Name: method for high speed stretch injury of human induced pluripotent stem cell-derived neurons in a 96-well format
Uploaded: 2018-04-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
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이 작품은 건강의 국가 학회 (R21NS098129)에서 교부 금에 의해 부분에서 지원 됩니다. SueSan 첸, 조나단 탄, 코 티 카 나, 시 카이 니 Feng 위안 부, 누가 설계 및 구조 지원 고속 이미징 실험이이 원고에서 설명 하는 동안 사용 되는 조명 내장에서 우수한 기술 지원을 인정 하 고 싶습니다. .

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	<li>Faul, M., L, X. u., Wald, M. M., Coronado, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Traumatic brain injury in the United States: emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. , (2010).</li><li>Kabadi, S. V., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+strategies+for+traumatic+brain+injury:+improving+clinical+translation.">Neuroprotective strategies for traumatic brain injury: improving clinical translation.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 1216-1236 (2014).</li><li>Kiskinis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+disrupted+in+human+ALS+motor+neurons+identified+through+genetic+correction+of+mutant+SOD1.">Pathways disrupted in human ALS motor neurons identified through genetic correction of mutant SOD1.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 781-795 (2014).</li><li>Smith, D. H., Wolf, J. A., Lusardi, T. A., Lee, V. M., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+tolerance+and+delayed+elastic+response+of+cultured+axons+to+dynamic+stretch+injury.">High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury.</a> J Neurosci. 19 (11), 4263-4269 (1999).</li><li>Wolf, J. A., Stys, P. K., Lusardi, T., Meaney, D., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+axonal+injury+induces+calcium+influx+modulated+by+tetrodotoxin-sensitive+sodium+channels.">Traumatic axonal injury induces calcium influx modulated by tetrodotoxin-sensitive sodium channels.</a> J Neurosci. 21 (6), 1923-1930 (2001).</li><li>Lusardi, T. A., Wolf, J. A., Putt, M. E., Smith, D. H., Meaney, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+acute+calcium+influx+after+mechanical+stretch+injury+in+vitro+on+the+viability+of+hippocampal+neurons.">Effect of acute calcium influx after mechanical stretch injury in vitro on the viability of hippocampal neurons.</a> J Neurotrauma. 21 (1), 61-72 (2004).</li><li>Magou, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+high+throughput+axon+injury+system.">Engineering a high throughput axon injury system.</a> J Neurotrauma. 28 (11), 2203-2218 (2011).</li><li>Morrison, B., Cater, H. L., Benham, C. D., Sundstrom, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+traumatic+brain+injury+utilising+two-dimensional+stretch+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">An in vitro model of traumatic brain injury utilising two-dimensional stretch of organotypic hippocampal slice cultures.</a> J Neurosci Methods. 150 (2), 192-201 (2006).</li><li>Cater, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch-induced+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures+reproduces+in+vivo+post-traumatic+neurodegeneration:+role+of+glutamate+receptors+and+voltage-dependent+calcium+channels.">Stretch-induced injury in organotypic hippocampal slice cultures reproduces in vivo post-traumatic neurodegeneration: role of glutamate receptors and voltage-dependent calcium channels.</a> J Neurochem. 101 (2), 434-447 (2007).</li><li>Kang, W. H., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+tolerance+to+mechanical+deformation+developed+from+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Functional tolerance to mechanical deformation developed from organotypic hippocampal slice cultures.</a> Biomech Model Mechanobiol. 14 (3), 561-575 (2015).</li><li>Sherman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+Injury+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Neurons+in+a+96+Well+Format.">Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neurons in a 96 Well Format.</a> Sci Rep. 6, 34097 (2016).</li><li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+Head+Injury+Mechanisms+Using+Neutral+Density+Technology+and+High-Speed+Biplanar+X-ray.">Investigation of Head Injury Mechanisms Using Neutral Density Technology and High-Speed Biplanar X-ray.</a> Stapp Car Crash J. 45, 337-368 (2001).</li><li>Hardy, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+response+of+the+human+cadaver+head+to+impact.">A study of the response of the human cadaver head to impact.</a> Stapp Car Crash J. 51, 17-80 (2007).</li><li>Sunkara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+room+temperature+bonding+of+thermoplastics+and+poly(dimethylsiloxane).">Simple room temperature bonding of thermoplastics and poly(dimethylsiloxane).</a> Lab Chip. 11 (5), 962-965 (2011).</li><li>Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+pathology+in+traumatic+brain+injury.">Axonal pathology in traumatic brain injury.</a> Exp Neurol. 246, 35-43 (2013).</li><li>Lacour, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flexible+and+stretchable+micro-electrodes+for+in+vitro+and+in+vivo+neural+interfaces.">Flexible and stretchable micro-electrodes for in vitro and in vivo neural interfaces.</a> Med Biol Eng Comput. 48 (10), 945-954 (2010).</li><li>Yu, Z., Morrison, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+mild+traumatic+brain+injury+induces+functional+alteration+of+the+developing+hippocampus.">Experimental mild traumatic brain injury induces functional alteration of the developing hippocampus.</a> J Neurophysiol. 103 (1), 499-510 (2010).</li><li>Tcw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Platform+for+Astrocyte+Differentiation+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">An Efficient Platform for Astrocyte Differentiation from Human Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).</li><li>Muffat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+derivation+of+microglia-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells.">Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

