우리는 동물 생리학 코어, 기술 지원 및 Vevo 2100 초음파 biomicroscopy (UBM) 시스템에 대 한 오픈 액세스를 제공 하기 위한 UCLA에서 분자 의학의 감사. 이 연구는 NIH/아동 건강 연구 센터 (5K12HD034610/K12), UCLA-어린이 디스커버리 연구소와 오늘과 내일 아 이들의 기금에 의해 지원 되었다 그리고 M. 성격은 데이비드 Geffen 학교의 의학 연구 혁신 상을.

캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스, 동물 관리 및 사용 위원회는이 프로토콜에 표시 된 모든 절차를 승인 했습니다. 실험은 활성 동물 프로토콜 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스, 캘리포니아, 미국에서 진행 중인 연구의 일환으로 실시 되었다. 동물 처리 및 치료 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드의 기준에 따 랐 다.
1. 높은 주파수 초음파 이미징 시스템 준비
<ol><li>초음파 이미징 시스템 및 생리학 모니터링 장치를 켭니다.</li>
	<li>30/45 MHz 트랜스듀서를 연결 합니다.</li>
	<li>그것의 홀더 이미징 플랫폼 근처에 해당 스캔 헤드를 놓습니다.</li>
	<li>심장 측정 프로그램 옵션을 선택 합니다.</li>
	<li>초음파 젤 37 ° c 설정 미리 데우는 컨테이너에 거꾸로 하는 장소</li>
	<li>마 취에 대 한 적절 한 배관 시스템을 확인 하 고 산소와 isoflurane 수준을 확인 합니다.</li>
	<li>이미징 플랫폼과 작업 영역을 치료.</li>
	<li>일정 온도 유지 하기 위해 이미징 플랫폼의 열 수준 및 댐의 심장 박동을 설정 합니다.</li>
</ol>2. 임신 마우스 준비
<ol><li>마 취 유도 실에서 임신 마우스 (C57/BL6) 댐을 놓습니다.</li>
	<li>마 취를 유도 사용 하 여 지속적으로 100% 산소 (100% O2) 유도 실에서 200 mL/min의 유량에 섞인 inhalational isoflurane (isoflurane 2%-3%)를 전달.</li>
	<li>Sedated 동물 부정사 위치에 이미징 플랫폼에 전송.</li>
	<li>안 면 마 취 튜브 시스템 제공 isoflurane (1.0-1.5%)에 연결을 사용 하 여 정상 상태 진정 섞인 100% O2 200 mL/min에서 제공 합니다. 주의: 용기 집합을 포함 하는 숯 필터를 갖춘 환기 시스템을 사용 하 여 마 취 가스의 누설을 제어 합니다.</li>
	<li>모성 심장 및 호흡 속도 지속적으로 모니터링을 달성 하기 위해 전극 젤의 신청 후 부드럽게 임베디드 electrocardiographic 전극에 사지를 테이프.</li>
	<li>(50 비트/분 (bpm) + 450)의 평균 심장 박동을 유지 하기 위해 isoflurane 수준을 조정 합니다.</li>
	<li>37.0 ° C ± 0.5 ° c.의 범위 내에서 체온을 유지 체온과 생리학 컨트롤러 단위에 표시 되 고 심장 박동을 모니터링 합니다.</li>
	<li>Sedated 마우스 이미징 절차에 걸쳐 마다 15 분의 생체 신호를 기록 합니다.</li>
	<li>마우스의 자세, 심장 박동, 그리고 pinches 발가락에 대 한 응답을 평가 하 여 마 취의 정도 평가 합니다.</li>
	<li>눈 건조 및 각 막 손상을 방지 하기 위해 안과 밤 (각 눈에 1 방울)을 적용 합니다.</li>
	<li>초음파 감쇄를 최소화 하기 위해 depilatory 크림을 사용 하 여 더 낮은 사지에 중순 가슴 수준에서 모피를 제거 합니다. 습식 및 건식 거 즈를 교체 하 여 응용 프로그램 손상을 방지 하기 위해 피부에 패치 후 크림 1-1.5 분을 제거 합니다.</li>
</ol>3. 배아 식별
