우리 감사 헤 쓰쓰이 D. 구리 유전자 변형 식물, 포함 T. fournieriRPS5Ap::H2B tdTomato 선, A. thaliana UBQ10pro::H2B mClover 선 각각 제공. 이 작품에 의해 연구소의 Transformative 바이오-의 분자 나고야 대학과 일본 고급 식물 과학 네트워크를 지원 했다. 이 작품에 대 한 재정 지원 일본 과학과 기술 기관에서 교부 금에 의해 제공 되었다 (ERATO 프로젝트 부여 없음. 남에 대 한 JPMJER1004), 선진적인 과학 연구에 대 한 혁신적인 지역 (번호. JP16H06465 고 남에 대 한 JP16H06464), 그리고 도전적인 탐구 연구 (no. 26600061에 대 한 부여 뉴욕 및 그랜트 no. 25650075와 15 K 14542와이 스에 대 한)에 대 한 과학 진흥 (JSP) 연구비를 위한 일본 사회.

1. PDMS Microdevice 꽃가루 관 성장 검사의 제작 및 Protonemata 이끼
참고: 우리는 실리콘 웨이퍼에 PDMS 몰드를 준비 하 maskless 사진 평판 장비를 사용. 시스템의 운영에 관한 세부 사항은이 원고에서 생략 됩니다. 표준 사진 평판 기술은9 는 포토 마스크를 사용 하 여이 원고에 설명 된 PDMS 몰드를 만드는 데 사용할 수 있습니다.
<ol><li>11g 사전 폴리머 PDMS 혼합물을 부 어 (탄성 기본: 10: 1의 비율로 경화제) 각 4 인치 형으로.</li>
	<li>형 단계 1.1 진공 챔버에 20 분에 드</li>
	<li>비 대류 오븐에서 90 분 65 ° C에서 경화 후, 금형에서 PDMS 레이어를 껍질 하 고 생 검 펀치를 사용 하 여 유체 채널에 액세스 구멍을 펀치. 참고: 꽃가루 관 장치에 대 한 구멍의 크기는 암 술의 직경을 반영 하기 위해 조정 될 해야 합니다. 이 값이 따라서 종에 의해 달라질 수 있습니다. 이 실험에서 우리는 암 술만 위한 1 m m 구멍 및 액체 중간 저수지에 대 한 1.5 m m 구멍 찍 었다고. 모스 protonemata 장치는 4mm 구멍 샘플 저수지에 대 한 사용 되었습니다.</li>
	<li>PDMS 층 및 유리 하단 접시 (지름에서 3.5-5 c m) 50 플라즈마 공기 노출 s.</li>
	<li>미세 네트워크를 완전히 봉쇄 비 대류 오븐에서 30 분 동안 유리 바닥 접시와 65 ° C에서 열 PDMS 레이어를 누릅니다.</li>
</ol>2. 루트 머리카락에 대 한 PDMS Microdevice의 제조
<ol><li>1.1-1.3 루트 및 루트 머리 렌에 대 한 두 개의 PDMS 레이어를 준비 하는 금형을 사용 하 여 단계를 반복 합니다. 참고: 루트 microdevice에서 액체 중간 저수지에 2mm 구멍을 사용.</li>
	<li>노출 50 플라즈마 공기 PDMS 레이어 모두 s.</li>
	<li>맞춤 바탕 화면 동기 기를 사용 하 여 stereomicroscope에서 2 개의 PDMS 층을 조립. 참고: 이러한 PDMS 레이어에 microchannels 서로 직면해 야 합니다. 조립, 전에 두 레이어에 정렬 마크 일치 하는지 확인 하십시오.</li>
	<li>미세 네트워크를 완전히 봉쇄 비 대류 오븐에서 30 분 65 ° C에서 열.</li>
	<li>생성 된 microdevice에서 커버 슬립을 제거 하 고 장치는 직경 5 cm 유리 하단 접시에 놓습니다.</li>
</ol>3. 준비 체 외에서 세포 배양 매체의 꽃가루 관 (Torenia fournieri)에 대 한
<ol><li>20 분에 대 한 수정된 니 매체 앞에서 설명한15 및 고압 121 ° C에서 매체를 준비 합니다. 참고: 수정 니 매체의 조성은 NH43 (80 mg/L), 알 것3 (125 mg/L), Ca (3)2‧4H2O (500 mg/L), MgSO4‧7H2O (125 mg/L), KH2포4 (125 mg/L ), MnSO4‧4H2O (3 mg/L), ZnSO4‧7H2O (0.5 mg/L), H3보3 (10 mg/L), CuSO4‧5H2O (0.025 mg/L), 총2MoO4‧2H2O (0.025 mg/L), 자당 (50000 mg/L), 그리고 카 세 인 (500 mg/L). 준비 된 매체 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 4 개월 동안 적어도.</li>
	<li>26% (w/v) 폴 리 에틸렌 글리콜 압력가 이온된 수를 사용 하 여 준비 하 고 0.3 µ m 기 공 필터 솔루션을 필터링. 참고: 준비 중간 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 1 개월.</li>
	<li>3.1 및 3.2 1:1 (v/v) 비율에 단계에서 준비 하는 시 약을 혼합. 참고:이 매체 준비 되어야 한다 신선한 각 사용에 대 한.</li>
</ol>4. 준비 체 외에서 세포 배양 매체의 루트 머리카락 (애기 thaliana)에 대 한
<ol><li>0.215% (w/v) 村 重 & Skoog 매체, 0.05% (w/v) MES, 1% (w/v) 자당과 이온된 수 한 천 1% (w/v)의 솔루션을 준비 합니다. 압력솥 20 분 동안 121 ° C에서 솔루션.</li>
</ol>5. 준비 체 외에서 세포 배양 매체의 모스 Protonemata (Physcomitrella patens)에 대 한
<ol><li>전 모스 protonemata BCDAT 중간16 페 트리 접시에 품 어. 참고: BCDAT 매체의 조성은 1mm MgSO4, 10 m m 알 것3, 45 µ M FeSO4, 1.8 m m KH2포4 (pH 6.5 코와 조정), 추적 요소 솔루션 (0.22 μ M CuSO4, 0.19 µ M ZnSO4, 10 µ M H3보 3, 0.1 µ M 총2MoO4, 2 µ M MnCl2, 0.23 µ M CoCl2및 0.17 µ M 기), 1 m m CaCl2및 5 밀리미터 diammonium (+)-주석산.</li>
	<li>문화는 microdevice에서 BCDATG 매체에 이끼. 참고: BCDATG 매체는 0.5% (w/v) 포도와 BCDAT 매체. 준비 된 매체는 1 개월 4 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 생체 외에서 Culturing T. fournieri 는 Microdevice에서 꽃가루 관의
<ol><li>진공 챔버에 꽃가루 관 microdevice을 놓고 20 분 드.</li>
	<li>진공 약 실에서 있는 microdevice를 제거 하 고 아주 좋은 팁는 micropipette를 사용 하 여 암 술 입구에 성장 매체를 소개. 같은 매체에 그들의 정상에 남아 있는 우물 채우십시오. 내부는 microchannels 만든 진공에 의해 매체와 모든 microchannels 가득 때까지 몇 분 동안 기다립니다.</li>
	<li>접시에 습도 유지 하기 위해 유리 하단 접시에 몇 가지 젖은 종이 타월을 놓습니다.</li>
	<li>야생-타입에서 꽃가루 곡물을 전송 해 부 바늘을 사용 하 여 그것의 오명에 T. fournieri '파란색과 흰색' 꽃. 참고: 또한 유전자 변형 T. fournieri 와 함께이 실험 실시 '바이올렛 왕관' 꽃 ( RPS5Ap::H2B-tdTomato 17선), 붙일 레이블된 정자 세포와 식물 핵을 포함 하는 꽃가루 관.</li>