일관 된 취득의 열쇠, biofidelic 표현 형이이 모델에 일관 된 biofidelic 기계 모욕을 적용 합니다. 이 모델 기간이 10-15 ms와 유사한 시체 실험12,13에 따라 인간의 머리 영향에 대 한 펄스 기간 짧은 펄스를 생성할 수 있습니다. 이 모욕의 일관성 indenter 블록 플레이트의 맞춤은 indenters의 일관 된 윤 활에 따라 다릅니다. 때 indenter 블록 정렬 잘 있다 아무 추세 적용 된 스트레인에 행 또는 열 (그림 2C). 윤활제의 얇은 레이어는 일반적으로 두꺼운 층 마찰 만들고 점성 윤활제는 실리콘 파울 현미경 중 빛의 통로 방해 때문에 권장 하지 않습니다. 실제 무대 변위 진폭 수 짧은을 실질적으로 된 변위 진폭 때 많은 indenters을 사용 하 고 소정의 단계 변위 진폭 큰 (> 3 m m) 이다. 그러나, 실제 변위는 큰 진폭에 소정의 변위 보다, 하는 동안 반복 (그림 2B) 남아 있다. 따라서, 큰, 실제 변위 진폭 원하는 값 초과 된 값을 입력 하 여 안정적으로 얻을 수 있습니다. 변위 진폭 피크 막 스트레인, 병 리를 유도 기계 모욕을 직접 측정에 대 한 쉽게 기록 된 프록시 때문에 중요 합니다. 따라서, 단계 진지 변환에서 막 부담을 결정에 대 한 설명 하는 절차가 중요 합니다. 접시와 indenters, 예를 들어 다른 간의 상호 작용에 영향을 주는 시스템에 변경 내용이 있는 주요 경우이 프로세스를 반복 해야 직경 indenters, 다른 indenter 자료 또는 코팅, 실리콘의 종류 바닥된 플레이트 사용 됩니다. 각 실험의 시작에 indenter 블록을 재조정 하 고 제로 위치를 결정 하는 과정을 반복 한다. 스트레칭 장치의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. CAD 모델 장치를 재현 하는 데 필요한 보충 자료로 제공 됩니다: ' 부상 장치-전체 어셈블리-일반 3D. 단계 '; 제공 되는 자료의 관련된 법안으로보충 표 1: 사용자 정의 내장 장치-BOM.xlsx. 또한 보충 테이블 2 96 잘 접시 _loader - 핀 배선 Diagram.xlsx, 시스템의 다양 한 구성 요소를 연결 하는 케이블 연결 설명 참조. 'Interconnector_circuit_board.dip'는 케이블을 상호 연결 하는 회로 보드에 설명 합니다.
여행 중간 근처 무대 장치를 비활성화 하는 경우 그것은 스프링 때문에 전원 차단 후 무대 이동 합니다. 전원이 복원 되 면 피드백 루프 마지막 알려진된 된 위치와 실제 위치 사이의 큰 차이 감지 합니다. 이 위치로 갑자기 이동 무대 장치가 비활성화 되었습니다 때 발생 합니다. 않으므로 주의 한다 그것은 그것의 전원이 꺼져 있는 휴식 여행 상단에 위치 하는 경우에 장치를 비활성화 하려면이 갑자기 모션 인코더의 출력에서 오류를 발생할 수 있습니다.
제조 클램프는 최적의 결합을 허용 하는 방식으로 함께 접시 신체와 실리콘 바닥을가지고 설계 되었습니다. 이 위해, 있는 세 가지 핵심 기능 추가 파일에서 제공 하는 디자인 ' 프레스 다이-일반 3D. 단계 '. 첫째, 클램프 플레이트 몸 홀더 실리콘 바닥에 평행 하다. 이 제대로 빌드된 경우 초기 설치 후 아무 조정이 필요 합니다. 둘째, 클램프에 거품 고무의 레이어 클램프 폐쇄 때 완전히 딱딱한 시스템 이론적으로 무한 한 클램핑 힘을 제로 클램핑 힘에서 급격 한 증가 경험으로 접시, 아래 준수의 작은 금액을 제공 합니다. 크로스바의 위치와 클램프의 나사는 클램프의 두 측면 사이의 거리는 괜찮을 수 있다 그래야 조정 가능 하다.
모든 노력 스트레인 특성 실험 중 점 뒤에 밝은, 흰색 배경 잘 하단에 제공 하 여야 한다. 더 나은 대비 이러한 이미지에 쉽게 될 것입니다 높이 교환원 큰 실험 분석에 대 한 지루한 될 수 있는 도트의 너비를 측정 하는 과정을 자동화. 96 잘 접시에 우물의 바닥의 고속 videography 우물의 벽 그림자 경향이 있기 때문에 도전을 선물 한다. 돔 빛 또는 카메라의 시선에 따라 이미지를 왜곡 없이 밝히는 수 확산 축 빛의 사용은 그림자 또는 반사 반사 기존의 광원으로 발생 하는 것을 제거 합니다. 밝은 빛 소스 밝은 조명 이미지 짧은 노출 시간으로 획득 될 수 있기 때문에 사용 되어야 한다. 짧은 노출 시간 동작 흐림 효과 최소화합니다. 확산 축 빛의 발광 다이오드 (Led)를 업그레이드 중 고속 비디오 짧은 노출 시간을 허용 한다. Led Led 주식 제거 확산 축 빛을 개방 하 여 업그레이드할 수 있습니다, 그리고 장착 4 높은 전원 LED Led 홀더를 사용 하 여, 일정 한 현재 전력 공급에 연결 하 고 확산 축 빛 (참조 테이블의 재조합 백 창 배열 재료 카탈로그 번호). 업그레이드 하는 Led의 단점은 과열 될 위험이 몇 초에 대 한 수 동적으로 냉각된 Led 유지할 수 없는. 따라서, 다른 빛 후 블록 및 카메라 조정의 필요 합니다.
점 막에 스탬프의 팽창 측정 하 여 막 스트레인 측정의 표시 방법은 상대적으로 원유, 하지만 그것은 강력한 방식으로 여러 우물 확장할 수 있습니다. 잘 아래쪽 스트레인 필드 디지털 이미지 상관 관계를 사용 하 여 좀 더 자세하게에서 특징 수 있습니다. 이 기술은 포함 한다 우물의 기지에 얼룩 덜 룩 한 패턴을 분사 하 고 다음에 그것을 이미징 변형 중 고속. 상용 소프트웨어는 다음 얼룩 덜 룩 한 패턴의 진화를 추적 하 여 이미지의 모든 지점에서 스트레인 척도를 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 hiPSCNs에 다 면, 임상 관련, 스트레칭 상해 형을 생성합니다. 세포 죽음, neurite 변성 및 neurite 구슬 인간에서 TBI의 모든 문서화 sequelae 이며 동물 모델15. 이 모델에서 성공의 열쇠는 설정 이며 건강 한 문화를 유지 하. 일반적으로 말하자면, 기존의 경직 된 플레이트와 개발 세포 문화 프로토콜 stretchable 격판덮개 문화에 대 한 가치 있는 출발점입니다. 그러나, 문제의 세포 실리콘에 다르게 응답할 수 있습니다 가능성 항상 고려 되어야 한다. 이 문화 상황에 매우 민감한 hiPSCNs의 특히 사실 이다. 셀 밀도 laminin 농도 최적화의 몇 가지 예는 (그림 3, 그림 4) 대표적인 결과 섹션에서 제공 됩니다. 플라즈마 처리 된 실리콘의 활성화는 생명 이다. 실리콘은 소수 성 그리고 unreactive; 자연 상태에서 그것은 하지 laminin 또는 셀 첨부를 홍보 하는 데 사용 하는 다른 분자에 바인딩합니다. 플라즈마 처리는 친수성 표면을 렌더링 하 고 반응 그룹 노출. 이러한 변화 접착 분자 실리콘 바인딩할 홍보 셀 첨부 파일을 허용 합니다. 그것은 중요 한 플라즈마 처리 효과 표면, 액체에 빠져들 고 그래서 최대한 빨리 활성화 된 표면 건조를 포함 하는 절차를 수행 해야 분 이내 사라지는 것. 플라즈마 처리의 효과 없어진 경우 확인 하는 간단한 방법은 표면에 물 한 방울을 배치 하는 것입니다. 플라즈마 처리 실리콘에 밖으로 전파 하는 반면 치료 실리콘에는 물방울을 구슬 것입니다. 우리가 사용 하는 hiPSCNs와 ( 재료의 표참조), 제조업체 셀 서 스 펜 션 보다는 사전 코팅 laminin 추가 것이 좋습니다. 이 프로토콜은이 접근을 성공적으로 통합 했다. 세분화, 이론적으로, 달성 될 수 있다 오픈 소스 소프트웨어 또는 범용 프로그래밍 언어, 하는 동안 이러한 도구와 능력의 높은 학위 좋은 결과 얻기 위해 필요 합니다. Neurites는 자주 그들은 너무 슬림 하기 때문에 배경 신호 로부터 구별 하기 어렵다입니다. 따라서, 우리는 그들이 사용할 수 있는 경우 전용 모듈 세분화와 뉴런의 정량화에 대 한 높은 콘텐츠 현미경 회사에서 배포 하는 상용 소프트웨어 도구를 사용 하 여를 권장 합니다. 상용 소프트웨어와도 시각적으로 정확도 확인 하기 위해 세분화의 이미지를 내보낼 현명 하다.
기존의 경직 된 플레이트 작업에 비해 stretchable 접시에서 일하고와 관련 된 몇 가지 제한이 있습니다. Stretchable 접시 공기 목표와 정상적으로 몇 군데 될 수 있습니다. 그러나, 집중 목표와 이미징 매우 어렵습니다. 렌즈 오일 실리콘을 손상 될 수 있습니다. 또한, 목표 위쪽으로 이동할 때 실리콘 막에 압력을 미치는. 이 압력 배 수량 막 수직, 어렵게 초점으로 샘플을가지고. 현재 판 제조에 사용 되는 실리콘 막 약 250 µ m 두께입니다. 이 두께 많은 높은 전력, 침수 목표의 초점 거리를 초과합니다. 특별 한 배려는 현미경에 필요한 평탄도 달성 하기 위해 클램핑 하기 전에 완벽 하 게 평면 멤브레인을가지고 한다. 자동 초점 시스템 어느 정도 완성 된 플레이트의 평탄도에 편차를 보정할 수 있습니다. 이후 버전의 프로토콜 평탄도 보장 하기 위해 접시 위쪽에 접착은 전에 막을 긴장 미리 수 있습니다. 플레이트 최고14 에 실리콘 막 본딩 접착제 없는 절차에는 현재 프로토콜의 중요 한 힘으로 간주 됩니다. 그것은 평탄도 접착제 층의 비균일 두께 때문에 neurotoxicity 어떤 편차 및 접착제에서의 위험을 제거합니다.
다중 전극 배열 일반적으로 그들의 성숙과 기능을 평가 하기 위해 hiPSCNs와 함께 실험에 사용 됩니다. 셀 문화 기판은 엄밀한 때문에 불행 하 게도, 이러한 시스템이 모델과 호환 되지 않습니다. Stretchable 다중 전극 어레이 만들, 비록이 지금까지 입증 되었습니다 하나의 잘 포맷16,17가능 하다. Note는 indenters에서에서 제거할 수 있습니다 개별적으로 indenter 블록을 일부 우물 들여쓰기 되지 shams로 사용할 수 있습니다. 제거 하 고 indenter 들여쓰기를 방지 하지만 기계적 로드 이므로 우물에 있는 액체의 여전히 관성 모션 스테이지를 이동 하는 동안 완전히 제거 하지 않습니다. 그것은 결코 단계 모션 움직임의 어떤 병 적인 영향을 측정에 적용 했다 플레이트에 웰 스 이 우물 비교 가치가 있다. 또한, 블록에 indenters의 배열 bisymmetric (앞 뒤쪽으로 대칭과 좌우로) 이어야 한다. 이 경고는 무대 옆으로 기울기 하지 않으며 그들의 베어링에 바인딩할 막대를 원인이 되도록 들여쓰기, 중 접시 로드 균등 하 게 보장 합니다.
Neurotrauma 치료 혁신을 주요 과제 중 하나입니다 복잡 하 고이 조건. 외상에 적용 됩니다 멀티 모달 스트레스 중앙 신경 시스템에 모든 셀 형식을 동시에. 신경 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)에서 안정적으로 생성 된 고 널리 상용 공급 업체에서 사용할 수 있습니다. 혁신은이 분야에서 신속 하 게 진행 되 고 이다18 microglia19 같은 다른 신경 세포 유형 또한 hiPSCs에서 파생 되 고. 곧 체 외에 외상 그리고 공동 문화 다른 세포 유형 그들은 외상 후 통신 하는 방법을 이해 하는 것이 세포 유형의 각각의 셀 자치 응답 분리 수 수 있습니다. 이 방법에서는, 궁극적으로 철저 하 게 인간의 시스템에 그것을 이해 하는 바닥에서 임상 도전 최대 다시 수 수 있습니다. 이 방법은 다른 설치류 모델에 의존 하는 기존의 접근 이며이 일반적인, 엄청난, 그리고 다루기 힘든 조건에 대 한 첫 번째 치료를 이끌어 내는 새로운 통찰력을 생성 하는.