<ol><li>복 부 벽은 태아를 찾아서 그들을 밖으로 확산을 부드럽게 만져</li>
	<li>댐의 복 부에 각 배아를 주석 하 고 마커를 사용 하 여 그들의 이전 후부 및 등 쪽 복 부 방향을 정의 합니다.</li>
	<li>Sedated 댐의 자 궁 경부를 사용 하 여 랜드마크로. L1, L2, L 3, 왼쪽 및 오른쪽 자 궁 뿔에 태아 레이블 등 (왼쪽)와 R1, R2, R3, 등 (오른쪽), 각각 (그림 1A). 주의:는 태아를 강제로 확산 하지 마십시오. 각 담가에 1-2 태아는 다른 사람, 그들의 위치 및 이미징 신뢰할 수 없는 만드는 겹칠 수 있습니다. 분석에서이 태아를 제외 합니다.</li>
</ol>4. 태아 심장 시각화 및 주석
<ol><li>복 부에 미리 데워 진된 초음파 젤을 적용 하 고 거품 형성을 피하기 위해 신중 하 게 그것을 확산. 스캔 이미지의 영역에 젤의 추가 금액을 추가 합니다.</li>
	<li>그것의 기계적인 보유자에 초음파 프로브를 놓고 두꺼운 젤 레이어 검색 B 모드 (그림 1)를 사용 하 여 뛰는 심장에 대 한 찾는 동안 접촉 하 게 피부 쪽으로 점차적으로 그것을 동원 합니다.</li>
	<li>2 차원 이미지를 스캔 B 모드 버튼을 클릭 합니다. 첫 번째 태아는 오른쪽 또는 왼쪽된 자 궁 경적에 위치를 식별 하 고 각각 R1 또는 L1로 표시 하는 랜드마크로 방광을 사용 합니다.</li>
	<li>실시간으로 개별 태아의 오른쪽 및 왼쪽 방향 수평 평면에 이미징 플랫폼을 이동 하 여 확인 합니다. 랜드마크 (그림 1B, 비디오 1)로 서 주 둥이, 팔, 다리 및 척추를 주석을 꼬리 머리에서 스캔.</li>
	<li>뛰는 심장 시각화 하 고 주석이 왼쪽된 심 실 (LV)와 우 심 실 (RV). 심장 시각화를 최적화 하기 위해 사용 색 도플러 모드 (그림 1 C-G, 동영상 1-2).</li>
	<li>보기-parasternal 짧은 축를 스캔 B 모드 버튼을 클릭 LV와 RV 데이터 수집 프레임의 센터에 그들의 최대 직경에 표시 됩니다. 라이브 영상 (그림 1B-C)을 시작 합니다.</li>
	<li>경도 4 챔버 보기 (그림 1D)를 비행기를 검색에 대해 마우스의 방향을 변경 합니다. 첫째, 심 방, interventricular 심장, 왼쪽 및 오른쪽 유출 책자 등 심장의 나머지 구조를 식별 합니다. 다음, 그들의 최대 직경에 표시 되는 심 실 및 심 방 실 있다. 이미지 수집을 시작 합니다.</li>
	<li>최종 분석에서 최적 비, 간접 이미지를 제외 합니다. 10의 최소 연속 녹음 'Cineloops'를 Cini 클릭 기록된 이미지 저장 후 s.</li>
</ol>5. 태아 심 박수 및 심 실 기능 평가
<ol><li>4 개의 챔버 비행기 (비디오 3)에서 심장 이미지를 스캔 M 모드 버튼을 클릭 합니다.</li>
	<li>모든 태아의 이미지 작업이 완료 되 면 분석에 대 한 기록의 목록 보기</li>
	<li>최종 분석에서 최적 비, 간접 이미지를 제외 합니다.</li>
	<li>측정 벽 두께와 심장 (LVID, d;에서 왼쪽/오른쪽 심 실 내부 직경 분석 버튼을 클릭 RVID, d)와 systole (LVID, s; RVID, s), 그림 2와 같이.</li>
	<li>각을 재생 하 여 평균 태아의 심장 박동 기록 추적 하 고 계산 하는 다음과 같은 흐름에 하나의 흐름 주기의 측정 주기 (인접 한 봉우리 사이의 간격) M 모드를 결정 합니다.</li>
	<li>평균 심장 박동 (그림 2)를 얻기 위해 여러 측정 (추적 당 적어도 5)를 수행 합니다.</li>
	<li>왼쪽된 심 실 내부 확장기 직경 (LVID, d) 사이의 심장 주기 끝 systole (LVID, s)에서 왼쪽된 심 실 내부 직경 시간적 변화를 측정 합니다. 다음 분수 단축 백분율 (FS %)를 다음과 같이 계산: FS % [(LVID,d-LVID,s)/LVID, d =] x100.</li>
