우리 감사 헤 쓰쓰이 D. 구리 유전자 변형 식물, 포함 T. fournieriRPS5Ap::H2B tdTomato 선, A. thaliana UBQ10pro::H2B mClover 선 각각 제공. 이 작품에 의해 연구소의 Transformative 바이오-의 분자 나고야 대학과 일본 고급 식물 과학 네트워크를 지원 했다. 이 작품에 대 한 재정 지원 일본 과학과 기술 기관에서 교부 금에 의해 제공 되었다 (ERATO 프로젝트 부여 없음. 남에 대 한 JPMJER1004), 선진적인 과학 연구에 대 한 혁신적인 지역 (번호. JP16H06465 고 남에 대 한 JP16H06464), 그리고 도전적인 탐구 연구 (no. 26600061에 대 한 부여 뉴욕 및 그랜트 no. 25650075와 15 K 14542와이 스에 대 한)에 대 한 과학 진흥 (JSP) 연구비를 위한 일본 사회.

1. PDMS Microdevice 꽃가루 관 성장 검사의 제작 및 Protonemata 이끼
참고: 우리는 실리콘 웨이퍼에 PDMS 몰드를 준비 하 maskless 사진 평판 장비를 사용. 시스템의 운영에 관한 세부 사항은이 원고에서 생략 됩니다. 표준 사진 평판 기술은9 는 포토 마스크를 사용 하 여이 원고에 설명 된 PDMS 몰드를 만드는 데 사용할 수 있습니다.
<ol><li>11g 사전 폴리머 PDMS 혼합물을 부 어 (탄성 기본: 10: 1의 비율로 경화제) 각 4 인치 형으로.</li>
	<li>형 단계 1.1 진공 챔버에 20 분에 드</li>
	<li>비 대류 오븐에서 90 분 65 ° C에서 경화 후, 금형에서 PDMS 레이어를 껍질 하 고 생 검 펀치를 사용 하 여 유체 채널에 액세스 구멍을 펀치. 참고: 꽃가루 관 장치에 대 한 구멍의 크기는 암 술의 직경을 반영 하기 위해 조정 될 해야 합니다. 이 값이 따라서 종에 의해 달라질 수 있습니다. 이 실험에서 우리는 암 술만 위한 1 m m 구멍 및 액체 중간 저수지에 대 한 1.5 m m 구멍 찍 었다고. 모스 protonemata 장치는 4mm 구멍 샘플 저수지에 대 한 사용 되었습니다.</li>
	<li>PDMS 층 및 유리 하단 접시 (지름에서 3.5-5 c m) 50 플라즈마 공기 노출 s.</li>
	<li>미세 네트워크를 완전히 봉쇄 비 대류 오븐에서 30 분 동안 유리 바닥 접시와 65 ° C에서 열 PDMS 레이어를 누릅니다.</li>
</ol>2. 루트 머리카락에 대 한 PDMS Microdevice의 제조
<ol><li>1.1-1.3 루트 및 루트 머리 렌에 대 한 두 개의 PDMS 레이어를 준비 하는 금형을 사용 하 여 단계를 반복 합니다. 참고: 루트 microdevice에서 액체 중간 저수지에 2mm 구멍을 사용.</li>
	<li>노출 50 플라즈마 공기 PDMS 레이어 모두 s.</li>
	<li>맞춤 바탕 화면 동기 기를 사용 하 여 stereomicroscope에서 2 개의 PDMS 층을 조립. 참고: 이러한 PDMS 레이어에 microchannels 서로 직면해 야 합니다. 조립, 전에 두 레이어에 정렬 마크 일치 하는지 확인 하십시오.</li>
	<li>미세 네트워크를 완전히 봉쇄 비 대류 오븐에서 30 분 65 ° C에서 열.</li>
	<li>생성 된 microdevice에서 커버 슬립을 제거 하 고 장치는 직경 5 cm 유리 하단 접시에 놓습니다.</li>
</ol>3. 준비 체 외에서 세포 배양 매체의 꽃가루 관 (Torenia fournieri)에 대 한
<ol><li>20 분에 대 한 수정된 니 매체 앞에서 설명한15 및 고압 121 ° C에서 매체를 준비 합니다. 참고: 수정 니 매체의 조성은 NH43 (80 mg/L), 알 것3 (125 mg/L), Ca (3)2‧4H2O (500 mg/L), MgSO4‧7H2O (125 mg/L), KH2포4 (125 mg/L ), MnSO4‧4H2O (3 mg/L), ZnSO4‧7H2O (0.5 mg/L), H3보3 (10 mg/L), CuSO4‧5H2O (0.025 mg/L), 총2MoO4‧2H2O (0.025 mg/L), 자당 (50000 mg/L), 그리고 카 세 인 (500 mg/L). 준비 된 매체 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 4 개월 동안 적어도.</li>
	<li>26% (w/v) 폴 리 에틸렌 글리콜 압력가 이온된 수를 사용 하 여 준비 하 고 0.3 µ m 기 공 필터 솔루션을 필터링. 참고: 준비 중간 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 1 개월.</li>
	<li>3.1 및 3.2 1:1 (v/v) 비율에 단계에서 준비 하는 시 약을 혼합. 참고:이 매체 준비 되어야 한다 신선한 각 사용에 대 한.</li>
</ol>4. 준비 체 외에서 세포 배양 매체의 루트 머리카락 (애기 thaliana)에 대 한
<ol><li>0.215% (w/v) 村 重 & Skoog 매체, 0.05% (w/v) MES, 1% (w/v) 자당과 이온된 수 한 천 1% (w/v)의 솔루션을 준비 합니다. 압력솥 20 분 동안 121 ° C에서 솔루션.</li>
</ol>5. 준비 체 외에서 세포 배양 매체의 모스 Protonemata (Physcomitrella patens)에 대 한