	<li>잘라 좋게 스타일 (1 ㎝ 길이)는 블레이드를 사용합니다.</li>
	<li>그림 2와 같이 장치에 컷된 스타일을 삽입 합니다.</li>
	<li>접시에는 뚜껑을 넣고 테이프로 봉인.</li>
	<li>어둠 속에서 5-6 h 28 ° C에 인큐베이터에 장치를 넣습니다.</li>
</ol>7. A. thaliana 루트 머리는 Microdevice에서의 생체 외에서 Culturing
참고: 단계 7.1 7.9 (제외 7.3 및 7.5) 층 류 후드에서 수행 되어야 한다.
<ol><li>A. thaliana 컬럼비아 (열-0)에서 종자 소독와 유전자 변형 라인 UBQ10pro::H2B mClover (형광 핵 마커 포함) 5 분에 대 한 살 균 액체 (5% (v/v) 가구 표 백제와 0.02% (v/v) 트라이 톤 X-100)에서 그들을 몸을 담글 하 여.</li>
	<li>철저 하 게 린스 압력가 마로 소독 물 살 균된 씨.</li>
	<li>어둠 속에서 4 ° C에서 2 일 동안 물에 씻어 서 씨앗 저장 합니다.</li>
	<li>밤새 UV 빛에서 microdevice를 소독.</li>
	<li>진공 챔버에는 microdevice을 놓고 20 분 드.</li>
	<li>장치는 micropipette 사용 하 우물에 성장 매체를 소개 합니다. 진공에서 매체와 모든 microchannels 채웁니다 때까지 몇 분 정도 기다립니다.</li>
	<li>접시에 습도 유지 하기 위해 유리 하단 접시에 압력가 젖은 종이 타월을 놓습니다.</li>
	<li>장치의 입구에 소독된 씨앗을 전송 합니다.</li>
	<li>접시에는 뚜껑을 넣고 테이프로 봉인.</li>
	<li>연속 하얀 빛 아래에서 22 ° C에서 인큐베이터에 수직으로 장치를 놓습니다.</li>
	<li>외피의 4-10 일 후 루트 머리 성장 확인. 밝은 분야와는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 형광 이미지를 얻을.</li>
</ol>8. 피. patens (이끼) 미세 장치에서 Protonemata의 생체 외에서 Culturing
참고: 단계 8.2 8.6 (8.3)을 제외 하 고 층 류 후드에서 수행 되어야 한다.
<ol><li>25 ° c.에 연속 하얀 빛 아래에서 1 주일 동안 배양 접시에 셀로판으로 덮여 BCDAT 매체에 P. patens 스트레인 Gransden 200418 preculture</li>
	<li>UV 광원을 층 류 두건에서 하룻밤 microdevice 소독.</li>
	<li>진공 챔버에는 microdevice을 놓고 20 분 드.</li>
	<li>성장 매체는 micropipette 사용 하 우물에 소개. 진공에서 매체와 모든 microchannels 채웁니다 때까지 몇 분 정도 기다립니다.</li>
	<li>접시는 접시에 습도 유지 하기 위해 microdevice를 주변에 압력가 물을 추가 합니다.</li>
	<li>microdevice의 입구에 모스 protonemata 조직의 작은 조각을 전송 하 고 연속 하얀 빛 아래에서 25 ° C에서 인큐베이터에서 조직 문화.</li>
	<li>외피의 2-3 주 후 모스 protonemata 성장 확인. 현미경을 사용 하 여 밝은 필드 이미지를 얻을.</li>
</ol>9. T. fournieri 꽃가루 관 성장 시간 경과 영상
<ol><li>이미지 수집 하드웨어를 갖춘 거꾸로 형광 현미경에는 microdevice를 배치 (예., CCD 카메라) 및 소프트웨어. Microgap 위치를 찾아. 참고: 이미지 수집 소프트웨어 사용 했습니다 상용 제품 (자료 테이블). µManager와 같은 오픈 소스 현미경 소프트웨어 사용할 수 온라인 (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager) 이기도합니다. 더 높은 해상도 이미지를 현미경에 현미경 콘덴서를 설치 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>모든 10 필드 밝은 이미지를 캡처 현미경 이미지 수집 소프트웨어를 사용 하 여 s.</li>
	<li>관찰 하기 위해 붙일 레이블된 정자 세포와 RPS5Ap::H2B tdTomato 라인의 꽃가루 관 식물 핵, 561 nm 레이저는 견본을 비추는 및 대역 통과 광 필터를 사용 하 여 (578/105 nm). 참고: 꽃가루 관 성장의 시간 경과 이미지는 자주 체포 되었다, 비록 이미징 성장에 영향을 미치는 듯 하지 않았다. 그러나, 그것은 항상 레이저 강도, 노출 시간, phototoxicity 및 photobleaching는 fluorophore의 최소화 하기 위해 시간 간격을 최소화 하 고 좋습니다.</li>
	<li>이미지의 명암과 밝기를 조정 하 고 ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/)를 사용 하 여 비디오 파일을 준비.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Higashiyama, T., Takeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanism+and+Key+Molecules+Involved+in+Pollen+Tube+Guidance.">The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance.</a> Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).</li><li>Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U., Obermeyer, G., Feij&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cytomechanical+forces+on+growing+pollen+tubes.">Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes.</a> Pollen Tip Growth. , 65-85 (2017).</li><li>Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+modified+carbon+allocation+on+turgor,+osmolality,+sugar+and+potassium+content+and+membrane+potential+in+the+epidermis+of+transgenic+potato+(Solanum+tuberosum+L.)+plants.">Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants.</a> J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).</li><li>Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+turgor+pressure+of+growing+lily+pollen+tubes.">The turgor pressure of growing lily pollen tubes.</a> Protoplasma. 198, 1-8 (1997).