifically, we describe collection of spheroid morphology, proliferation, viability, drug toxicity, cell phenotype and cell localization data. This protocol focuses heavily on analysis techniques that are easily implemented using the 384-well hanging drop platform, making it ideal for high throughput drug screening. While we emphasize the importance of this model in ovarian cancer studies and cancer stem cell research, the 384-well platform is amenable to research of other cancer types and disease models, extending the utility of the platform to many fields. By improving the speed of personalized drug screening and the quality of screening results through easily implemented physiologically representative 3D cultures, this platform is predicted to aid in the development of new therapeutics and patient-specific treatment strategies, and thus have wide-reaching clinical impact.

This protocol describes generation of patient-derived spheroids, and downstream analysis including quantification of proliferation, cytotoxicity testing, flow cytometry, immunofluorescence staining and confocal imaging, in order to assess drug candidates&#8217; potential as anti-neoplastic therapeutics. This protocol supports precision medicine with identification of specific drugs for each patient and stage of disease.

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Establishment and Characterization of Small Bowel Neuroendocrine Tumor Spheroids

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited because very few patient derived SBNET cell lines have been generated. Well-differentiated SBNET cells are slow growing and are hard to propagate. The few cell lines that have been established are not readily available, and after time in culture may not continue to express characteristics of NET cells. Generating new cell lines could take many years since SBNET cells have a long doubling time and many enrichment steps are needed in order to eliminate the rapidly dividing cancer-associated fibroblasts. To overcome these limitations, we have developed a protocol to culture SBNET cells from surgically removed tumors as spheroids in extracellular matrix (ECM). The ECM forms a 3-dimensional matrix that encapsulates SBNET cells and mimics the tumor micro-environment for allowing SBNET cells to grow. Here, we characterized the growth rate of SBNET spheroids and described methods to identify SBNET markers using immunofluorescence microscopy and immunohistochemistry to confirm that the spheroids are neuroendocrine tumor cells. In addition, we used SBNET spheroids for testing the cytotoxicity of rapamycin.

Neuroendocrine tumors (NETs) originate from neuroendocrine cells of the neural crest. They are slow growing and challenging to culture. We present an alternative strategy to grow NETs from the small bowel by culturing them as spheroids. These spheroids have small bowel NET markers and can be used for drug testing.

작은 창자 신경 내분비 종양 스페로이드의 설치 그리고 특성화

Small bowel neuroendocrine tumors (SBNETs) are rare cancers originating from enterochromaffin cells of the gut. Research in this field has been limited ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the standard in the field, but zebrafish have emerged as an alternative model with several advantages, including the ability for high-throughput and low-cost drug screening. Zebrafish also allow for in vivo drug screening with large replicate numbers that were previously only obtainable with in vitro systems. The ability to rapidly perform large scale drug screens may open up the possibility for personalized medicine with rapid translation of results back to clinic. Zebrafish xenograft models could also be used to rapidly screen for actionable mutations based on tumor response to targeted therapies or to identify new anti-cancer compounds from large libraries. The current major limitation in the field has been quantifying and automating the process so that drug screens can be done on a larger scale and be less labor-intensive. We have developed a workflow for xenografting primary patient samples into zebrafish larvae and performing large scale drug screens using a fluorescence microscope equipped imaging unit and automated sampler unit. This method allows for standardization and quantification of engrafted tumor area and response to drug treatment across large numbers of zebrafish larvae. Overall, this method is advantageous over traditional cell culture drug screening as it allows for growth of tumor cells in an in vivo environment throughout drug treatment, and is more practical and cost-effective than mice for large scale in vivo drug screens.

Zebrafish xenograft models allow for high-throughput drug screening and fluorescent imaging of human cancer cells in an in vivo microenvironment. We developed a workflow for large scale, automated drug screening on patient-derived leukemia samples in zebrafish using an automated fluorescence microscope equipped imaging unit.

제브라피시의 1차 환자 유래 종양 이종이식의 약물 스크리닝

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for tumor development, maintenance, and resistance to drugs. A better understanding of CSC properties for their specific targeting is, therefore, a pre-requisite for effective therapy. However, there is a paucity of suitable preclinical models for in-depth investigations. Although in vitro two-dimensional (2D) cancer cell lines provide valuable insights into tumor biology, they do not replicate the phenotypic and genetic tumor heterogeneity. In contrast, three-dimensional (3D) models address and reproduce near-physiological cancer complexity and cell heterogeneity. The aim of this work was to design a robust and reproducible 3D culture system to study CSC biology. The present methodology describes the development and optimization of conditions to generate 3D spheroids, which are homogenous in size, from Caco2 colon adenocarcinoma cells, a model that can be used for long-term culture. Importantly, within the spheroids, the cells which were organized around lumen-like structures, were characterized by differential cell proliferation patterns and by the presence of CSCs expressing a panel of markers. These results provide the first proof-of-concept for the appropriateness of this 3D approach to study cell heterogeneity and CSC biology, including the response to chemotherapy.