<ol><li>전 모스 protonemata BCDAT 중간16 페 트리 접시에 품 어. 참고: BCDAT 매체의 조성은 1mm MgSO4, 10 m m 알 것3, 45 µ M FeSO4, 1.8 m m KH2포4 (pH 6.5 코와 조정), 추적 요소 솔루션 (0.22 μ M CuSO4, 0.19 µ M ZnSO4, 10 µ M H3보 3, 0.1 µ M 총2MoO4, 2 µ M MnCl2, 0.23 µ M CoCl2및 0.17 µ M 기), 1 m m CaCl2및 5 밀리미터 diammonium (+)-주석산.</li>
	<li>문화는 microdevice에서 BCDATG 매체에 이끼. 참고: BCDATG 매체는 0.5% (w/v) 포도와 BCDAT 매체. 준비 된 매체는 1 개월 4 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 생체 외에서 Culturing T. fournieri 는 Microdevice에서 꽃가루 관의
<ol><li>진공 챔버에 꽃가루 관 microdevice을 놓고 20 분 드.</li>
	<li>진공 약 실에서 있는 microdevice를 제거 하 고 아주 좋은 팁는 micropipette를 사용 하 여 암 술 입구에 성장 매체를 소개. 같은 매체에 그들의 정상에 남아 있는 우물 채우십시오. 내부는 microchannels 만든 진공에 의해 매체와 모든 microchannels 가득 때까지 몇 분 동안 기다립니다.</li>
	<li>접시에 습도 유지 하기 위해 유리 하단 접시에 몇 가지 젖은 종이 타월을 놓습니다.</li>
	<li>야생-타입에서 꽃가루 곡물을 전송 해 부 바늘을 사용 하 여 그것의 오명에 T. fournieri '파란색과 흰색' 꽃. 참고: 또한 유전자 변형 T. fournieri 와 함께이 실험 실시 '바이올렛 왕관' 꽃 ( RPS5Ap::H2B-tdTomato 17선), 붙일 레이블된 정자 세포와 식물 핵을 포함 하는 꽃가루 관.</li>
	<li>잘라 좋게 스타일 (1 ㎝ 길이)는 블레이드를 사용합니다.</li>
	<li>그림 2와 같이 장치에 컷된 스타일을 삽입 합니다.</li>
	<li>접시에는 뚜껑을 넣고 테이프로 봉인.</li>
	<li>어둠 속에서 5-6 h 28 ° C에 인큐베이터에 장치를 넣습니다.</li>
</ol>7. A. thaliana 루트 머리는 Microdevice에서의 생체 외에서 Culturing
참고: 단계 7.1 7.9 (제외 7.3 및 7.5) 층 류 후드에서 수행 되어야 한다.
<ol><li>A. thaliana 컬럼비아 (열-0)에서 종자 소독와 유전자 변형 라인 UBQ10pro::H2B mClover (형광 핵 마커 포함) 5 분에 대 한 살 균 액체 (5% (v/v) 가구 표 백제와 0.02% (v/v) 트라이 톤 X-100)에서 그들을 몸을 담글 하 여.</li>
	<li>철저 하 게 린스 압력가 마로 소독 물 살 균된 씨.</li>
	<li>어둠 속에서 4 ° C에서 2 일 동안 물에 씻어 서 씨앗 저장 합니다.</li>
	<li>밤새 UV 빛에서 microdevice를 소독.</li>
	<li>진공 챔버에는 microdevice을 놓고 20 분 드.</li>
	<li>장치는 micropipette 사용 하 우물에 성장 매체를 소개 합니다. 진공에서 매체와 모든 microchannels 채웁니다 때까지 몇 분 정도 기다립니다.</li>
	<li>접시에 습도 유지 하기 위해 유리 하단 접시에 압력가 젖은 종이 타월을 놓습니다.</li>
	<li>장치의 입구에 소독된 씨앗을 전송 합니다.</li>
	<li>접시에는 뚜껑을 넣고 테이프로 봉인.</li>
	<li>연속 하얀 빛 아래에서 22 ° C에서 인큐베이터에 수직으로 장치를 놓습니다.</li>
	<li>외피의 4-10 일 후 루트 머리 성장 확인. 밝은 분야와는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 형광 이미지를 얻을.</li>
</ol>8. 피. patens (이끼) 미세 장치에서 Protonemata의 생체 외에서 Culturing
참고: 단계 8.2 8.6 (8.3)을 제외 하 고 층 류 후드에서 수행 되어야 한다.
<ol><li>25 ° c.에 연속 하얀 빛 아래에서 1 주일 동안 배양 접시에 셀로판으로 덮여 BCDAT 매체에 P. patens 스트레인 Gransden 200418 preculture</li>
	<li>UV 광원을 층 류 두건에서 하룻밤 microdevice 소독.</li>
	<li>진공 챔버에는 microdevice을 놓고 20 분 드.</li>
	<li>성장 매체는 micropipette 사용 하 우물에 소개. 진공에서 매체와 모든 microchannels 채웁니다 때까지 몇 분 정도 기다립니다.</li>
	<li>접시는 접시에 습도 유지 하기 위해 microdevice를 주변에 압력가 물을 추가 합니다.</li>
	<li>microdevice의 입구에 모스 protonemata 조직의 작은 조각을 전송 하 고 연속 하얀 빛 아래에서 25 ° C에서 인큐베이터에서 조직 문화.</li>
	<li>외피의 2-3 주 후 모스 protonemata 성장 확인. 현미경을 사용 하 여 밝은 필드 이미지를 얻을.</li>
</ol>9. T. fournieri 꽃가루 관 성장 시간 경과 영상