</li><li>Vogler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pollen+tube:+a+soft+shell+with+a+hard+core.">The pollen tube: a soft shell with a hard core.</a> Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).</li><li>Shamsudhin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallelized+pollen+tube+guidance+and+mechanical+measurements+on+a+Lab-on-a-Chip+platform.">Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform.</a> PloS one. 11 (12), e0168138 (2016).</li><li>Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feij&#243;, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pollen+tube+journey+in+the+pistil+and+imaging+the+in+vivo+process+by+two-photon+microscopy.">The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy.</a> J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).</li><li>Metzner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparison+of+MRI+and+X-ray+CT+technologies+for+3D+imaging+of+root+systems+in+soil:+Potential+and+challenges+for+root+trait+quantification.">Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification.</a> Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).</li><li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup.">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li><li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Fluorescence+Imaging+of+Arabidopsis+Root+Growth+with+Rapid+Manipulation+of+The+Root+Environment+Using+the+RootChip.">Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression.">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).</li><li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-in-chip:+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis.">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703 (2011).</li><li>Bascom, C. S., Wu, S. -. Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Growth+of+Moss.">Long-Term Growth of Moss.</a> in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).</li><li>Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+in+vitro+of+the+pollen+tube+to+the+naked+embryo+sac+of+Torenia+fournieri.">Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri.</a> Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).</li><li>Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tagged+mutagenesis+and+gene-trap+in+the+moss,+Physcomitrella+patens+by+shuttle+mutagenesis.">Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis.</a> DNA Res. 7, 9-17 (2000).</li><li>Maruyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Control+by+Each+Female+Gamete+Prevents+the+Attraction+of+Multiple+Pollen+Tubes.">Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes.</a> Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).</li><li>Rensing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Physcomitrella+genome+reveals+evolutionary+insights+into+the+conquest+of+land+by+plants.">The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants.</a> Science. 319, 64-69 (2008).</li><li>Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capability+of+tip-growing+plant+cells+to+penetrate+into+extremely+narrow+gaps.">Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps.</a> Sci. Rep. 7 (1), 1403 (2017).</li><li>Dolan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+relationships+and+cell+patterning+in+the+root+epidermis+of+Arabidopsis.">Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis.</a> Development. 120, 2465-2474 (1994).</li><li>Denais, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+envelope+rupture+and+repair+during+cancer+cell+migration.">Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration.</a> Science. 352 (6283), 353-358 (2016).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