TBI 일으키는 약 52000 죽음과 275000 입원 마다 년1사망률과 질병 률, 미국에서의 주요 원인입니다. TBI에 대 한 후보 치료제의 임상 시험을 30 개 이상의 단일 성공2없이 실시 되었습니다. 이 유니폼 실패 인간-특정 프로세스에서 일반적으로 사용 되 전 임상 설치류 모델에서 관찰 하는 이상 인간의 TBI를 별도 나왔다.
HiPSCNs의 출현 neurotrauma 인간의 생체 외에서 모델을 공부 하는 기회를 창조 했다. 약 hiPSCN 기반 모델 심사는 설치류 셀을 채용 하는 모델 보다 더 많은 임상 성공의 예측 결과 제공할 수 있습니다. 또한, hiPSCNs는 격리 하 고 병 리3개별 인간의 유전 이체의 효과 연구 유전으로 조작할 수 있습니다.
이 원고에 설명 된 메서드는 neurotrauma을 모델링 하는 hiPSCN 기반 질병의 독특한 장점을 설계 되었습니다. Neurotrauma의 스트레치 부상 모델에 생체 외에서 잘 설립된4,5,6 주 쥐 세포와 인간의 신경 암 세포 라인은. 이러한 모델의 대부분은 공기 실리콘 막 로드 하 여 스트레치를 생성 합니다. 이 방법은 단일 잘 형식에 효과적입니다 하지만 다 잘 형식7최대 규모 어려운 입증 되었습니다. 결과적으로, 결코 스트레치 부상된 신경 치료 하는 에이전트에 대 한 높은 처리량 화면 계속 있다.
이 모델에서 막 때문에 엄밀한 indenter와 밑에서 들여쓰기 펼쳐져 있습니다. 이 방법은 단일 잘 시스템8,,910관련 임상 병리학에 생체 외에서 생성 하 반복적으로 표시 되었습니다. 우리의 최근 작품으로는 쉽게 확장 96 잘 서식 하는 도메인의 닫히는 머리 영향 이벤트12,13시간 펄스 기간 수십 밀리초11, 순서를 유지 하면서 나타났습니다.
요약 하자면,이 생체 외에서 부상 모델의 주요 장점에 96 잘 형식, hiPSCNs의 사용 및 모욕의 임상 관련 시간 도메인.

