저자 돛대 세포 준비와 재배 기술 지원에 대 한 줄리아 Geminn를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품은 Transregional 공동 연구 센터 (TR-SFB) 152에 의해 지원 되었다.

모든 동물 절차 관리 및 실험실 동물 (카를스루에 지역 위원회에 의해 승인)의 사용에 대 한 독일 입법 지침에 따라 수행 했다.
1. PMC 고립과 재배 복 게에 의해
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1</td>
			<td>얼음</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>10 mL 주사기</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>27 G 바늘</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>20 G 바늘</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>스티로폼 블록 및 핀</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>컬렉션 튜브 (50ml 플라스틱 원심 관)</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>70% 에탄올</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>RPMI 매체 (냉장 하 고 얼음에 보관 중)</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>PMC 매체: RPMI 매체 + 20 %FCS (송아지 태아 혈 청) + 1% 페니실린 스 솔루션 (펜-연쇄 상)</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>Dulbecco의 인산 염-(캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +) 없이 DPBS 버퍼링</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>문화 플라스 크 (25 cm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>성장 인자 재고 솔루션 (IL-3: 1 μ g/μ; SCF: 2.5 μ g/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>혈 청 학적인 펫 (10 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>펫 팁 불 임 (20-200 µ L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>15</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
<tr>
<td>16</td>
			<td>벤치 원심 분리기</td>
		</tr>
<tr>
<td>17</td>
			<td>가 위와 집게</td>
		</tr>
<tr>
<td>18</td>
			<td>마우스에 대 한 CO2 챔버</td>
		</tr>
<tr>
<td>19</td>
			<td>살 균 오픈 후드</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>닫힌된 살 균 후드</td>
		</tr>
<tr>
<td>21</td>
			<td>셀 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>22</td>
			<td>펫 (20-200 µ L) 전송</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 1 단계에 대 한 자료입니다.
<ol><li>
PMC 격리 복 게
	<ol>
<li>셀 격리 전에 표 1에 나열 된 재료를 준비 합니다.</li>
		<li>8 14 주 된 남성 마우스를 사용 하 여 PMC 격리에 대 한. CO2 흡입에 의해 마우스를 안락사 고 반사의 손실에 의해 죽음을 확인 합니다. 70% 에탄올으로 마우스를 살포 하 고 핀 (지 느 러 미 쪽 아래)를 사용 하 여 거품 블록에 그것을 해결. 무딘 가장자리가 위를 사용 하 여 마우스의 복 부 피부를 제거 합니다. 복 막 구멍을 손상 하지 마십시오. 참고: 우리가 일반적으로이 프로토콜을 사용 마우스 C57BL/6N 스트레인 유전 배경으로 합니다.</li>
		<li>7 mL 차가운 RPMI 매체의 및 27 G 니 들을 갖춘 10 mL 주사기를 사용 하 여 복 막 구멍에 있는 공기의 5 ml를 주사. 복 막에 신중 하 게 바늘을 밀어 하 고 어떤 장기를 꿰뚫기 하지 마십시오. Epididymal 지방 지역에 자리를 사용 하 여 기관 구멍 뚫 기의 위험을 줄이기 위해.</li>
		<li>주입 후 RPMI 매체에 복 막 세포 분리를 1 분 동안 마우스를 흔들어. 할 동요 마우스 너무 강력 하 게, 내부 장기 손상 및 혈액과 복 막 구멍을 오염 방지 하기 위해.</li>
		<li>새로운 20 G 정 장착 하 여 10 mL 주사기를 다시 사용 합니다. 거품 블록을 기울이기 고 부드럽게 중간 포부를 보다 쉽게 다른 측면에서 벤치에 활용 하 여 1 개의 측에 내부 장기를 이동 합니다. 20 G 바늘을 삽입, 베벨 및 액체는 복 부를 부드럽게 그리고 천천히 발음 (~0.5 mL/s)를 내부 기관에 의해 막힘을 방지. (일반적으로 5-6 mL) 가능한 많은 액체를 수집 합니다.</li>
		<li>주사기에서 바늘을 제거 하 고 얼음에 컬렉션 튜브에 수집 된 세포 현 탁 액을 전송. 보이는 혈액 오염 경우 샘플 튜브를 삭제 합니다.</li>
		<li>5 분 ~ 300 x g 에서 셀 서 스 펜 션 튜브 원심 살 균 후드 아래는 상쾌한 발음. 각 마우스에 대 한 감기 (4-10 ° C)의 4 ml 샘플 펠 릿 결합 PMC 매체와 전송 25 cm2 문화 플라스 크에 세포 현 탁 액. 추가 최종 농도 10 ng/mL에 성장 요인 IL-3 및 SCF 30 ng/mL, 각각. 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 있는 셀을 포함 하는 플라스 크를 배치 하 고 절차까지 ~ 48 h에 대 한 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PMC 문화
	<ol>
<li>주 2 (격리 후 ~ 48 h): 중간 변경<ol>
<li>제거 하려면 표면에 뜨는 및 비 점착 세포 (적혈구 및 죽은 세포), 플라스 크의 가장자리에 파스퇴르 피 펫 팁을 배치 하 고 플라스 크를 거의 수평으로 들고 여 플라스 크에서 매체를 발음. 마우스 당 미리 따뜻하게 PMC 매체의 4 mL를 추가 합니다. 추가 성장 요인 IL-3 (10 ng/mL) 및 SCF (30 ng/mL). 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 있는 셀을 포함 하는 플라스 크를 놓습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>주 9: 셀 분<ol>
<li>50 mL 플라스틱 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액 셀 문화 플라스 크에서 전송. 세 번 10 mL 사전 예 열 (37 ° C) Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (DPBS)와 플라스 크를 씻고, 동일한 50 mL에서 분리 된 세포와 세포 현 탁 액을 수집 플라스틱 원심 관. hemocytometer에 의해 셀 농도 계산 하 고 셀의 총 수를 계산.</li>
			<li>~ 300 x g 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 고는 상쾌한 발음. 셀 농도 1 x 106 셀/mL를 미리 데워 PMC 매체 (37 ° C)에 펠 릿을 복구 합니다. 새로운 25 cm2 문화 플라스 크에 세포 현 탁 액을 전송 합니다. 바닥에 고착 하는 섬유 아 세포와 오래 된 플라스 크를 삭제 합니다.</li>