프로토콜에 몇 가지 중요 한 단계 위의 결과 얻기 위해 정확 하 게 지켜질 필요가 있다. 첫째, PDMS 층 및 유리 하단 접시 표면 둘 다 대우 되어야 한다 플라즈마로 충분 한 양의 결합 하기 전에 시간에 대 한. 그렇지 않으면, 팁 성장 세포는 microgaps를 건너는 동안 PDMS 층 유리 표면에서 분리 로컬 수 있습니다. 루트 머리와 모스 protonemata 프로토콜에서 다른 중요 한 단계는 microdevice의 살 균입니다. 일반적으로, 루트 머리카락과 모스 protonemata 세포는 몇 주에 대 한 교양은 microdevice에 있이 필요가 있다. 없이 장치를 살 균, 미생물은 이러한 팁 성장 세포의 성장에 영향을 미칠 수 번성 수 있습니다. 실험 반나절 내 결론은 꽃가루 관 장치의 살 균, 중요 하지 않습니다. 우리는 정기적으로 살 균 없이 꽃가루 관 장치를 사용 하 고 실험 하는 동안 어떤 바람직하지 않은 효과 관찰 하지 않았다.
아닌 디자인 관심사의 세포에 따라 수정 해야 합니다. 우리의 작품에서는, A. thaliana 루트 머리 실험에 사용 된 채널 디자인 T. fournieri 꽃가루 관 및 P. patens protonemata 실험 사용에서 달랐다. 다른 장치는 필요한 샘플 있기 때문에 다른 치수; 예를 들어, 루트 머리는 꽃가루 관 및 모스 protonemata 보다 훨씬 짧습니다. 따라서, 우리의 루트 머리 장치 microgap 지역 주요 루트 채널에 인접 한 했다 되도록 설계 되었다. 채널 디자인 루트 머리 장치를 준비 하기 위한 절차는 또한 꽃가루 관 또는 모스 protonemata 사용 하는 프로시저에서 다릅니다. 꽃가루 관 및 모스 protonemata 연구 microchannels 유리 하단 접시에 대 한 봉인 된 PDMS 층을 포함 하는 microdevice를 사용 했습니다. 그러나 루트 머리카락을 공부 하는 데 사용 하는 장치 2 개의 PDMS 층을 구성 하는,:는 아닌 함께 상위 레이어 (깊이: 200 µ m) 아래 계층에 대 한 기본 루트는 봉인에 대 한 포함 된 microchannels (깊이: 4 µ m) 루트 머리카락에 대 한. 실리콘 금형을 제작 하기 위해 고용 되었다 표준 사진 평판 기술은 주위 5: 1의 가로 세로비로 제한 됩니다. 따라서, 1 µ m 넓은 간격을 만들려면 채널 높이 약 5 µ m로 제한 될 것입니다. 그것은 또한 기술적으로 정확 하 게 깊은 채널에 맞게 도전 (예., 200 µ m) 실리콘 몰드에 1 µ m 와이드 갭 근처. 따라서, 우리 주요 루트 및 루트 머리카락에 대 한 별도 PDMS 레이어를 준비 하 고 그들을 함께 밀봉 하 여 장치를 건설.
이 프로토콜은 성공적으로 성장 하는 과정 (보충 영화 1, 2)는 microgaps 통해 꽃가루 관의 팁을 시각화 하는 데 사용 됩니다, 하는 동안 시간 경과 루트 머리와 모스 protonemata 신장 microgap 영역에서의 영상 더 있을 것 이라고 도전. A. thaliana 루트 머리카락 경작에 사용 되는 microdevice에는 microgaps 위치 (4 µ m)에 있는 사이드 채널의 높이 이므로 루트 성장 챔버 (200 µ m)의 그것 보다 훨씬 얕은 대부분 루트 머리카락 쪽 채널에 진행 할 수 없습니다. 경우에 루트 머리카락 쪽 채널 입구 발견 때 그들은 그것을 입력 것입니다 예측 하기 어렵다. microgap에서 루트 머리 성장의 시간 경과 이미지 캡처, 이미지 수집을 위한 여러 위치에 위치 하도록 프로그래밍할 수 있는 자동화 된 무대를 갖춘 현미경을 사용 하는 것이 좋습니다. 이러한 기기를 사용할 수 없는 경우 루트 머리카락을 이미 측면 채널 입력 하지만 아직는 microgaps 넘어 하지에 대 한 검색 하는 것이 좋습니다. A. thaliana 루트 머리카락의 성장 속도가 훨씬 느린 이후 (일반적으로 1-2.5 µ m/분20) T. fournieri 꽃가루 관 (일반적으로 22-23 µ m/min19) 보다, 그 루트 머리카락의 시간 경과 이미지를 캡처할 수 있습니다 그는 교차 하는 microgaps에 대해 있습니다. 다른 한편으로, 모스 protonemata 관측 장기간된 관찰 기간 느린 성장 비율 때문에 필요 하기 때문에이 연구를 위해 독점적으로 사용 될 수 있는 시간 경과 시스템이 필요 합니다.
여기에 제시 된 미세 접근 우리가 매우 좁은 공간을 통해 길게 하기 팁 성장 하는 식물 세포의 기능 연구를 첫 번째 방법입니다. 이러한 렌 조사 세포 벽 생 합성 및 성장 하는 팁의 무결성과 관련 된 유전자의 기능 분석 검사에 유용 수 있습니다 그들의 침투 능력을 통해 셀. 또한, Denais 외. 21 최근 핵 파열 시연 및 복구 메커니즘 미세 장치에서 준비 하는 한정 된 공간을 통해 암 세포를 압박 하 여 비슷한 메커니즘을 사용 하 여 꽃가루 관에 존재 하는 여부를 연구 수 있습니다 우리의 장치입니다. 이 새로 개발된 된 실험 플랫폼 조사 개별 셀을 사용할 수 있습니다 물리적으로 제한 된 공간에 대응 하 고 따라서 팁 성장 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 향상 시킬 수 있습니다.