<table><tbody><tr><td>.010&quot; Silicone Sheet</td><td>Specialty Manufacturing, Inc</td><td>#70P001200010</td><td>Polydimethylsiloxane (PDMS) sheet</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>#043204</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 256665</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>#12-565-600</td><td>Bottomless 96 Well Plate</td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td>ULINE</td><td>S-8115</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>#PDC-001-HC</td><td></td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#440140</td><td>APTES</td></tr><tr><td>Parchment Paper</td><td>Reynolds</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dome Light</td><td>CCS inc</td><td>LFX2-100SW</td><td></td></tr><tr><td>Dome Light Power Supply</td><td>CCS inc</td><td>PSB-1024VB</td><td></td></tr><tr><td>Axial Diffuse Lighting Unit&amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Siemens</td><td>Nerlite DOAL-75-LED</td><td>Diffuse axial light</td></tr><tr><td>High Power LED Array&amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>CREE</td><td>XLamp CXA2540</td><td>High Power LED Array&amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp; &amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LED holder</td><td>Molex</td><td>1807200001</td><td>LED Holder&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LED power supply</td><td>Mean Well</td><td>HLG-320H-36B</td><td>Constant Current Power Supply&amp;nbsp; &amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FastCam Viewer software&amp;nbsp;</td><td>Photron</td><td></td><td>camera softeware</td></tr><tr><td>Fastcam Mini UX50</td><td>Photron</td><td>N/A</td><td>High Speed Camera</td></tr><tr><td>Micro-NIKKOR 105mm f/2.8</td><td>Nikon</td><td>#1455</td><td>High Speed Camera Lens</td></tr><tr><td>0.1 mg/mL Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P4597</td><td></td></tr><tr><td>iCells</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>#NRC-100-010-001</td><td></td></tr><tr><td>iCell media</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>#NRM-100-121-001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>iCell supplement</td><td>Cellular Dynamics International</td><td>#NRM-100-031-001</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>#H3570</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>#C3099</td><td></td></tr><tr><td>voice coil actuator&amp;nbsp;</td><td>BEI Kimco</td><td>LA43-67-000A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>optical linear encoder&amp;nbsp;</td><td>Renishaw</td><td>T1031-30A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>servo drive</td><td>Copley Controls</td><td>Xenus XTL&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Controller</td><td>National Instruments</td><td>cRIO 9024 Real Time PowerPC Controller&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cRIO chassis</td><td>National Instruments</td><td>cRIO 9113</td><td></td></tr><tr><td>digital input module</td><td>National Instruments</td><td>NI 9411</td><td></td></tr><tr><td>data acquistion chassis</td><td>National Instruments</td><td>NI 9113</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>instrument control software</td></tr><tr><td>hiPSCNs</td><td>Cellular Dynamics International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

method for high speed stretch injury of human induced pluripotent stem cell-derived neurons in a 96-well format