			<li>추가 성장 요인 IL-3 (10 ng/mL) 및 SCF (30 ng/mL), 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 있는 셀을 포함 하는 플라스 크를 놓습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>12-15 일: 측정 셀<ol>
<li>FcɛRI 수용 체의 자극으로 어떤 실험을 계획 하는 경우 표준 문화 매체에 ige의 안티-DNP의 300 ng/mL와 하룻밤 셀을 pretreat. 2 단계와 3 단계를 진행 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. fluorometric 세포내 무료 칼슘 농도 측정 PMCs에
<ol><li>측정을 하기 전에 표 2에 나열 된 재료를 준비 합니다. 또한,의 구성 하는 이미징 설치 준비: 거꾸로 형광 현미경; 목표: 40 X / 1.3 기름; Fura 2 필터 설정; CCD 카메라; 여기 광원; 영상 수집 프로그램; 중력 공급 솔루션 응용 프로그램 시스템.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1</td>
			<td>PMC (12-15 일) 1 x 106 셀/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Concanavalin A</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Fura-2 오전</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Pluronic F-127 20% 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>커버 슬립 안경 라운드; ø 25 m m; 제 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>DNP HSA (dinitrophenol-인간 혈 청 알 부 민) 재고 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>안티-DNP-항 체 (IgE) 재고 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>플랫 바닥 플레이트 (12 정)</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>복합 48/80 재고 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>잘 이미징 챔버 커버</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>펫 (20-200 µ L) 전송</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 2 단계에 대 한 자료입니다.
<ol start="2"><li>
Fura-2 이미지 준비
	<ol>
<li>세포 수는 hemocytometer를 사용 하 여 수행 하 고 셀 농도 1 x 106 셀/mL를 조정. (3-5 회)는 세포 현 탁 액 1 mL 피 펫 팁을 부드럽게 pipetting으로 PMCs 식민지를 분할.</li>
		<li>준비는 캘리포니아2 +-소금 솔루션 버퍼링 HEPES 포함 (캘리포니아2 +-HBSS) 135 mM NaCl, 6 m m KCl, 2mm CaCl2, 1.2 m m MgCl2, 10 mM HEPES, 및 12 mM 포도 당으로 구성. 3 M NaOH와 7.4에 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>준비 concanavalin A 각 25 m m에 pipetting concanavalin A 솔루션 (0.1 mg/mL에서 H2O) 1 방울에 의해 코팅된 슬라이드 라운드 살 균 후드 커버 유리. 적어도 1 분 동안 커버 슬립에 방울을 두고 그 피 펫 및 하자 커버 미끄러져 건조 45 분 신중 하 게 고무 챔버 이미징에 concanavalin A 처리 커버 전표를 눌러에 대 한 솔루션의 대부분을 제거 ( 재료의 표참조)까지 그들은 현미경 이미징 챔버를 연결 합니다. 참고: 폴 리-L-리 신 코팅 슬라이드 대신 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>형광 Ca2 + 염료 Fura-2 녹 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 오전 (1 mM). 빛에서 보호 하는이 솔루션을 저장 합니다.</li>
		<li>Fura 2 희석 캘리포니아2 +에서 오전 재고 솔루션-HBSS "로딩 버퍼"를 준비 하기 위해 5 µ M의 최종 농도에. DMSO에 20% pluronic F-127의 5 µ L/mL와 함께 보충.</li>
		<li>PMC 세포 현 탁 액의 500 µ L로 "로딩 버퍼" 믹스 500 µ L. 이미징 챔버로 혼합물을 플라스틱 하 고 어둠 속에서 실 온에서 20-30 분에 대 한 셀을 품 어.</li>
		<li>응용 프로그램 시스템 자극 프로토콜에 따라 서로 다른 솔루션을 공급 하는 중력을 설정 합니다. 주사기 1 캘리포니아2 +-HBSS 솔루션의 40 mL와 함께 보충, 2 캘리포니아2 +-HBSS 포함 된 솔루션 100 ng/mL DNP의 40 mL 주사기, 주사기 캘리포니아2 +-HBSS 솔루션에 포함 된 50 µ g/mL 복합 48/80의 40 mL로 3, 4의 40 mL 주사기 명목상 캘리포니아2 +-무료-HBSS 솔루션, 5에 명목상으로 캘리포니아의2 +40 mL 주사기 및-무료-HBSS 솔루션 2 µ M 포함 된 Thapsigargin.</li>
		<li>그것에 침수 기름의 작은 방울을 배치 하 여 40 X 높은 조리개 기름 침수 목표를 준비 합니다.</li>
		<li>거꾸로 한 현미경의 스테이지에서 응용 프로그램 시스템을 탑재 합니다. 응용 프로그램 시스템에 로드 된 세포 이미징 챔버를 넣고 녹음 하는 동안 움직임을 방지 하기 위해 보안. 전송 된 라이트 켜고 셀 초점.</li>
		<li>캘리포니아2 +-HBSS 버퍼 중력 먹인 응용 프로그램 시스템을 사용 하 여 세 번 셀 린스 합니다.</li>
		<li>캘리포니아2 +세포를 품 어-HBSS Fura-2에 대 일 분 대 한 오전 드 에스테 르 화.</li>
		<li>린스는 세포는 이미징 시작 하기 전에 한 번 더, 잠재적으로 제거를 유출 형광 성 염료.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
세포 이미징
	<ol>
<li>생리 적 획득 모드에서 이미지 수집 프로그램을 시작 합니다. 설치 창을 열고 포커스와 최적의 수집 시간 조절 (340와 여기에 대 한 동일 해야하는 nm 및 380 nm 및 일반적으로 50-150 ms 사이의 범위). 참고: Fura-2의 노출을 최소화 모든 빛을 염료의 photobleaching을 피하기 위해 로드 셀.</li>
		<li>참고 그림을 이미지 하 고 관심 (ROI)의 영역으로 셀을 표시 합니다. 셀에 존재 하 고 배경으로 정의 지역에서 마지막 투자 수익을 표시 합니다.</li>
		<li>설치를 완료 하 고 5 s 수집 속도 측정을 시작 합니다. 참고: 셀 것 이다 될 또는 조명 340의 여기 빛 nm 및 380 nm, 그리고 방출된 형광 (> 510 nm) CCD 카메라를 사용 하 여 수집 됩니다. 이미지 비율 (F340 nm/F380 nm) 뿐만 아니라 형광 신호 F340 nm와 F380 nm의 3 개의 창에 표시 됩니다. 개별 ROIs 형광 강도의 시간 과정의 차트 의미 값 또한 지속적으로 표시 됩니다.</li>
		<li>실험의 디자인에 따라 적절 한 주기 수에 솔루션을 추가:<ol>
<li>[캘리포니아2 +]나, 항 원 유도 측정 상승 하려면 그림 2, 2B에서 볼 수 있듯이 20, 주기와 주기 150 후 기록 중지 후 주사기 2 솔루션을 적용 합니다.</li>
			<li>[캘리포니아2 +] 48/80 복합 유도 고도 측정, i,C, 그림 2그림으로 20, 주기와 주기 150 후 기록 중지 후 주사기 3 솔루션을 적용 합니다.</li>
			<li>D 그림 2볼 수 있듯이 [캘리포니아2 +]내가 SOCE에 의해 evoked의 고도 측정, 주기 10 후 주사기 4 솔루션을 적용, 사이클 70 후 주사기 5 솔루션을 적용, 주기 120, 후 주사기 4 솔루션을 적용 사이클 150, 후 주사기 1 솔루션을 적용 하 고 사이클 220 후 녹음을 중지.</li>