<ol><li>이미지 수집 하드웨어를 갖춘 거꾸로 형광 현미경에는 microdevice를 배치 (예., CCD 카메라) 및 소프트웨어. Microgap 위치를 찾아. 참고: 이미지 수집 소프트웨어 사용 했습니다 상용 제품 (자료 테이블). µManager와 같은 오픈 소스 현미경 소프트웨어 사용할 수 온라인 (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager) 이기도합니다. 더 높은 해상도 이미지를 현미경에 현미경 콘덴서를 설치 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>모든 10 필드 밝은 이미지를 캡처 현미경 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 s.</li>
	<li>관찰 하기 위해 붙일 레이블된 정자 세포와 RPS5Ap::H2B tdTomato 라인의 꽃가루 관 식물 핵, 561 nm 레이저는 견본을 비추는 및 대역 통과 광 필터를 사용 하 여 (578/105 nm). 참고: 꽃가루 관 성장의 시간 경과 이미지는 자주 체포 되었다, 비록 이미징 성장에 영향을 미치는 듯 하지 않았다. 그러나, 그것은 항상 레이저 강도, 노출 시간, phototoxicity 및 photobleaching는 fluorophore의 최소화 하기 위해 시간 간격을 최소화 하 고 좋습니다.</li>
	<li>이미지의 명암과 밝기를 조정 하 고 ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/)를 사용 하 여 비디오 파일을 준비.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Higashiyama, T., Takeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanism+and+Key+Molecules+Involved+in+Pollen+Tube+Guidance.">The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance.</a> Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).</li><li>Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U., Obermeyer, G., Feij&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cytomechanical+forces+on+growing+pollen+tubes.">Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes.</a> Pollen Tip Growth. , 65-85 (2017).</li><li>Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+modified+carbon+allocation+on+turgor,+osmolality,+sugar+and+potassium+content+and+membrane+potential+in+the+epidermis+of+transgenic+potato+(Solanum+tuberosum+L.)+plants.">Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants.</a> J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).</li><li>Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+turgor+pressure+of+growing+lily+pollen+tubes.">The turgor pressure of growing lily pollen tubes.</a> Protoplasma. 198, 1-8 (1997).</li><li>Vogler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pollen+tube:+a+soft+shell+with+a+hard+core.">The pollen tube: a soft shell with a hard core.</a> Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).</li><li>Shamsudhin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallelized+pollen+tube+guidance+and+mechanical+measurements+on+a+Lab-on-a-Chip+platform.">Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform.</a> PloS one. 11 (12), e0168138 (2016).</li><li>Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feij&#243;, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pollen+tube+journey+in+the+pistil+and+imaging+the+in+vivo+process+by+two-photon+microscopy.">The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy.</a> J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).