외상 성 뇌 손상 (TBI)은 높은 사망률과 사망 주요 임상 도전 이다. 전 임상 연구의 십 년간에 불구 하 고 아니 입증 된 치료 TBI에 대 한 개발 되었습니다. 이 문서는 기존 전 임상 모델을 보완 하기 위한 전 임상 neurotrauma 연구에 대 한 새로운 메서드를 제공 합니다. 그것은 인간의 이상 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 (hiPSCNs)를 통해 소개합니다. 그것은 로드 펄스 달성 기간 임상의 로딩 기간 유사한 폐쇄 머리 영향 부상. 그것은 높은 처리량 실험을 용이 하 게 하 고 비싼 셀 및 문화 시 약의 효율적 사용 96-잘 형식을 사용 합니다. 실리콘 막 신경 uncured 폴리머를 제거 하려면 먼저 처리 되며 다음 stretchable 96 잘 접시를 만드는 상업적인 96 잘 접시에 보 세. 사용자 장치는 기계적으로 우물에 문화에 있는 세포를 손상 equibiaxial 기계적인 긴장을 유도 아래에서 잘 바닥의 일부 또는 전부를 사용 됩니다. 들여쓰기 깊이 기계적 스트레인의 관계 경험 잘 바닥의 고속 videography를 사용 하 여 들여쓰기 중 결정 됩니다. HiPSCNs를 포함 하 여 셀, 기존의 세포 배양 프로토콜의 수정된 버전을 사용 하 여 이러한 실리콘 막에 배양 수 있습니다. 세포 배양의 형광 현미경 이미지는 취득 하 고 반자동 방식에 각 잘 상해의 수준을 계량으로 부상 후 분석. 제시 하는 모델은 hiPSCNs에 최적화 되어 있지만 수 이론에서에 적용할 다른 세포 유형.