낙인에 꽃가루 곡물 발 아, 후 각 곡물 계란 세포 및 중앙 셀 더블 수정에 대 한 난에 정자 세포를 운반 단일 꽃가루 관을 생성 합니다. 꽃가루 관 스타일을 통해 연장 하 고 결국은 난을 도달 하는 그들의 방법1에 따라 여러 지도 신호를 감지 하 여. 신장, 동안 꽃가루 관 발생 하는 일련의 물리적 장벽; 전송 추적 셀, 채워집니다 그리고 꽃가루 관 그들의 대상 (그림 1A)2도달 하 난의 분 micropylar 개통을 입력 해야 합니다. 따라서, 꽃가루 관은 그들의 주위에서 압축 스트레스를 견 뎌 하는 동안 물리적 장애물을 관통할 수가 있어야 합니다. 루트 머리 포장된 토양 입자 (그림 1B)의 형태로 환경에서 물리적 장애물을 견딜 해야 합니다 팁 성장 하는 식물 세포의 또 다른 유형입니다.
꽃가루 관의 다양 한 기계적 특성 연구, turgor 압력 및 영역의 셀의 꼭대기, 초기 plasmolysis3,방법4 와 셀룰러 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 측정 될 수 있는 강성을 포함 한 (CFM) 5 , 6, 각각. 그러나, 이러한 방법은 혼자 꽃가루 관 성장 경로 따라 물리적 장벽을 통해 elongating 수 인지 공개 하지 않습니다. 모니터링 vivo에서 꽃가루 관 신장 수는 대체 기법 두 광자 현미경7이다. 그러나,이 방법으로, 그것은 개별 꽃가루 관의 형태학 적 변화를 관찰 하기 어려운 난 조직 깊숙한. 또한, 루트 머리 성장 토양에서 수 수 시각 계산 x 선 단층 촬영 (CT) 및 자기 공명 영상 (MRI)8를 사용 하 여 낮은 해상도와. 여기, 우리는 기존의 현미경에는 셀의 변형 과정의 고해상도 이미지를 사용할 수 있는 방법 제시.
여기에 설명 된 방법의 전반적인 목표는 꽃가루 관, 루트 머리를 포함 하 여 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능을 시각화 하 고 protonemata 매우 작은 공간에서 이끼입니다. 폴 리-dimethylsiloxane (PDMS) 렌이이 원고에 광학 투명 하 고 공기 침투성, 우리 수 장치 내부에 살아있는 세포를 문화 고 현미경 아래에서 그들의 성장 행동 관찰. 그것은 또한 마이크로 만들 수 ~ 금형의 사용과 소프트 리소 그래피 기술9 나노미터 스케일 공간. 이러한 기능은 물리적으로 밀폐 된 환경에 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능을 공부 수 있습니다.
이 작품에서는, 우리는 미세 장치에 1 µ m 넓은 간격 (높이 4 µ m)를 건설 하 고 원통형 꽃가루 관 (약 8 µ m)의 직경 보다 훨씬 작은 이러한 인공 장애물을 관통 하는 꽃가루 관의 기능을 검사. 이 실험 플랫폼 microgaps 꽃가루 관의 응답을 시각화 하 고 셀의 변형 과정을 추적 하 고 응답의 시간 경과 이미지를 캡처 수 있습니다. 우리는 또한 렌 루트 머리카락과 모스 protonemata의 침투 능력을 조사 하는 데 사용할 수 있는 개발. 여러 렌 공장 루트10,11,12,13 모스 protonemata14 성장과 높은 해상도에서 시각화를 가능 하 게 날짜에 보고 되었습니다. 우리의 장치에 루트 머리 성장 채널 시리즈 루트 성장 챔버에 수직으로 연결 하 고 개별 루트 머리 (직경에서 약 7 µ m)는 1 µ m 넓은 간격으로 유체 채널 가이드. 우리는 또한 이끼를 경작이 물리적 장벽에 대 한 그들의 응답을 검사 하는 microgaps를 포함 하는 microdevice에서 protonemata (직경에서 약 20 µ m). 제안 된 미세 기반 접근 방식을 다른 현재 사용할 수 있는 방법으로 시험 될 수 있는 매우 작은 공간을 통해 연장 하는 다양 한 팁 성장 하는 식물 세포의 기능을 탐구 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning Co.</td><td>Sylgard184</td><td></td></tr><tr><td>Murashige &amp;amp; Skoog Medium</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>392-00591</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Dojindo</td><td>345-01625</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>50 mm glass-bottom dish</td><td>Matsunami Glass</td><td>D210402</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass-bottom dish</td><td>Iwaki&amp;nbsp;</td><td>3971-035</td><td></td></tr><tr><td>Surgical blade</td><td>Feather</td><td>No.11</td><td></td></tr><tr><td>biopsy punches</td><td>Harris</td><td></td><td>Uni-Core</td></tr><tr><td>Gel loading tips</td><td>Bio-Bik</td><td>124-R-204</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric</td><td></td><td>No Catalog number is avairable for this customized microscope</td></tr><tr><td>MetaMorph imaging software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