	<li>평균 FS % 값을 얻기 위해 여러 측정 (추적 당 적어도 5)를 수행 합니다.</li>
</ol>6. 구급 흐름 매개 변수를 평가
<ol><li>수집의 각도 분야 60o조정 합니다. 45-MHz 변환기를 사용 하 여 2 차원 4 챔버 영상 평면에서 펄스 파 도플러 측정을 수행 하려면 도플러 클릭 합니다.<ol>
<li>먼저, 오른쪽 유출 관을 식별 하 고 폐 동맥의 분기 시각화. 다음으로 폐와 대동맥 밸브 (그림 3A, 비디오 4) 통해 흐름 패턴을 얻기 위해 펄스 파 도플러 단추를 클릭 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>펄스 파 도플러 추적, 최대 수축 기 속도 (PkV), 배출 시간 (동부 표준시), (에서), 가속 시간 등에서 폐 흐름 측정을 가져옵니다.</li>
	<li>(오른쪽) 그림 3A 에서 같이 평균 측정을 얻기 위해 여러 측정 (추적 당 적어도 5)를 수행 합니다.</li>
	<li>AT 계산 / 외 각에 대 한 유출 책자 patency의 지표로 서 밸브를 유출 비율과 혈액 흐름.</li>
	<li>펄스 파 도플러를 사용 하 여 2 차원 꼭대기 4 챔버 뷰에서 mitral 및 대동맥 흐름 패턴을 얻을로 이동 합니다. 먼저, 왼쪽된 심 방 및 좌 심 실 챔버를 식별 합니다. 그런 다음 펄스 파 도플러 샘플 볼륨을 (A) (그림 3B)24,25mitral 유입 도플러 패턴 및 측정 초기 확장기 속도 (E)와 심 방 수축 속도의 기록에 대 한 놓습니다.</li>
	<li>대동맥 도플러 제트 패턴을 얻기 위해 도플러 샘플 볼륨을 조정 합니다. 대동맥 도플러 제트기 (오른쪽) 그림 3B 에서 같이 가속 (에서) 시간과 배출 시간 (동부 표준시)을 측정 하기 위해 추적 (비디오 5)를 사용 하 여</li>
</ol>7. 평가 Feto Placental 축
<ol><li>컬러 도플러 검사를 사용 하 여 45의 트랜스듀서 (그림 4A)를 사용 하 여 자 궁 동맥 및 feto 태 반 혈관 트리 시각화.</li>
	<li>태아 복 부에서 코드 종료 직후 탯, 양수 내 세그먼트에 탯 줄 혈관 (두 동맥과 1 개의 정 맥)를 식별 합니다.</li>
	<li>장소 펄스 파 도플러 샘플 볼륨 탯 줄 동맥 흐름 패턴 (그림 4A)를.</li>
	<li>(에서), 방출 시간 (동부 표준시), 가속 시간을 포함 한 혈관 피크 흐름 매개 변수를 측정 하 고 흐름 속도 끝 systole (PkV, s)에서 피크 펄스 파 도플러 검사 기록 (그림 4B)를 사용 하 여.</li>
	<li>태아의 움직임과 모성 호흡 운동, 각 선박에 대 한 평균 최고 속도 측정 하의 부재에서 각 선박에서 5 연속 파형을 얻을.</li>
	<li>다음 배아를 진행 합니다.</li>
</ol>8. 후 이미징 동물 모니터링
<ol><li>이미징 프로세스의 완료 후 isoflurane 컨테이너를 해제 합니다.</li>
	<li>계속 복구 단계 동안 체온, 호흡 속도 심장 박동을 모니터링 합니다.</li>
	<li>댐 시작 자발적인 움직임은 안 면 및 연결된 배관 시스템을 제거 합니다.</li>
	<li>적절 한 주거에 댐을 반환 하 고 표준 기관 수술 후 프로토콜에 따라 관찰을 계속.</li>
	<li>정상적인 활동의 전체 재개 시간을 문서화 합니다.</li>
</ol>9. 성능 요구 사항 및 기술 고려 사항
<ol><li>생체 신호 및 생리 적 매개 변수에 장시간된 마 취의 부작용을 피하기 위해 약 1 h ~ 8 태아에 대 한 처리 시간을 제한 합니다.</li>
	<li>이미지 수집 및 흐름 패턴 짧은 시간 프레임에 추적에 대 한 기술을 최적화 하 8-10 임신 쥐와 함께 훈련을 완료 합니다.</li>
</ol>

<ol>
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관심 없음 충돌 선언.