</li><li>Metzner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+MRI+and+X-ray+CT+technologies+for+3D+imaging+of+root+systems+in+soil:+Potential+and+challenges+for+root+trait+quantification.">Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification.</a> Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).</li><li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup.">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li><li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Fluorescence+Imaging+of+Arabidopsis+Root+Growth+with+Rapid+Manipulation+of+The+Root+Environment+Using+the+RootChip.">Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression.">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).</li><li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-in-chip:+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis.">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703 (2011).</li><li>Bascom, C. S., Wu, S. -. Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Growth+of+Moss.">Long-Term Growth of Moss.</a> in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).</li><li>Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+in+vitro+of+the+pollen+tube+to+the+naked+embryo+sac+of+Torenia+fournieri.">Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri.</a> Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).</li><li>Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tagged+mutagenesis+and+gene-trap+in+the+moss,+Physcomitrella+patens+by+shuttle+mutagenesis.">Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis.</a> DNA Res. 7, 9-17 (2000).</li><li>Maruyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Control+by+Each+Female+Gamete+Prevents+the+Attraction+of+Multiple+Pollen+Tubes.">Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes.</a> Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).</li><li>Rensing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physcomitrella+genome+reveals+evolutionary+insights+into+the+conquest+of+land+by+plants.">The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants.</a> Science. 319, 64-69 (2008).</li><li>Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capability+of+tip-growing+plant+cells+to+penetrate+into+extremely+narrow+gaps.">Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps.</a> Sci. Rep. 7 (1), 1403 (2017).</li><li>Dolan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+relationships+and+cell+patterning+in+the+root+epidermis+of+Arabidopsis.">Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis.</a> Development. 120, 2465-2474 (1994).</li><li>Denais, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+envelope+rupture+and+repair+during+cancer+cell+migration.">Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration.</a> Science. 352 (6283), 353-358 (2016).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계 위의 결과 얻기 위해 정확 하 게 지켜질 필요가 있다. 첫째, PDMS 층 및 유리 하단 접시 표면 둘 다 대우 되어야 한다 플라즈마로 충분 한 양의 결합 하기 전에 시간에 대 한. 그렇지 않으면, 팁 성장 세포는 microgaps를 건너는 동안 PDMS 층 유리 표면에서 분리 로컬 수 있습니다. 루트 머리와 모스 protonemata 프로토콜에서 다른 중요 한 단계는 microdevice의 살 균입니다. 일반적으로, 루트 머리카락과 모스 protonemata 세포는 몇 주에 대 한 교양은 microdevice에 있이 필요가 있다. 없이 장치를 살 균, 미생물은 이러한 팁 성장 세포의 성장에 영향을 미칠 수 번성 수 있습니다. 실험 반나절 내 결론은 꽃가루 관 장치의 살 균, 중요 하지 않습니다. 우리는 정기적으로 살 균 없이 꽃가루 관 장치를 사용 하 고 실험 하는 동안 어떤 바람직하지 않은 효과 관찰 하지 않았다.
아닌 디자인 관심사의 세포에 따라 수정 해야 합니다. 우리의 작품에서는, A. thaliana 루트 머리 실험에 사용 된 채널 디자인 T. fournieri 꽃가루 관 및 P. patens protonemata 실험 사용에서 달랐다. 다른 장치는 필요한 샘플 있기 때문에 다른 치수; 예를 들어, 루트 머리는 꽃가루 관 및 모스 protonemata 보다 훨씬 짧습니다. 따라서, 우리의 루트 머리 장치 microgap 지역 주요 루트 채널에 인접 한 했다 되도록 설계 되었다. 채널 디자인 루트 머리 장치를 준비 하기 위한 절차는 또한 꽃가루 관 또는 모스 protonemata 사용 하는 프로시저에서 다릅니다. 꽃가루 관 및 모스 protonemata 연구 microchannels 유리 하단 접시에 대 한 봉인 된 PDMS 층을 포함 하는 microdevice를 사용 했습니다. 그러나 루트 머리카락을 공부 하는 데 사용 하는 장치 2 개의 PDMS 층을 구성 하는,:는 아닌 함께 상위 레이어 (깊이: 200 µ m) 아래 계층에 대 한 기본 루트는 봉인에 대 한 포함 된 microchannels (깊이: 4 µ m) 루트 머리카락에 대 한. 실리콘 금형을 제작 하기 위해 고용 되었다 표준 사진 평판 기술은 주위 5: 1의 가로 세로비로 제한 됩니다. 따라서, 1 µ m 넓은 간격을 만들려면 채널 높이 약 5 µ m로 제한 될 것입니다. 그것은 또한 기술적으로 정확 하 게 깊은 채널에 맞게 도전 (예., 200 µ m) 실리콘 몰드에 1 µ m 와이드 갭 근처. 따라서, 우리 주요 루트 및 루트 머리카락에 대 한 별도 PDMS 레이어를 준비 하 고 그들을 함께 밀봉 하 여 장치를 건설.
이 프로토콜은 성공적으로 성장 하는 과정 (보충 영화 1, 2)는 microgaps 통해 꽃가루 관의 팁을 시각화 하는 데 사용 됩니다, 하는 동안 시간 경과 루트 머리와 모스 protonemata 신장 microgap 영역에서의 영상 더 있을 것 이라고 도전. A. thaliana 루트 머리카락 경작에 사용 되는 microdevice에는 microgaps 위치 (4 µ m)에 있는 사이드 채널의 높이 이므로 루트 성장 챔버 (200 µ m)의 그것 보다 훨씬 얕은 대부분 루트 머리카락 쪽 채널에 진행 할 수 없습니다. 경우에 루트 머리카락 쪽 채널 입구 발견 때 그들은 그것을 입력 것입니다 예측 하기 어렵다. microgap에서 루트 머리 성장의 시간 경과 이미지 캡처, 이미지 수집을 위한 여러 위치에 위치 하도록 프로그래밍할 수 있는 자동화 된 무대를 갖춘 현미경을 사용 하는 것이 좋습니다. 이러한 기기를 사용할 수 없는 경우 루트 머리카락을 이미 측면 채널 입력 하지만 아직는 microgaps 넘어 하지에 대 한 검색 하는 것이 좋습니다. A. thaliana 루트 머리카락의 성장 속도가 훨씬 느린 이후 (일반적으로 1-2.5 µ m/분20) T. fournieri 꽃가루 관 (일반적으로 22-23 µ m/min19) 보다, 그 루트 머리카락의 시간 경과 이미지를 캡처할 수 있습니다 그는 교차 하는 microgaps에 대해 있습니다. 다른 한편으로, 모스 protonemata 관측 장기간된 관찰 기간 느린 성장 비율 때문에 필요 하기 때문에이 연구를 위해 독점적으로 사용 될 수 있는 시간 경과 시스템이 필요 합니다.
여기에 제시 된 미세 접근 우리가 매우 좁은 공간을 통해 길게 하기 팁 성장 하는 식물 세포의 기능 연구를 첫 번째 방법입니다. 이러한 렌 조사 세포 벽 생 합성 및 성장 하는 팁의 무결성과 관련 된 유전자의 기능 분석 검사에 유용 수 있습니다 그들의 침투 능력을 통해 셀. 또한, Denais 외. 21 최근 핵 파열 시연 및 복구 메커니즘 미세 장치에서 준비 하는 한정 된 공간을 통해 암 세포를 압박 하 여 비슷한 메커니즘을 사용 하 여 꽃가루 관에 존재 하는 여부를 연구 수 있습니다 우리의 장치입니다. 이 새로 개발된 된 실험 플랫폼 조사 개별 셀을 사용할 수 있습니다 물리적으로 제한 된 공간에 대응 하 고 따라서 팁 성장 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 향상 시킬 수 있습니다.