		</ol>
</li>
		<li>마친 후 측정, 변환 결과 배경 보정 없이 여기 파장 뿐만 아니라 비율 값와 모든 투자 수익에 대 한 배경 보정 없이 측정된 농도 포함 하는 비율 테이블 그리고 모든 측정 시간 점입니다. 수집 프로그램에서 연속적으로 버튼을 눌러: "시작 커터", "모두 표시", "모든 변환", "생리학 측정", "좋아,"확인". 테이블 및 오프 라인 분석을 위해 이미지 스택 파일을 저장.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 베타-hexosaminidase 릴리스 측정 PMCs에
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1</td>
			<td>PMC (12-15 일) 1 x 106 셀/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>안티-DNP-항 체 (IgE) 재고 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>DNP HSA 재고 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>복합 48/80 재고 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Ionomycin</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>96 잘 접시, v 자형 하단</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>96 잘 접시, 플랫 바닥</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>플라스틱 원심 관 (15 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>혈 청 학적인 펫</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>셀 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>벤치 원심 분리기</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>광학 밀도 측정을 위한 결정 플레이트 리더</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>멀티 채널 피 펫 (20-200 μ)</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 3 단계에 대 한 자료입니다.
<ol><li>측정, 이전 표 3에 나열 된 재료를 준비 합니다. 참고: β-hexosaminidase 그들의 자극 후 MCs에서 출시 된 p-nitrophenol 및 N-아 세 틸-D-글루코사민으로 p-nitrophenyl-아 세 틸-D-글루코사민 (pNAG) hydrolyzes. 샘플에서 β-hexosaminidase 양은 형성 될 것 이다 p-nitrophenol의 크기에 비례 이다. "중지 솔루션"의 높은 pH 환경에서 p-nitrophenol 완전히 deprotonated p-nitrophenolat으로 존재 하 고 405에서의 빛 흡수도 의해 검출 될 수 있다 nm.</li>
	<li>130 mM NaCl, KCl 5mm, 1.4 m m CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5.6 m m 포도 당, 및 BSA 0.1%를 포함 하는 Tyrode의 솔루션을 준비 합니다. 3 M NaOH와 7.4에 pH를 조정 합니다.</li>
	<li>1% 트라이 톤 X-100 양의 Tyrode의 솔루션에 추가 하 여 세포의 용 해 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>200mm 글리신의 구성 중지 솔루션을 준비 하 고 NaOH와 10.7에 pH를 조정.</li>
	<li>4 m m의 최종 농도를 0.4 M 구 연산 산 성 pNAG를 용 해 하 여 pNAG 솔루션 (4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>분석 결과에 필요한 세포의 양을 계산 (중복에서 분석 결과 수행). 잘 당 200000 PMCs를 사용 합니다. 2 웰 스를 사용 하 여 부정적인 컨트롤 (Tyrode의 솔루션 없이 DNP 같은 어떤 secretagogues 또는 복합 48/80)와 긍정적인 컨트롤로 2 우물 (10 µ M와 Tyrode의 솔루션 Ionomycin) 모든 유전자에 대 한.</li>
	<li>15 mL 플라스틱 원심 분리기 튜브에 세포를 전송, Tyrode의 솔루션, 15 mL를 볼륨을 조정 하 고 4 분 파스퇴르 피 펫과 상쾌한을 제거 하 고 resuspend Tyrode의 솔루션 2 x 106 셀에 셀에 대 한 200 x g 에서 원심 /mL입니다.</li>
	<li>96-잘 V-아래 잘 접시에 잘 당 세포 현 탁 액의 100 µ L를 전송. ( 그림 3Apipetting 계획)에 따라 각 잘을 자극 또는 제어 솔루션의 25 µ L를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2시 45 분에 대 한 셀을 품 어.</li>
	<li>5 분 동안 얼음에 96 잘 접시를 두어서 반응을 중지 합니다. 그런 다음 판 120 x g에서 4 분 4 ° C에서 원심. 평면-바닥 96 잘 접시에 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 상쾌한의 120 µ L를 전송 하 고 얼음에 두십시오. 신중 하 게 셀 펠 릿을 만지지 마십시오 하지만 완전히는 상쾌한 발음.</li>
	<li>셀 펠 릿에 세포의 용 해 버퍼의 125 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 5 분 동안 셀 펠 릿을 품 어와 반복 pipetting (약 5 시간)으로 부 화 후 그들을 resuspend.</li>
	<li>새로운 평면 아래 96 잘 접시의 필요한 우물에 pNAG 솔루션 (4mm)의 25 µ L 플라스틱 준비 된 pNAG 솔루션으로 각 세포 lysate의 25 µ L를 각 상쾌한에서 25 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>37 ° c.에서 1 h 반응 일괄 처리 품 어 부 화, 후 각 잘 반응을 중지 중지 솔루션의 150 µ L 플라스틱.</li>
	<li>405에 듀얼-파장 설정을 사용 하 여 microplate 리더와 함께 접시를 분석 자동 배경 빼기에 대 한 참조 630 nm nm. 수집 프로그램에서 똑 딱 상자 "참조" 및 "흡 광도" 프로그램 요소 메뉴에서 선택 "630 nm" 드롭 다운 목록에서. 샘플의 광학 밀도 너무 높은 경우에, 측정 전에 프로브 적절 한 희석을 준비 합니다.</li>
	<li>다음 방정식에 따르면 β-hexosaminidase 방출의 비율을 계산: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57222/57222eq1.jpg"> [상쾌한] 배경 이다 출시 [%]는 특정 베타-hexosaminidase 릴리스의 %, 상쾌한의 흡수를 수정 하 고 [lysate] 배경 수정 해당 세포 lysate의 흡수.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+mast+cells:+negative,+as+well+as+positive,+regulators+of+immunity.">Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity.</a> Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).</li><li>Feyerabend, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+cell+ablation+contests+mast+cell+contribution+in+models+of+antibody-+and+T+cell-mediated+autoimmunity.">Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity.</a> Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).</li><li>Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+a+pure+population+of+mouse+mast+cells+in+vitro+with+conditioned+medium+derived+from+concanavalin+A-stimulated+splenocytes.">Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).</li><li>Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kit+ligand,+stem+cell+factor.">The kit ligand, stem cell factor.</a> Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).</li><li>Galli, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cells+as+"tunable"+effector+and+immunoregulatory+cells:+recent+advances.">Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances.</a> Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).</li><li>Ma, H. T., Beaven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulators+of+Ca(2+)+signaling+in+mast+cells:+Potential+targets+for+treatment+of+mast+cell-related+diseases.">Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases.</a> Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).</li><li>Vig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+mast+cell+effector+functions+in+mice+lacking+the+CRACM1+pore+subunit+of+store-operated+calcium+release-activated+calcium+channels.">Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels.</a> Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).</li><li>Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TRP+proteins+in+mast+cells.">The role of TRP proteins in mast cells.</a> Front Immunol. 3, 150 (2014).</li><li>Scholten, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell-specific+Cre/loxP-mediated+recombination+in+vivo.">Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo.</a> Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).</li><li>Malbec, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+cell-derived+mast+cells:+An+in+vitro+model+of+mature+serosal-type+mouse+mast+cells.">Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells.</a> J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+skin+responses+induced+by+icatibant+injection+are+mast+cell+mediated+and+attenuated+by+H(1)-antihistamines.">Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines.</a> Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).</li><li>McNeil, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mast-cell-specific+receptor+crucial+for+pseudo-allergic+drug+reactions.">Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.</a> Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).</li><li>Gaudenzio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+activation+signals+induce+distinct+mast+cell+degranulation+strategies.">Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies.</a> J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).</li><li>Solis-Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+TRPV+channel+activation+by+stimulation+of+FCepsilonRI+and+MRGPR+receptors+in+mouse+peritoneal+mast+cells.">Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells.</a> PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).</li><li>Enerback, L., Svensson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rat+peritoneal+mast+cells+by+centrifugation+on+density+gradients+of+Percoll.">Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll.</a> J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).</li><li>Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+store-operated+calcium+entry.">Methods for studying store-operated calcium entry.</a> Methods. 46 (3), 204-212 (2008).</li><li>Aronson, N. N., Kuranda, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomal+degradation+of+Asn-linked+glycoproteins.">Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins.</a> FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).</li><li>Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mast+cell+mediators:+their+differential+release+and+the+secretory+pathways+involved.">Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved.</a> Front Immunol. 5, 569 (2014).</li></ol>