development of microfluidic devices to study the elongation capability of tip-growing plant cells in extremely small spaces

Vivo에서, 팁 성장 하는 식물 세포의 물리적 장벽; 시리즈를 극복 하기 위해 필요한 그러나, 연구 방법론 등 제한적인 조건에서 세포 행동을 시각화에 부족 합니다. 이 문제를 해결 하려면 폴 리-dimethylsiloxane (PDMS) 기판에 성장 챔버 팁 성장 식물, 마이크로 조작 좁은 간격 (~ 1 μ m)의 시리즈를 포함 하는 셀에 대 한 개발 했습니다. 이 투명 한 소재를 사용 하면 시간 경과 영상에 의해 microgap 침투 하는 동안 개별 셀에 팁 신장 프로세스를 모니터링할 수 있습니다. 그들은 관통는 microgap 꽃가루 관의 형태학 변화 관찰이 실험 플랫폼을 사용 하 여 합니다. 우리이 과정 붙일 레이블된 식물 핵의 모양에 동적 변화와 꽃가루 관에서 정자 세포를 점령. 또한, 우리 1 µ m 간격 침투 루트 머리카락과 모스 protonemata의 기능을 시연 했다. 이 체 외에 플랫폼은 물리적으로 제한 된 공간에 개별 세포 응답을 공부 하는 데 사용할 수 있습니다 하 고 팁 성장 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