낙인에 꽃가루 곡물 발 아, 후 각 곡물 계란 세포 및 중앙 셀 더블 수정에 대 한 난에 정자 세포를 운반 단일 꽃가루 관을 생성 합니다. 꽃가루 관 스타일을 통해 연장 하 고 결국은 난을 도달 하는 그들의 방법1에 따라 여러 지도 신호를 감지 하 여. 신장, 동안 꽃가루 관 발생 하는 일련의 물리적 장벽; 전송 추적 셀, 채워집니다 그리고 꽃가루 관 그들의 대상 (그림 1A)2도달 하 난의 분 micropylar 개통을 입력 해야 합니다. 따라서, 꽃가루 관은 그들의 주위에서 압축 스트레스를 견 뎌 하는 동안 물리적 장애물을 관통할 수가 있어야 합니다. 루트 머리 포장된 토양 입자 (그림 1B)의 형태로 환경에서 물리적 장애물을 견딜 해야 합니다 팁 성장 하는 식물 세포의 또 다른 유형입니다.
꽃가루 관의 다양 한 기계적 특성 연구, turgor 압력 및 영역의 셀의 꼭대기, 초기 plasmolysis3,방법4 와 셀룰러 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 측정 될 수 있는 강성을 포함 한 (CFM) 5 , 6, 각각. 그러나, 이러한 방법은 혼자 꽃가루 관 성장 경로 따라 물리적 장벽을 통해 elongating 수 인지 공개 하지 않습니다. 모니터링 vivo에서 꽃가루 관 신장 수는 대체 기법 두 광자 현미경7이다. 그러나,이 방법으로, 그것은 개별 꽃가루 관의 형태학 적 변화를 관찰 하기 어려운 난 조직 깊숙한. 또한, 루트 머리 성장 토양에서 수 수 시각 계산 x 선 단층 촬영 (CT) 및 자기 공명 영상 (MRI)8를 사용 하 여 낮은 해상도와. 여기, 우리는 기존의 현미경에는 셀의 변형 과정의 고해상도 이미지를 사용할 수 있는 방법 제시.
여기에 설명 된 방법의 전반적인 목표는 꽃가루 관, 루트 머리를 포함 하 여 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능을 시각화 하 고 protonemata 매우 작은 공간에서 이끼입니다. 폴 리-dimethylsiloxane (PDMS) 렌이이 원고에 광학 투명 하 고 공기 침투성, 우리 수 장치 내부에 살아있는 세포를 문화 고 현미경 아래에서 그들의 성장 행동 관찰. 그것은 또한 마이크로 만들 수 ~ 금형의 사용과 소프트 리소 그래피 기술9 나노미터 스케일 공간. 이러한 기능은 물리적으로 밀폐 된 환경에 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능을 공부 수 있습니다.
이 작품에서는, 우리는 미세 장치에 1 µ m 넓은 간격 (높이 4 µ m)를 건설 하 고 원통형 꽃가루 관 (약 8 µ m)의 직경 보다 훨씬 작은 이러한 인공 장애물을 관통 하는 꽃가루 관의 기능을 검사. 이 실험 플랫폼 microgaps 꽃가루 관의 응답을 시각화 하 고 셀의 변형 과정을 추적 하 고 응답의 시간 경과 이미지를 캡처 수 있습니다. 우리는 또한 렌 루트 머리카락과 모스 protonemata의 침투 능력을 조사 하는 데 사용할 수 있는 개발. 여러 렌 공장 루트10,11,12,13 모스 protonemata14 성장과 높은 해상도에서 시각화를 가능 하 게 날짜에 보고 되었습니다. 우리의 장치에 루트 머리 성장 채널 시리즈 루트 성장 챔버에 수직으로 연결 하 고 개별 루트 머리 (직경에서 약 7 µ m)는 1 µ m 넓은 간격으로 유체 채널 가이드. 우리는 또한 이끼를 경작이 물리적 장벽에 대 한 그들의 응답을 검사 하는 microgaps를 포함 하는 microdevice에서 protonemata (직경에서 약 20 µ m). 제안 된 미세 기반 접근 방식을 다른 현재 사용할 수 있는 방법으로 시험 될 수 있는 매우 작은 공간을 통해 연장 하는 다양 한 팁 성장 하는 식물 세포의 기능을 탐구 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="927">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:216px;">PDMS</td>
			<td style="width:165px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard184</td>
			<td style="width:427px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Murashige &#38; Skoog Medium</td>
			<td style="width:165px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:119px;">392-00591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MES</td>
			<td style="width:165px;">Dojindo</td>
			<td style="width:119px;">345-01625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:165px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:119px;">196-00015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mm glass-bottom dish</td>
			<td style="width:165px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">D210402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm glass-bottom dish</td>
			<td style="width:165px;">Iwaki&#160;</td>
			<td style="width:119px;">3971-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Surgical blade</td>
			<td style="width:165px;">Feather</td>
			<td style="width:119px;">No.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">biopsy punches</td>
			<td style="width:165px;">Harris</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Uni-Core</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gel loading tips</td>
			<td style="width:165px;">Bio-Bik</td>
			<td style="width:119px;">124-R-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:165px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:216px;">CSU-W1</td>
			<td style="width:165px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>No Catalog number is avairable for this customized microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MetaMorph imaging software</td>
			<td style="width:165px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of microfluidic devices to study the elongation capability of tip-growing plant cells in extremely small spaces