저자는 공개 없다.

MC 모델 MC degranulation, chemotaxis, 접착, 또한 세포내 신호 변환 통로 MC 활성화에 명료로 공부를 성공적으로 사용할 수 있습니다. 일부 연구 자들은 불멸 하 게 선 (LAD2 HMC1) 등 인간의 MCs 사용 인간의 MCs 모델, 코드에서 파생 된 조상 세포 (CD133 +)와 주변 혈액 조상 세포 (CD34 +) 혈액. 다른 선호 하는 설치류와 같은 불후의 명작 MC 모델 (쥐 basophilic 백혈병 RBL-2 H 3 MC 선) 또는 기본 교양 (마우스 뼈 골 수 유래...

MCs 타고 난과 획득 면역 반응 동안에 저명한 역할을 한다. 특히, MCs 병원 균, 기생충, 박테리아 등의 살해에 참여 하 고 또한 잠재적으로 유독한 내 인 성 펩 티 드 또는 구성 요소 (검토 Galli 외. 20081참조)에 대 한 venoms의 저하. 타고 난 및 적응형 면역에 MCs의 생리 적 역할 열띤된 논쟁의 주제 이다. 따라서, 다른 MC 불충분 한 마우스 모델을 사용 하 여 수행 하는 연구에서 수많은 데이터 불일치 알레르기2넘어 MCs의 면역 기능의 체계적인 재평가 필요 합니다. 성숙한 MCs 조직 및 피부, 폐, 창 자, 등 장기에 지역화 주로 고 있다 일반적으로 혈액에 작은 숫자에만. MCs MC 창시자, 등 조 혈 선구자에서 파생 하 고 그들의 차별화 및 거의 모든 vascularized 조직1는 microenvironments에서 성숙. 선택적으로 T-세포 파생 요소 인터 루 킨 (IL)-3에 그들의 조 혈 창시자3에서 생존, 확산, 그리고 마우스 MCs의 만능 인구의 승진 시킨다. 줄기 세포 요소 (SCF) 구조 세포 조직에 의해 생산 되 고 MC 개발, 생존, 마이그레이션, 및 기능4에서 중요 한 역할. 개별 MCs의 속성은 그들의 능력을 합성 하 고 다양 한 프로 테아 제 또는 proteoglycans 저장에 따라 달라질 수 있습니다. 마우스에 소위 결합 조직 형 MCs는 그들의 해부학 지역화, 형태학, 헤 파 린 및 프로 테아 제5의 내용에 따라 점 막 MCs에서 구별 된다.
MCs의 증가 무료 cytosolic 캘리포니아2 + ([캘리포니아2 +]난)은 필수 degranulation 및 eicosanoids의 생산을 위한 뿐만 아니라 cytokines의 합성과 항 원에 대 한 응답에서 녹음 방송 요인의 활성화 및 다양 한 secretagogues6. 이러한 자극의 주요 다운스트림 목표 hydrolyzes diacylglycerol (DAG) 및 이노 시 톨 1,4,5-trisphosphate phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate phospholipase C, 이다. DAG는 단백질 키 니 아 제 C를 활성화 하 고 IP3 바인딩과 그물에서 캘리포니아2 + 이온을 출시 하였습니다. 이러한 저장소의 고갈 캘리포니아2 + 원형질 막 캘리포니아2 + 채널, 저장 운영된 칼슘 항목 (SOCE)로 이어지는 통해 유입을 활성화 합니다. 이 과정은 캘리포니아2 +의 상호 작용을 통해 되 살려-센서, stromal 상호 작용 분자-1 (Stim1), Orai17 뿐만 아니라 일시적인 수용 체 잠재력 정식 (TRPC) 채널의 활성화를 통해 떠다니고 그물에 (자세한 리뷰 참조 Freichel 그 외 여러분 단백질 20148) 원형질 막에.
공부 하는 여러 약물이 채널의 생리 적인 역할 (채널 차단제의 응용 프로그램) 또는 유전 접근 일반적으로 사용 됩니다. 후자의 경우, 단백질 발현의 억제 mRNA (최저)를 대상으로 하 여 이루어집니다 또는 genomic DNA 코딩 기 공 채널 (녹아웃)의 소 단위를 형성 하는 exon의 전역 또는 조직 관련9 삭제 편집. 이 채널에 대 한 충분 한 특이성으로 차단기의 가용성은 제한 됩니다. 또한, 최저 접근 필요, 예를 사용 하 여 그 유효성의 주의 제어., 서쪽 오 점 분석, 그리고 많은 경우에 대상된 채널 단백질을 위한 특정 항 체의 불가능에 의해 방해 된다. 따라서, 녹아웃 마우스 모델의 사용은 여전히 이러한 분석에 대 한 황금 표준으로 간주 됩니다. 엠씨 기능 조사에 대 한 선호 체 외에 모델은 격리 된 비보 전 완전히 성숙한 인구로 서 수 있는 PMCs의 재배 (에서 예를 들어 생체 외에서 MCs 차별 반대., 골 수 세포)10 . 골 수 파생 된 MCs (BMMCs), 또한 일반적으로 엠씨 기능에서 생체 외에서FcεRI와 베타-hexosaminidase 자극을 공부 하는 데 사용 되는 비교 릴리스는 8-fold 고 약에 증가 PMCs, 각각. 이 문서에서는, 우리 격리 하는 방법 및 재배 murine PMCs의 2 주 높은 수가 순수 결합 조직 배양의 MCs, 추가 분석에 대 한 충분 한 입력을 얻을 수 있는 설명 합니다.
개발 및 인코딩된 유전자 칼슘 표시기의 응용 프로그램에서 최근 진행에도 불구 하 고 그들의 사용은 여전히 제한 대상 세포에 유전자의 납품에 어려움에 의해 특히, 기본 교양된 MCs 같은 고도로 전문화 된 세포에서. 또한, 형광 지표 측정을 위해 [캘리포니아2 +]나 의이 그룹은 아직 높은 동적 범위와 비율 염료가 없다. 이러한 이유로, 비율 [캘리포니아2 +]나 측정에 대 한 선호 하는 방법 아직도 형광 염료 "Fura-2"11의 사용 이다.
현재, 가장 일반적으로 사용 되는 접근 MC 활성화의 평가 degranulation β-hexosaminidase 활동의 측정 이다. Β-hexosaminidase, 알레르기 중재자, MCs12에서 일정 비율에 히 스타 민을 공동 출시는 MC과 립 구성 요소 중 하나입니다. Β-hexosaminidase 쉽게 그리고 정확 하 게 측정할 수 microplate 색도계 분석 실험에서 쉽게 감지 colorigenic 제품의 측정 수량을 생산 하는 특정 기질과의 반응을 통해. 이 문서에서는, PMCs degranulation 다양 한 자극에 대 한 응답에서의 분석에 대 한이 기술의 응용 프로그램이 보고 됩니다.
높은 선호도 plasmalemmal IgE 수용 체 (FcɛRI)의 집계 MCs에 주변 세포 외 공간에 분 비과 립 콘텐츠 출시로 이어지는 다양 한 세포내 신호 전달 경로 활성화 합니다. 특정 항 원 뿐만 아니라 다른 많은 자극 immunomodulatory 중재자, 보완 anaphylatoxins 등의 다양 한 배열을 풀어 MCs를 활성화할 수 있습니다 (예., C3a와 C5a)13, vasoconstrictor 펩 티 드 endothelin 1 (ET1)14 , 잘 수많은 양이온 물질 및 pseudoallergic 반응을 자극 하는 약물 (예., icatibant) MRGPRX216에 바인딩하여15 . MRGPR 유도 MCs degranulation에 관련 된 세포내 신호 통로 저조한 FcɛRI 중재 세포내 신호; 비교 특징 이러한 경로 단지 수용 체 식별16후17 지난 몇 년 동안 집중적으로 공부를 시작 했다. 크게, 원형질 막 이온 채널 칼슘 항목 뒤에 MRGPRX2 자극에에서 관련 된 이해 남아 있다. 따라서, 현재 문서는 또한 세포내 칼슘 신호에 초점을 맞추고 및 MCs의 degranulation MRGPR 촉진제와 자극.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:943px;" width="943">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">RPMI Medium</td>