그림 1에서 볼 수 있듯이 팁 성장 하는 식물 세포에서 발생 하는 일련의 그들의 성장 경로 비보따라 물리적 장벽. 미세 체 외에서 세포 문화 플랫폼이이 연구에 사용 검사는 성장 하는 팁의 세 가지 유형의 1 µ m 인공 격차 (그림 3를 통해 식물 세포 (꽃가루 관, 루트 머리, 및 모스 protonemata)에서 프로세스 그림 4, 그림 5). 꽃가루 관 연구에 대 한 라이브 셀 이미징 꽃가루 관 뿐만 아니라 식물 핵의 꼭대기 지역에 형태학 상 변화 및 발생 (보충 영화 1, 2)는 매우 작은 공간에 대 한 응답에서 정자 세포 모니터링 하 사용 되었다.
microgaps의 대부분은 성공적으로 여기에서 설명한 메서드를 사용 하 여 조작, 비록 우리를 발견 하는 그들 중 몇 가지 완전히 폐쇄 (그림 6). 실리콘 몰드에 만든 1 µ m 넓은 채널 깨지기 때문에, 곰이 팡이의 반복된 사용 간격, PDMS 레이어에 차단 간격에 지도 손상 수 있습니다. 따라서, 실험을 수행 하기 전에 그것은 PDMS microgaps 그대로 유지 되는지 확인 하는 것이 중요입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57262/57262fig1.jpg"> 그림 1: 성장 하는 팁의 침투 물리적으로 제한 된 공간으로 셀 공장. (A)는 난에가 길에 여러 물리적 장벽을 통해 꽃가루 관 elongating. 장벽 주변에 micropyle integuments와 스타일으로 조직 전송 포함 됩니다. (B) 루트 머리카락 조밀한 토양을 통해 침투. (A) 와 (B) 인세트 박스형 영역의 확대 표시. <a href="/files/ftp_upload/57262/57262fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57262/57262fig2.jpg"> 그림 2: T. fournieri 꽃가루 관, A. thaliana 루트 머리, 및 피. patens protonemata 공부 하는 데 사용 하는 렌의 특성. Microchannels의 회로도 도면에서 샘플 별표 표시 (*)로 표시 된 위치에 배치 됩니다. 아닌 디자인, 사진 각 장치, 채널 구조 및 경작 기간 셀의 요약 된다. 이 수치는 야나기사와 외허가 수정 되었습니다. 201719. 눈금 막대, 20 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57262/57262fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57262/57262fig3.jpg"> 그림 3: 1 µ m의 차이 통해 T. fournieri 꽃가루 관 신장. (A) 꽃가루 관 1 µ m 폭 및 4 µ m 높은 차이 통해 전달. 시간 경과 밝은 필드 이미지 회전 디스크 confocal 시스템는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 점령 했다. 눈금 막대, 20 µ m. (B) 시간 경과의 이미지 붙일 레이블된 식물 핵 RPS5Ap::H2B tdTomato 의 꽃가루 관에서 정자 세포는 microgap를 건너 라인. 스케일 바, 20 µ m. 그림 (A) 와 (B) 야나기사와 외허가 수정 되었습니다. 201719. <a href="/files/ftp_upload/57262/57262fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57262/57262fig4.jpg"> 그림 4입니다. 1 µ m 간격을 통해 A. thaliana 루트 머리 신장. microdevice에서 (A) 루트 및 루트 머리 성장. Microgaps (폭에서 1 µ m)와 4 µ m 높이에 루트 성장 채널의 왼쪽에 있습니다. 오른쪽에 microchannels microgaps를 포함 하지 않는 고 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 눈금 막대, 100 µ m. (B) 밝은 분야, (C) 형광, 및 (D)는 microgaps를 통과 하는 루트 머리의 이미지를 병합. 루트 머리카락에 핵 붙일 UBQ10pro::H2B mClover 줄에 표시 됩니다. 각 루트 머리의 끝 화살표에 의해 표시 됩니다. 스케일 바, 30 µ m입니다. 이러한 수치는 야나기사와 외허가 수정 되었습니다. 201719. <a href="/files/ftp_upload/57262/57262fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57262/57262fig5.jpg"> 그림 5입니다. 1 µ m 간격을 통해 피. patens protonemata 신장. Protonemata 셀 turgor 압력은 protonemata의 확대는 1 µ m 간격 (높이 4 µ m)를 통해 건너 이끼 스케일 바, 20 µ m입니다. 야나기사와 외허가 그림 수정 되었습니다. 201719. <a href="/files/ftp_upload/57262/57262fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57262/57262fig6.jpg"> 그림 6입니다. 닫힌 microgaps. 1 µ m 간격의 SEM 이미지입니다. 오른쪽에 microgap 완전히 닫힙니다. <a href="/files/ftp_upload/57262/57262fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 1입니다. 통해 꽃가루 관 성장 1 µ m 간격. 시간 경과 밝은 필드 이미지 캡처된 모든 10 회전 디스크 confocal 현미경 장비는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 s. 눈금 막대, 20 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57262/movie1.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 2입니다. 식물 핵 및 통해 정자 세포의 침투 1 µ m 간격. 시간 경과 밝은 분야 및 형광 이미지 캡처된 모든 20를 거꾸로 형광 현미경을 사용 하 여 s. 눈금 막대, 20 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57262/movie2_3fps.avi">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