Vivo에서, 팁 성장 하는 식물 세포의 물리적 장벽; 시리즈를 극복 하기 위해 필요한 그러나, 연구 방법론 등 제한적인 조건에서 세포 행동을 시각화에 부족 합니다. 이 문제를 해결 하려면 폴 리-dimethylsiloxane (PDMS) 기판에 성장 챔버 팁 성장 식물, 마이크로 조작 좁은 간격 (~ 1 μ m)의 시리즈를 포함 하는 셀에 대 한 개발 했습니다. 이 투명 한 소재를 사용 하면 시간 경과 영상에 의해 microgap 침투 하는 동안 개별 셀에 팁 신장 프로세스를 모니터링할 수 있습니다. 그들은 관통는 microgap 꽃가루 관의 형태학 변화 관찰이 실험 플랫폼을 사용 하 여 합니다. 우리이 과정 붙일 레이블된 식물 핵의 모양에 동적 변화와 꽃가루 관에서 정자 세포를 점령. 또한, 우리 1 µ m 간격 침투 루트 머리카락과 모스 protonemata의 기능을 시연 했다. 이 체 외에 플랫폼은 물리적으로 제한 된 공간에 개별 세포 응답을 공부 하는 데 사용할 수 있습니다 하 고 팁 성장 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

그림 1에서 볼 수 있듯이 팁 성장 하는 식물 세포에서 발생 하는 일련의 그들의 성장 경로 비보따라 물리적 장벽. 미세 체 외에서 세포 문화 플랫폼이이 연구에 사용 검사는 성장 하는 팁의 세 가지 유형의 1 µ m 인공 격차 (그림 3를 통해 식물 세포 (꽃가루 관, 루트 머리, 및 모스 protonemata)에서 프로세스 그림 4, 그림 5). 꽃가루 관 연구에 대 한 라이브 셀 이미징 꽃가루 관 뿐만 아니라 식물 핵의 꼭대기 지역에 형태학 상 변화 및 발생 (보충 영화 1, 2)는 매우 작은 공간에 대 한 응답에서 정자 세포 모니터링 하 사용 되었다.
microgaps의 대부분은 성공적으로 여기에서 설명한 메서드를 사용 하 여 조작, 비록 우리를 발견 하는 그들 중 몇 가지 완전히 폐쇄 (그림 6). 실리콘 몰드에 만든 1 µ m 넓은 채널 깨지기 때문에, 곰이 팡이의 반복된 사용 간격, PDMS 레이어에 차단 간격에 지도 손상 수 있습니다. 따라서, 실험을 수행 하기 전에 그것은 PDMS microgaps 그대로 유지 되는지 확인 하는 것이 중요입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57262/57262fig1.jpg"> 그림 1: 성장 하는 팁의 침투 물리적으로 제한 된 공간으로 셀 공장. (A)는 난에가 길에 여러 물리적 장벽을 통해 꽃가루 관 elongating. 장벽 주변에 micropyle integuments와 스타일으로 조직 전송 포함 됩니다. (B) 루트 머리카락 조밀한 토양을 통해 침투. (A) 와 (B) 인세트 박스형 영역의 확대 표시. <a href="/files/ftp_upload/57262/57262fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57262/57262fig2.jpg"> 그림 2: T. fournieri 꽃가루 관, A. thaliana 루트 머리, 및 피. patens protonemata 공부 하는 데 사용 하는 렌의 특성. Microchannels의 회로도 도면에서 샘플 별표 표시 (*)로 표시 된 위치에 배치 됩니다. 아닌 디자인, 사진 각 장치, 채널 구조 및 경작 기간 셀의 요약 된다. 이 수치는 야나기사와 외허가 수정 되었습니다. 201719. 눈금 막대, 20 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57262/57262fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57262/57262fig3.jpg"> 그림 3: 1 µ m의 차이 통해 T. fournieri 꽃가루 관 신장. (A) 꽃가루 관 1 µ m 폭 및 4 µ m 높은 차이 통해 전달. 시간 경과 밝은 필드 이미지 회전 디스크 confocal 시스템는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 점령 했다. 눈금 막대, 20 µ m. (B) 시간 경과의 이미지 붙일 레이블된 식물 핵 RPS5Ap::H2B tdTomato 의 꽃가루 관에서 정자 세포는 microgap를 건너 라인. 스케일 바, 20 µ m. 그림 (A) 와 (B) 야나기사와 외허가 수정 되었습니다. 201719. <a href="/files/ftp_upload/57262/57262fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57262/57262fig4.jpg"> 그림 4입니다. 1 µ m 간격을 통해 A. thaliana 루트 머리 신장. microdevice에서 (A) 루트 및 루트 머리 성장. Microgaps (폭에서 1 µ m)와 4 µ m 높이에 루트 성장 채널의 왼쪽에 있습니다. 오른쪽에 microchannels microgaps를 포함 하지 않는 고 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 눈금 막대, 100 µ m. (B) 밝은 분야, (C) 형광, 및 (D)는 microgaps를 통과 하는 루트 머리의 이미지를 병합. 루트 머리카락에 핵 붙일 UBQ10pro::H2B mClover 줄에 표시 됩니다. 각 루트 머리의 끝 화살표에 의해 표시 됩니다. 스케일 바, 30 µ m입니다. 이러한 수치는 야나기사와 외허가 수정 되었습니다. 201719. <a href="/files/ftp_upload/57262/57262fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57262/57262fig5.jpg"> 그림 5입니다. 1 µ m 간격을 통해 피. patens protonemata 신장. Protonemata 셀 turgor 압력은 protonemata의 확대는 1 µ m 간격 (높이 4 µ m)를 통해 건너 이끼 스케일 바, 20 µ m입니다. 야나기사와 외허가 그림 수정 되었습니다. 201719. <a href="/files/ftp_upload/57262/57262fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57262/57262fig6.jpg"> 그림 6입니다. 닫힌 microgaps. 1 µ m 간격의 SEM 이미지입니다. 오른쪽에 microgap 완전히 닫힙니다. <a href="/files/ftp_upload/57262/57262fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 1입니다. 통해 꽃가루 관 성장 1 µ m 간격. 시간 경과 밝은 필드 이미지 캡처된 모든 10 회전 디스크 confocal 현미경 장비는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 s. 눈금 막대, 20 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57262/movie1.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 2입니다. 식물 핵 및 통해 정자 세포의 침투 1 µ m 간격. 시간 경과 밝은 분야 및 형광 이미지 캡처된 모든 20를 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여 s. 눈금 막대, 20 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57262/movie2_3fps.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