			<td style="width:273px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:212px;">21875034</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FCS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R92157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IL-3</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>403-ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SCF</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PMC2115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Concanavalin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fura-2 AM&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>F1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNP-HSA&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Anti-DNP-Antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-8406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penstrep</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Compound 48/80&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:212px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-&#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:212px;">N9376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CoverWell Imaging Chamber</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GBL635051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">96-Well plate, v-shaped bottom&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">96-Well plates, flat bottom</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microtiter plate reader with &#34;i-control&#34; software&#160;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Nano Quant, infinite M200 Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Flat bottom plate&#160;</td>
			<td style="width:273px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:212px;">655180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:291px;">Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:212px;">I9657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">50 mL Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td style="width:212px;">62.547.254&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Culture Flasks (25 cm)</td>
			<td style="width:273px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>69160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Cover slips glasses round; &#248; 25 mm; No. 1</td>
			<td>Menzel</td>
			<td>CB00250RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Hemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Observer Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:212px;">440260-9900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">HC Filter Set Fura 2&#160;</td>
			<td>AHF</td>
			<td style="width:212px;">H76-521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CCD Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioCam MRm&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Monochromatic Light Source</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>Lambda DG-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Imaging Acquisition Program</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioVision 4.8.2&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Gravity fed solution application system</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td>4-channel</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">15 mL Plastic Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:291px;">Bench Centrifuge</td>
			<td style="width:273px;">Heraeus</td>
			<td style="width:212px;">Megafuge 1.0R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of peritoneum-derived mast cells and their functional characterization with ca2+-imaging and degranulation assays