팁 성장 하는 식물 세포, 꽃가루 관, 루트 머리, 등의 기능을 조사 하 고 미세 장치에서 protonemata, 매우 좁은 간격 (~ 1 μ m)을 통해 길게 하기 이끼 하는 방법을 설명 합니다.

매우 작은 공간에 팁 성장 하는 식물 세포의 신장 기능 연구를 미세 장치 개발

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

development-microfluidic-devices-to-study-elongation-capability-tip

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K 조회수.  Nagoya University. 팁 성장 하는 식물 세포, 꽃가루 관, 루트 머리, 등의 기능을 조사 하 고 미세 장치에서 protonemata, 매우 좁은 간격 (~ 1 μ m)을 통해 길게 하기 이끼 하는 방법을 설명 합니다.

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A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

세포 행동 유학을위한 그루브 패턴 Microfluidic 장치

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

연구

생물학

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

여러 고유 긴장 유학을위한 마이크로 유체 장치

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

생체공학

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

RootChip를 사용하여 루트 환경의 신속한 조작과 Arabidopsis 루트 성장의 시간 저속 형광 이미징

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

뿌리와 배설물 개발의 장기 공 촛점 이미징을위한 단순한 챔버

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

발생학

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

미세 유체 기술은 셀 변형능을 검사 할

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other physical or chemical stimuli. They have been commonly used for in vitro cell studies by providing in vivo like surroundings. Especially, how cells response to chemical gradients, electrical fields, and shear stresses has drawn many interests since these phenomena are important in understanding cellular properties and functions. These microfluidic chips can be made of glass substrates, silicon wafers, polydimethylsiloxane (PDMS) polymers, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, or polyethyleneterephthalate (PET) substrates. Out of these materials, PMMA substrates are cheap and can be easily processed using laser ablation and writing. Although a few microfluidic devices have been designed and fabricated for generating multiple, coexisting chemical and electrical stimuli, none of them was considered efficient enough in reducing experimental repeats, particular for screening purposes. In this report, we describe our design and fabrication of two PMMA-based microfluidic chips for investigating cellular responses, in the production of reactive oxygen species and the migration, under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli. The first chip generates five relative concentrations of 0, 1/8, 1/2, 7/8, and 1 in the culture regions, together with a shear stress gradient produced inside each of these areas. The second chip generates the same relative concentrations, but with five different electric field strengths created within each culture area. These devices not only provide cells with a precise, controllable micro-environment but also greatly increase the experimental throughput.

Micro-fabricated devices integrated with fluidic components provide an in vitro platform for cell studies mimicking the in vivo micro-environment. We developed polymethylmethacrylate-based microfluidic chips for studying cellular responses under single or coexisting chemical/electrical/shear stress stimuli.

단일 또는 공존 화학 / 전기 / 전단 응력 자극에서 세포 응답 유학을위한 미세 유체 장치 설계

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

2 층 미세 플랫폼에서 애기 모종의 루트 머리 형태를 이미징

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the initial stage varies dramatically from the following process of neovascularization. Although there are plenty of models to simulate different stages of neovascularization, an in vitro 3D model that capitulates the initial process of neovascularization under the corresponding stimulations of normal vasculature microenvironments is still lacking. Here, we reconstructed an in vitro 3D model that mimics the initial event of neovascularization (MIEN). The MIEN model contains a microfluidic sprouting chip and an automatic control, highly efficient circulation system. A functional, perfusable microchannel coated with endothelium was formed and the process of sprouting was simulated in the microfluidic sprouting chip. The initially physiological microenvironment of neovascularization was recapitulated with the microfluidic control system, by which ECs would be exposed to high luminal shear stress, physiological transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distributions simultaneously. The MIEN model can be readily applied to the study of neovascularization mechanism and holds a potential promise as a low-cost platform for drug screening and toxicology applications.

Here, we provide a microfluidic chip and an automatically controlled, highly efficient circulation microfluidic system that recapitulates the initial microenvironment of neovascularization, allowing endothelial cells (ECs) to be stimulated by high luminal shear stress, physiological level of transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distribution simultaneously.

뇌혈관화의 초기 이벤트를 모방하는 미세 유체 모델

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...