들 것 장치는 (그림 2A) 펄스의 진폭에 따라 펄스 기간이 짧은 10-15 ms와 오래전 무대를 이동 수 있습니다. 펄스 진폭 높게 반복 가능 하지만 펄스 기간 약 1 다릅니다 반복 사이 ms. 우물의 많은 수는 로드 하 고 소정의 진폭은 실제 펄스 진폭 된 펄스 진폭에서 다른 ( 그림 2B참조). 3mm 넘어 무대 변위의 진폭 증가로 실제 변위 진폭 점점 미치지 된 변위 진폭 ( 그림 2B참조). 조심 게시물 블록의 맞춤 행 또는 열 (그림 2C) 막 스트레인에 어떤 추세 든 지 제거. 3.5 m m 52 우물 들여쓰기 단계 변위 진폭 (3.3 m m 실제 변위 진폭) 처방, 모든 잘 지역에 걸쳐 평균 Lagrangian 긴장 했다 0.451 (모든 위치에 대 한 의미의 표준 편차 = 0.051, 평균 표준 편차 모든 위치에 대 한 = 0.065, n = 잘 당 5 측정). 이러한 결과 비록 그들 중 일부는 이미 보고 된11완전성에 대 한 여기 표시 됩니다.
최적, 손상 되지 않은 문화는 5 개 이상의 세포의 경우 몇 덩어리로 있을 것 이다. 개별, 슬림, 길고 긴장 또는 구슬 (그림 3A)의 거의 없거나 전혀 없는 기호로 곡선 Neurites 있을 것입니다. 이상적인 조건 하에서 문화의 생존 제조업체의 데이터 시트 (일반적으로 60-70%)에 지정 된 생존 접근 밀접 하 게 해야 하 고 실리콘에 문화는 기존의 경직 된 문화 기판 ( 유지 그 유사 합니다. 그림 3B). Neurites 되거나 저전력 밝은 분야 현미경에 표시 되지 않을 수 있습니다. Laminin 농도 세포 밀도 및 부상 후 기준선에 영향. 셀 밀도 증가 수 및 문화에서 형성 하는 덩어리의 크기를 증가 했다. 종종 laminin 농도 증가 counteracted이 효과 (그림 3A). 그러나, 부상 (그림 4) 문화의 감도 무디게 하 너무 많이 집중 된 laminin 증가. 손상 되지 않은 문화에 대 한 최적의 laminin 농도 50 µ g/mL laminin (그림 3), 하지만 가짜 고 스트레치 부상된 인구 사이 최적의 분리 laminin (그림 4)의 10 µ g/mL에서 얻은 했다. 높은 laminin 농도 점에서 긴 시간 (예를 들어, 7 일) 향상 된 초기 세포 생존 능력 뿐만 아니라 짧은 시간 포인트 (그림 4), 부상 문화의 감도 감소. 요약 하자면, 그것은 각 실험 시나리오에 대 한 laminin 농도 최적화 가치가입니다.
막 긴장, 후 부상 영상 시간, laminin 농도, 및 세포 밀도 모든 셀 당 neurite 길이에 고도의 통계적으로 중요 한 주요 효과 발휘 (ANOVA, p < 0.001). 셀 당 neurite 길이에 막 긴장의 효과 했다 후 부상 이미징 시간 지점과 laminin 농도와 높은 통계적으로 중요 한 상호 작용 (ANOVA, p < 0.001)와 셀와 통계적으로 중요 한 상호 작용을 밀도 (ANOVA, p < 0.05). 마찬가지로, 막 긴장, 후 부상 밀도, 셀 시간 포인트, 이미징 및 모든 laminin 농도 세포 생존 능력에 높은 통계적으로 중요 한 주요 효과 발휘 (ANOVA, p < 0.001). 세포 생존 능력에 막 긴장의 효과 했다 후 부상 이미징 시간 포인트와 높게 통계적으로 중요 한 상호 작용을 (ANOVA, p < 0.001) 및 셀 밀도 (ANOVA, p 와 통계적으로 중요 한 상호 작용을 < 0.05). 이러한 결과 타이밍, 세포 밀도, 그리고 laminin 농도 발휘 적용된 모욕 및 실험 결과 관계에 중요 한 영향을 미치는 그래서 각 신중 하 게 최적화 되어야 합니다 증명.
낮은 세포 생존 능력 및 저하 neurite 성장, 함께 파란색된 neurites 독성 문화 조건에서 부적절 하 게 발생할 수 있는 실리콘 준비를 나타냅니다. 건너뛰기 또는 물 담가 또는 건조 오븐 단축 수 흡수 에탄올 떠나거나 미디어로 확산 하 고 셀 강조 수 있는 멤브레인, 각각, 물. 세포 생존 능력, 단축 또는 누락 neurites, 파란색된 neurites, 및 긴장 된 또는 데크에 neurites 잘 부상된 문화 감소 됩니다. 부상 수 있습니다 잘 분산 된 사전 부상 했다 세포 배양에 응집을 유도 하 고 있다. 큰 덩어리는 형태소 분석을 혼동 수 있습니다. 형태소 분석에 대 한 눈에 띄는 변화가 발생 하지만 셀은 여전히 일부 neurites 함께 존재 하는 상해 수준을 조정 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig1.jpg"> 그림 1 : A 라는 부상 장치 회로도. (A) 평면도, 아이소메트릭 뷰 (B), (C) 전면 보기, (D) 오른쪽 보기. 눈금 막대는 직교 뷰 (A, B, D)에 적용 됩니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig2.jpg"> 그림 2 : 기계적 모욕의 운동학. (A) 단계 변위 기록 된 진폭 (범례에 나열 된 진폭)의 범위에서 5 펄스 동안 아무 웰 스는 로드 되었을 때. (B) 단계 변위 기록 된 진폭 (범례에 나열 된 진폭)의 범위에서 10 펄스 동안 52 웰 스는 로드 되었을 때. (C) 각 잘 3.3 m m의 무대 변위 진폭의 평균 변형 (n = 5 측정 음, 당 평균 표준 오차 잘 당 0.029 =). C4-f 4와 c 9 f 9는 스트레치 제어 우물 note. 이 그림에서 셔먼 외 수정 되었습니다. 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig3.jpg"> 그림 3 : 문화의 최적화 실리콘에 조건. (A) 다양 한 실리콘에 hiPSCN 문화에 셀 밀도 laminin 농도의 효과. 셀 밀도 증가 laminin 농도 감소와 응집 증가 합니다. 셀 밀도 laminin 농도 문화 모노 분산을 달성 하기 위하여 낙관 되어야 한다. 모노 분산 문화는 덜 취약 아티팩트를 정량화 하는 동안. 참고 동적 범위는 neurites의 시각화를 최적화 하기 위해 조정 되었습니다. 결과적으로, 많은 밝은 소마 포화 됩니다. 이 프레 젠 테이이 션은 많은 주차 neurites 거의 보이지 않는 렌더링 소마에 대해 동적 범위를 최적화의 대안을 선호. 빨간색 사각형으로 강조 표시 조건 스트레치 부상 실험 체 외에 대 한 최적의 간주 했다. (B) 최적의 조건에서 실리콘 막에 문화 유사 하 게 나타납니다 기존의 딱딱한 기판에 문화. 왼쪽된 패널 hiPSCNs 33,750 셀/cm2 (셀 문화 기판은 취급 하는 조직 문화 주기적 올레 공동 중합체) 기존의 엄밀한 96 잘 접시에 laminin의 3.3 µ g/mL에서 교양 보여줍니다. 오른쪽 패널 (A)에서 빨간색으로 설명 패널을 재현 합니다. 바 규모 = 100 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57305/57305fig4.jpg"> 그림 4 : 부상 표현 형 및 그것의 의존 laminin 농도. (A) 건강 한 문화, 10 µ g/mL laminin 및 67,500 셀/c m2를 사용 하 여. Neurites 아무 구슬과 오래 있습니다. 몇 가지 죽은 핵, 그리고 몇 덩어리 있다. (B) 문화 같은 문화 조건, 57% 피크 스트레인 부상 4 h. Neurites 단축 후 몇 군데 또는 누락 된, 그리고 일부는 구슬 (화살표로 표시). 적은 Calcein 오전-긍정적인 세포 그리고 있다 더 많은 Calcein 오전 음수가 핵 (즉, 죽은). 부상 가운데 살아남은 세포 응집을 증가 했다. (C) 부상 후 4 h, 셀 당 neurite 길이 laminin 농도에 의존 하는 방식으로 긴장 증가 함께 감소. (D) 부상 후 4 h, 세포 생존 능력 laminin 농도에 의존 하는 방식으로 긴장 증가 함께 감소. (E) 부상 후 24 h, 셀 당 neurite 길이 laminin 농도에 의존 하는 방식으로 긴장 증가 함께 감소. (F) 부상 후 24 h, 세포 생존 능력 laminin 농도에 의존 하는 방식으로 긴장 증가 함께 감소. (n = 4 당 바, 오차 막대는 ± 1 표준 편차, 스케일 바 = 100 µ m). 스트레인 값은 셔먼 외. 여 이전 게시에서 데이터를 사용 하 여 단계 변위에서 추론 11 <a href="/files/ftp_upload/57305/57305fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 1:는 indenter의 드로잉 기술. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Figure_1.pdf" target="_blank">이 그림을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 표 1: 사용자 정의 내장 장치. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_1-Custom_Devices-Bill_of_Materials.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 테이블 2: 96 잘 접시-로더 핀아웃 배선도. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Table_2-96_Well_Plate_Loader.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 1: 부상 장치의 컴퓨터 지원 설계 도면. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_1-Injury_Device-FULL_ASSEMBLY-Generic_3D.STEP" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 2: 플레이트 제작 클램프의 컴퓨터 지원 설계 도면. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_2-Press_Die-Generic_3D.STEP" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 3: 스탬프 형상, 3D 프린터와 함께 사용 하기 위해 적합 한 3D 표현. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_3-stamp.STL" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 4: SubVI MuStLiMo_si_initialize.vi, 인 motion_control.vi 위한 SubVI에 대 한. 모션에 대 한 매개 변수를 대화 상자에 항목을 변환합니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_4-compute_init_param.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 5: SubVI 여러 직선 라인 Moves_simplified.vi, 인 motion_control.vi 위한 SubVI에 대 한. 모션에 대 한 매개 변수를 대화 상자에 항목을 변환합니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_5-compute_parameters.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 6: SubVI position_tracker.vi에 대 한. 카운터 트랙 치환 선형 인코더에서 입력입니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_6-Counter-Continuous_Output.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 7: 기반 LabVIEW 프로젝트. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_7-in_vitro_neurotrauma.lvproj" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 8: 탑 이동 장치 레벨 VI. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_8-motion_control.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 9: SubVI motion_control.vi에 대 한. 접시를 뻗어 급속 한 변위를 실행 합니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_9-Multiple_Straight_Line_Moves_simplified.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 10: SubVI motion_control.vi에 대 한. 스테이지를 이동 하는 느린 변위를 실행 합니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_10-MuStLiMo_si_initialize.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 11: SubVI motion_control.vi에 대 한. Motion_control.vi 컨트롤 패널에서 (보통 언더샘플링된) 변위 역사를 플롯합니다. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_11-plot_displacement.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 12: 변위 역사를 기록 하는 레벨 6 톱. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_12-position_tracker.vi" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 13: 포함 Variable2, motion_control.vi와 position_tracker.vi 사이 통신. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_13-Untitled_Library_2.lvlib" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 14: 인쇄 회로 기판에 대 한 도식. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_14-interconnector_circuit_board.dch" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 코드 파일 15: 인쇄 회로 보드 레이아웃. <a href="/files/ftp_upload/57305/Supplementary_Code_File_15-interconnector_circuit_board.dip" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