돛대 세포 (MCs), 면역 체계의 일환으로 여러 병원 균에 대 한 호스트를 방어 하 고 알레르기 면역 반응의 개시에 중요 한 역할을 재생 합니다. IgE 바인딩된 높은 선호도 IgE 수용 체 (FcεRI), 뿐만 아니라 다른 여러 가지 수용 체의 자극 표면의 cross-linking를 통해 MCs의 활성화 시작 무료 세포내 캘리포니아2 + 레벨의 상승 ([캘리포니아2 +]난) 그는 염증 및 알레르기 중재자의 출시를 촉진합니다. 분자 성분이 신호 경로에 관련 된 식별은 엠씨 기능의 규칙을 이해 하는 데 중요 합니다. 이 문서에서는, 우리는 murine 결합 조직 유형 복 막 게 하 여 MCs의 고립과 복 MCs (PMCs)의 재배에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법론에 의해 다양 한 녹아웃 마우스 모델에서 MCs의 문화 MC 신호 경로에 관련 된 단백질의 식별에 유용한 접근 방식을 나타냅니다. 또한, 우리 또한 단일 셀 Fura-2는 신뢰할 수 있는 Ca2 + MCs. 형광 기반 모니터링 [캘리포니아2 +]내가 신호의 정량화에 대 한 중요 한 기술으로 이미징에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 일반적으로 사용 하는 접근 캘리포니아2 + 신호 이벤트, MC 활성화에 대 한 최대 중요성 이다 칼슘 저장소 운영 항목을 포함 하 여 공부 합니다. MC degranulation의 분석에 대 한 β-hexosaminidase 자료 분석 결과 설명합니다. 모든 3 개의 다른 분 비 하위 집합에 대해 MCs. β-hexosaminidase에서 설명한 degranulation 마커 colorigenic 기판에와 그것의 반응에 의해 쉽게 정해질 수 β-hexosaminidase 문화 매체에 발표의 양을 간주 됩니다 한 결정 플레이트 색도계 분석 이 높은 재현 기술은 비용 효율적인 고 특수 장비를 요구 한다. 전반적으로, 제공 된 프로토콜 높은 수확량을 보여줍니다 일반적인 MC 표면 마커를 표현 하는 MCs의 MCs의 일반적인 형태학 및 phenotypic 기능을 표시 하 고 캘리포니아2 +-secretagogues에 대 한 높은 재현성 응답 시연 이미징 및 degranulation 분석 실험입니다.