This protocol presents a novel, robust, and reproducible culture system to generate and grow three-dimensional spheroids from Caco2 colon adenocarcinoma cells. The results provide the first proof-of-concept for the appropriateness of this approach to study cancer stem cell biology, including the response to chemotherapy.

대장암 줄기세포를 연구하는 스페로이드의 3차원 모델

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture models. PDOs have been successfully generated from a variety of human tumors to recapitulate the architecture and function of tumor tissue accurately and efficiently. However, PDOs are unsuitable for an in vitro high-throughput assay system (HTS) or cell analysis using 96-well or 384-well plates when evaluating anticancer drugs because they are heterogeneous in size and form large clusters in culture. These cultures and assays use extracellular matrices, such as Matrigel, to create tumor tissue scaffolds. Therefore, PDOs have a low throughput and high cost, and it has been difficult to develop a suitable assay system. To address this issue, a simpler and more accurate HTS was established using PDOs to evaluate the potency of anticancer drugs and immunotherapy. An in vitro HTS was created that uses PDOs established from solid tumors cultured in 384-well plates. An HTS was also developed for assessment of antibody-dependent cellular cytotoxicity activity to represent the immune response using PDOs cultured in 96-well plates.

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

A highly accurate in vitro high-throughput assay system was developed to evaluate anticancer drugs using patient-derived tumor organoids (PDOs), similar to cancer tissues but are unsuitable for in vitro high-throughput assay systems with 96-well and 384-well plates.

환자 유래 종양 오르가노이드를 사용하여 시험관 분석에서 높은 처리량

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

A Three-Dimensional Spheroid Model to Investigate the Tumor-Stromal Interaction in Hepatocellular Carcinoma

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver cancer, rationalize its rank as the second most common cause of cancer-related death. Preclinical models need to be adapted to recapitulate the human conditions to select the best therapeutic candidates for clinical development and aid the delivery of personalized medicine. Three-dimensional (3D) cellular spheroid models show promise as an emerging in vitro alternative to two-dimensional (2D) monolayer cultures. Here, we describe a 3D tumor spheroid&#160;model which exploits the ability of individual cells to aggregate when maintained in hanging droplets, and is more representative of an in vivo environment than standard monolayers. Furthermore, 3D spheroids can be produced by combining homotypic or heterotypic cells, more reflective of the cellular heterogeneity in vivo, potentially enabling the study of environmental interactions that can influence progression and treatment responses. The current research optimized the cell density to form 3D homotypic and heterotypic tumor spheroids by immobilizing cell suspensions on the lids of standard 10 cm3 Petri dishes. Longitudinal analysis was performed to generate growth curves for homotypic versus heterotypic tumor/fibroblasts spheroids. Finally, the proliferative impact of fibroblasts (COS7 cells) and liver myofibroblasts (LX2) on homotypic tumor (Hep3B) spheroids was investigated. A seeding density of 3,000 cells (in 20 &#181;L media) successfully yielded Huh7/COS7 heterotypic spheroids, which displayed a steady increase in size up to culture day 8, followed by growth retardation. This finding was corroborated using Hep3B homotypic spheroids cultured in LX2 (human hepatic stellate cell line) conditioned medium (CM). LX2 CM triggered the proliferation of Hep3B spheroids compared to control tumor spheroids. In conclusion, this protocol has shown that 3D tumor spheroids can be used as a simple, economical, and prescreen in vitro tool to study tumor-stromal interactions more comprehensively.

Comprehensive in vitro models that faithfully recapitulate the relevant human disease are lacking. The current study presents three-dimensional (3D) tumor spheroid creation and culture, a reliable in vitro tool to study the tumor-stromal interaction in human hepatocellular carcinoma.

간세포 암에서 종양-기질 상호 작용을 조사하는 3차원 스페로이드 모델

The aggressiveness and lack of well-tolerated and widely effective treatments for advanced hepatocellular carcinoma (HCC), the predominant form of liver ...