팁 성장 하는 식물 세포, 꽃가루 관, 루트 머리, 등의 기능을 조사 하 고 미세 장치에서 protonemata, 매우 좁은 간격 (~ 1 μ m)을 통해 길게 하기 이끼 하는 방법을 설명 합니다.

매우 작은 공간에 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능 연구를 미세 장치 개발

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

development-microfluidic-devices-to-study-elongation-capability-tip

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K 조회수.  Nagoya University. 팁 성장 하는 식물 세포, 꽃가루 관, 루트 머리, 등의 기능을 조사 하 고 미세 장치에서 protonemata, 매우 좁은 간격 (~ 1 μ m)을 통해 길게 하기 이끼 하는 방법을 설명 합니다.

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Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting and counting cells. However, manipulating the cell within the fluidic domain remains a challenge and requires complicated fabrication protocols for forming valves and electrodes, or demands specialty equipment like optical tweezers. Here, we demonstrate that conventional printed circuit boards (PCB) can be used for the non-contact manipulation of cells by employing dielectrophoresis (DEP) for bead and cell manipulation in laminar flow fields for bioactuation, and for cell and bead separation in multichannel microfluidic devices. First, we present the protocol for assembling the DEP electrodes and microfluidic devices, and preparing the cells for DEP. Then, we characterize the DEP operation with polystyrene beads. Lastly, we show representative results of bead and cell separation in a multichannel microfluidic device. In summary, DEP is an effective method for manipulating particles (beads or cells) within microfluidic devices.

Dielectrophoresis (DEP) is an effective method to manipulate cells. Printed circuit boards (PCB) can provide inexpensive, reusable and effective electrodes for contact-free cell manipulation within microfluidic devices. By combining PDMS-based microfluidic channels with coverslips on PCBs, we demonstrate bead and cell manipulation and separation within multichannel microfluidic devices.

멀티 채널 Microfluidic 장치에서 분리 비즈와 세포 Dielectrophoresis와 층류를 사용하여

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

연구

생체공학

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Layer-by-layer Collagen Deposition in Microfluidic Devices for Microtissue Stabilization

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

Microtissue 안정화를위한 미세 유체 장치에서 레이어별로 층 콜라겐 증착

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues. 
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRP&#945; and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.

This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.

정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

3D 종이 미세 유체 장치를 구축하기 위해 접착제 패터닝을 사용하여

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.
We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment. 
In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

The Arteriovenous AV Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

We describe a microsurgical approach for the generation of an arteriovenous (AV) loop as a model for analyzing vascularization in vivo in an isolated and well-characterized environment. This model is not only useful for the investigation of angiogenesis, but is also optimally suited for engineering axially vascularized and transplantable tissues.

소형 동물 모델에서의 동정맥 (AV) 루프는 혈관 신생과 혈관을 조성한 조직 공학을 공부하기

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

모듈형 DNA 장치 조립 로봇 액체 처리 자동화

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

판막 다층 미세 유체 장치에 대한 여러 단계의 변수 높이 포토 리소그래피

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

면역 측정법에 대한 3 차원 종이 기반 미세 유체 장치의 제작

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...