PMCs 복 게 여 3 야생 타입 마우스 (C57BL/6N) 으로부터 격리 되었고 추가 보충 RPMI 매체에 교양 20 %FCS 1% 펜-Strep 메 마른에서 성장 인자 (IL-3 10 ng/mL) 및 30 ng/mL에서 SCF의 습도 조건에서 37 ° C, 5% CO2. 매체는 셀 격리 후 2, 9 일에 변경 되었습니다. 셀 형태 전송 사용 하 여 분석 DIC 이미징 빛 ( 그림 1A, B참조). 셀 대비 및 세분성 좋은 세포 생...

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Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

여기, 우리는 격리 하 고 murine 복 막 돛대 세포 배양 프로토콜을 제시. 우리는 또한 그들의 기능 특성에 대 한 두 개의 프로토콜 설명: 출시 된 β-hexosaminidase의 색도계 정량화를 기반으로 하는 무료 세포내 캘리포니아2 + 농도와 degranulation 분석 결과 형광 영상.

복 막 파생 돛대 세포 및 그들의 기능 특성화 캘리포니아2 +의 격리-이미징 및 Degranulation 분석 실험

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

isolation-peritoneum-derived-mast-cells-their-functional

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

12.2K 조회수.  Ruprecht-Karls Heidelberg University. 여기, 우리는 격리 하 고 murine 복 막 돛대 세포 배양 프로토콜을 제시. 우리는 또한 그들의 기능 특성에 대 한 두 개의 프로토콜 설명: 출시 된 β-hexosaminidase의 색도계 정량화를 기반으로 하는 무료 세포내 캘리포니아2 + 농도와 degranulation 분석 결과 형광 영상.

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Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

심장 기능 면역 세포의 분리

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

기능 모티브과 바인딩 파트너 펩타이드 기반의 식별

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

유기 용매를 사용하지 않고 트리클로산의 효과 : RBL-2H3 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 평가하는 마이크로 분석 실험

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

요오드 산 쉬프 염색 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 감지

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such as skin, airways and gastrointestinal tract. Best known for their detrimental role in IgE-dependent allergic reactions, MCs have also emerged as important players in host defense against venom and invading bacteria and parasites. MC phenotype and function can be influenced by microenvironmental factors that may differ according to anatomic location and/or based on the type or stage of development of immune responses. For this reason, we and others have favored in vivo approaches over in vitro methods to gain insight into MC functions. Here, we describe methods for the generation of mouse bone marrow-derived cultured MCs (BMCMCs), their adoptive transfer into genetically MC-deficient mice, and the analysis of the numbers and distribution of adoptively transferred MCs at different anatomical sites. This method, named the &#8216;mast cell knock-in&#8217; approach, has been extensively used over the past 30 years to assess the functions of MCs and MC-derived products in vivo. We discuss the advantages and limitations of this method, in light of alternative approaches that have been developed in recent years.

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

We describe a method for the generation of in vitro derived mast cells, their engraftment into mast cell-deficient mice, and the analysis of the phenotype, numbers and distribution of engrafted mast cells at different anatomical sites. This protocol can be used to assess the functions of mast cells in vivo.

'마스트 셀 노크-인' 마우스를사용 하 여 생체 내 비만 세포의 기능 분석

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

항 종양 특성을 가진 분리 및 호중구의 특성

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

절연, 특성화 및 잇몸 면역 세포 네트워크의 기능 시험

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...