여기 선물이 외상 영향 관련 날짜 표시줄에 96-잘 형식에서 스트레치 상해의 모델 인간 생체 외에서 하는 방법. 이 기계적 모욕, 경작 및 셀 부상, 이미징, 및 상해 계량 높은 콘텐츠 분석 측정 stretchable 번호판 조작에 대 한 메서드가 포함 됩니다.

인간의 고속 스트레치 부상에 대 한 방법 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 96 잘 형식

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven ...

method-for-high-speed-stretch-injury-human-induced-pluripotent-stem

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

6.9K 조회수.  NorthShore University HealthSystem. 여기 선물이 외상 영향 관련 날짜 표시줄에 96-잘 형식에서 스트레치 상해의 모델 인간 생체 외에서 하는 방법. 이 기계적 모욕, 경작 및 셀 부상, 이미징, 및 상해 계량 높은 콘텐츠 분석 측정 stretchable 번호판 조작에 대 한 메서드가 포함 됩니다.

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Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

연구

발생학

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, many protocols for differentiating hiPSCs into neurons have been developed. However, these protocols are often slow with high variability, low reproducibility, and low efficiency. In addition, the neurons obtained with these protocols are often immature and lack adequate functional activity both at the single-cell and network levels unless the neurons are cultured for several months. Partially due to these limitations, the functional properties of hiPSC-derived neuronal networks are still not well characterized. Here, we adapt a recently published protocol that describes production of human neurons from hiPSCs by forced expression of the transcription factor neurogenin-212. This protocol is rapid (yielding mature neurons within 3 weeks) and efficient, with nearly 100% conversion efficiency of transduced cells (&#62;95% of DAPI-positive cells are MAP2 positive). Furthermore, the protocol yields a homogeneous population of excitatory neurons that would allow the investigation of cell-type specific contributions to neurological disorders. We modified the original protocol by generating stably transduced hiPSC cells, giving us explicit control over the total number of neurons. These cells are then used to generate hiPSC-derived neuronal networks on micro-electrode arrays. In this way, the spontaneous electrophysiological activity of hiPSC-derived neuronal networks can be measured and characterized, while retaining interexperimental consistency in terms of cell density. The presented protocol is broadly applicable, especially for mechanistic and pharmacological studies on human neuronal networks.

We modify and implement a previously published protocol describing the rapid, reproducible, and efficient differentiation of human&#160;induced&#160;Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) into excitatory cortical neurons12. Specifically, our modification allows for control of neuronal cell density and use on micro-electrode arrays to measure electrophysiological properties at the network level.

마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized synapse that transmits action potentials from the motor neuron to skeletal muscle for mechanical movement. The architecture of the NMJ structure influences the functions of the neuron, the muscle and the mutual interaction. Previous studies have reported many strategies by co-culturing the motor neurons and myotubes to generate NMJ in vitro with complex induction process and long culture period but have struggled to recapitulate mature NMJ morphology and function. Our in vitro NMJ induction system is constructed by differentiating human iPSC in a single culture dish. By switching the myogenic and neurogenic induction medium for induction, the resulting NMJ contained pre- and post- synaptic components, including motor neurons, skeletal muscle and Schwann cells in the one month culture. The functional assay of NMJ also showed that the myotubes contraction can be triggered by Ca++ then inhibited by curare, an acetylcholine receptor (AChR) inhibitor, in which the stimulating signal is transmitted through NMJ. This simple and robust approach successfully derived the complex structure of NMJ with functional connectivity. This in vitro human NMJ, with its integrated structures and function, has promising potential for studying pathological mechanisms and compound screening.

Here we provide a protocol to generate in vitro NMJs from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). This method can induce NMJs with mature morphology and function in 1 month in a single well. The resulting NMJs could potentially be used to model related diseases, to study pathological mechanisms or to screen drug compounds for therapy.

인체 유발 만능 줄기 세포에서 유도 된 체외 신경 근육 정션

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized synapse that transmits action potentials from the motor neuron to skeletal muscle for mechanical ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

생물학

Post-differentiation Replating of Human Pluripotent Stem Cell-derived Neurons for High-content Screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model system to explore disease mechanisms and carry out high content screening (HCS) to interrogate compound libraries or identify gene mutation phenotypes. However, with human cells the transition from NPC to functional, mature neuron requires several weeks. Synapses typically start to form after 3 weeks of differentiation in monolayer culture, and several neuron-specific proteins, for example the later expressing pan-neuronal marker NeuN, or the layer 5/6 cerebral cortical neuron marker CTIP2, begin to express around 4-5 weeks post-differentiation. This lengthy differentiation time can be incompatible with optimal culture conditions used for small volume, multi-well HCS platforms. Among the many challenges are the need for well-adhered, uniformly distributed cells with minimal cell clustering, and culture procedures that foster long-term viability and functional synapse maturation. One approach is to differentiate neurons in a large volume format, then replate them at a later time point in HCS-compatible multi-wells. Some main challenges when using this replating approach concern reproducibility and cell viability, due to the stressful disruption of the dendritic and axonal network. Here we demonstrate a detailed and reliable procedure for enzymatically resuspending human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons after their differentiation for 4-8 weeks in a large-volume format, transferring them to 384-well microtiter plates, and culturing them for a further 1-3 weeks with excellent cell survival. This replating of human neurons not only allows the study of synapse assembly and maturation within two weeks from replating, but also enables studies of neurite regeneration and growth cone characteristics. We provide examples of scalable assays for neuritogenesis and synaptogenesis using a 384-well platform.

This protocol describes a detailed procedure for resuspending and culturing human stem cell derived neurons that were previously differentiated from neural progenitors in vitro for multiple weeks. The procedure facilitates imaging-based assays of neurites, synapses, and late-expressing neuronal markers in a format compatible with light microscopy and high-content screening.

신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅

Neurons differentiated in two-dimensional culture from human pluripotent stem-cell-derived neural progenitor cells (NPCs) represent a powerful model ...

신경과학

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human neurons, which may contribute to neurodegeneration in various disease states. Although it is challenging to examine mitochondrial dynamics in live human nerves, such paradigms are critical for studying the role of mitochondria in neurodegeneration. Described here is a protocol for analyzing mitochondrial transport and mitochondrial morphology in forebrain neuron axons derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). The iPSCs are differentiated into telencephalic glutamatergic neurons using well-established methods. Mitochondria of the neurons are stained with MitoTracker CMXRos, and mitochondrial movement within the axons are captured using a live-cell imaging microscope equipped with an incubator for cell culture. Time-lapse images are analyzed using software with &#34;MultiKymograph&#34;, &#34;Bioformat importer&#34;, and &#34;Macros&#34; plugins. Kymographs of mitochondrial transport are generated, and average mitochondrial velocity in the anterograde and retrograde directions is read from the kymograph. Regarding mitochondrial morphology analysis, mitochondrial length, area, and aspect ratio are obtained using the ImageJ. In summary, this protocol allows characterization of mitochondrial trafficking along axons and analysis of their morphology to facilitate studies of neurodegenerative diseases.

Impaired mitochondrial transport and morphology are involved in various neurodegenerative diseases. The presented protocol uses induced pluripotent stem cell-derived forebrain neurons to assess mitochondrial transport and morphology in hereditary spastic paraplegia. This protocol allows characterization of mitochondrial trafficking along axons and analysis of their morphology, which will facilitate the study of neurodegenerative disease.

유전 경직 성 하반신 마비에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 미토콘드리아 수송 및 형태 분석

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

Production of Human Neurogenin 2-Inducible Neurons in a Three-Dimensional Suspension Bioreactor

The derivation of neuronal lineage cells from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) marked a milestone in brain research. Since their first advent, protocols have been continuously optimized and are now widely used in research and drug development. However, the very long duration of these conventional differentiation and maturation protocols and the increasing demand for high-quality hiPSCs and their neural derivatives raise the need for the adoption, optimization, and standardization of these protocols to large-scale production. This work presents a fast and efficient protocol for the differentiation of genetically modified, doxycycline-inducible neurogenin 2 (iNGN2)-expressing hiPSCs into neurons using a benchtop three-dimensional (3D) suspension bioreactor.
In brief, single-cell suspensions of iNGN2-hiPSCs were allowed to form aggregates within 24 h, and neuronal lineage commitment was induced by the addition of doxycycline. Aggregates were dissociated after 2 days of induction and cells were either cryopreserved or replated for terminal maturation. The generated iNGN2 neurons expressed classical neuronal markers early on and formed complex neuritic networks within 1 week after replating, indicating an increasing maturity of neuronal cultures. In summary, a detailed step-by-step protocol for the fast generation of hiPSC-derived neurons in a 3D environment is provided that holds great potential as a starting point for disease modeling, phenotypic high-throughput drug screenings, and large-scale toxicity testing.

This article describes a protocol for the generation of human induced pluripotent stem cell-derived neurons in a benchtop 3D suspension bioreactor.

3차원 현탁 생물반응기에서 인간 뉴로제닌 2-유도성 뉴런의 생산

The derivation of neuronal lineage cells from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) marked a milestone in brain research. Since their first ...

An In Vitro Model of Stretch Injury in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons

Source: Phillips, J. K. et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/57305">Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates the process of inducing stretch injury on human induced pluripotent stem cell-derived neurons (hiPSCNs). The cells are taken in a bottomless multi-well plate with a silicone membrane attached. Controlled mechanical stress is applied on the membrane to induce cytoskeletal disruption and cell membrane damage, inducing a stretch injury phenotype in the cells.

1. Plate Fabrication 

	Plasma-treat a 96-well plate top with a 200 W plasma cleaner (see Table of Materials) for 60 s on high power, placing it ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Trauma

A Co-culture Method to Model Neuron-Oligodendrocyte Interactions

Source: Assetta, B.,et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/61778">Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates the establishment of a co-culture of human induced neurons (iNs) and induced oligodendrocyte precursor cells (iOPCs). iNs are mixed with iOPCs in a co-culture and then incubated to support the maturation of both iNs into neurons and iOPCs into oligodendrocytes. Neurons form synaptic connections with other neurons and oligodendrocytes, while oligodendrocytes develop myelin sheaths around the neurons&#39; axons.

1. Human neuron induction from human pluripotent stem cells

	Lentivirus preparation (~5 days)
	
		Plate ~1 million Human embryonic kidney 293T (HEK293T) ...