심장 혈관 기형 및 질병 실질적으로 유전 요인과 환경 요소19에 의해 좌우 된다. 우리 이전 두 번째 임신의 feto 태 반 순환 흐름 및 태아 심장 기능9중 시작 모성 열 량 제한의 상당한 영향을 설명 했다.
태아 저 산소 증은 대단히 feto placental 생리학 및 순환 시스템에 영향을 미칠 수 있습니다 태아 개발 중 또 다른 일반적인 스트레스 요소 이다. 태아 hypoxia 노출의 영향 출생 후 생활에 불 쌍 한 perinatal 적응 선도 CHD의 맥락에서 더 깊은 있을 수 있습니다. 비정상적인 심장 박동수와 심장 인덱스가이 연구에서 발견 심장 스트레스와 변경 된 태 반 순환 생리학, 실제로 중요 한 지표 이며 따라서 발달 결함을 탐지 하기 위한 필수적인 기본 요소를 구성 하 고 수 더 발음 되 태아에 hypoxic 필연적인 hemodynamic 변경 스트레스 초기 심장 마비로 이어지는. 기대, 반대로 태아 hypoxia 노출 낮은 심장 박동수를 했다. 이 현상 GD18.5에서 산소에 태아 쥐에 있는 미 숙 심장 autoregulation 메커니즘 반영 수 있습니다. 그러나, 정확한 병 인 알 수 없는 남아 있습니다.
다른 고급 이미징 방법, 태아 심장 MRI 등 허용 개발20동안 심장 구조의 라이브 영상, hemodynamic 상태는 종종 정적 이미지와 긴 절차 손실입니다. 비 침범 성 초음파 기술, 다른 한편으로, vivo에서 동적 이미징 기준선 생리학을 유지 관리를 수행 수 있습니다. 또한, 향상 된 해상도와 높은 주파수 변환기의 가용성, 각 개별 태아의 다른 발달 단계에서 태아 심장의 시각화 될 수 있다 유전자 변형 마우스에 추가 가능한 태아 주석 최적화 하 여 방법입니다. 마지막으로, 실험 당 비용 훨씬이 메서드를 사용 하는.
김 GH 외.이전 보고서, 저자 높은 주파수 초음파 이미징 시스템21의 이전 세대를 사용 하 여 데이터 수집을 위한 이미징 계획 최적화에 관한 중요 하 고 새로운 통찰력을 제공. 저 우 YQ 외.에 의해 다른 보고서 컬러 도플러 시스템22를 갖춘 고주파 초음파를 사용 하 여 태아 순환 생리 적 수준에서의 표준화 된 기준 측정을 설립 했다. 따라서, 여기에 제시 된 프로토콜 이전 설립된 프로토콜을 보완 하 고 확장 가능 하 고 실시간으로 실험 환경에서 실용적인 포괄적인 방법을 개요. 고급 및 매우 민감한 고주파 초음파 시스템 단위로 feto placental 회로 검사를이 연구에 사용 되었다. 개요 프로토콜은 간단 하 고 같이 GD18.5에서 쥐에 있는 태아 순환에 미치는 영향 hypoxia의 정량 측정을 달성 하 여 효과적으로이 강력한 시스템을 표준화.
그럼에도 불구 하 고, 중요 한 제한 및 치명적인 심장 이미징의 도전을 인정 한다: isoflurane를 포함 하 여 첫 번째, 마 취 에이전트 태아의 생리 적인 매개 변수에 영향을 미칠 수 있습니다. 장시간된 마 취, 탈모, 및 초음파 젤 저 체온, 심장 박동 및 댐은 태아의 hemodynamic 인덱스에 영향을 미칠 수 있습니다 발생할 수 있습니다. 현재, 마 취 에이전트 및 태아에 대 한 그들의 충격의 수준을 평가에 사용할 수 있는 방법이입니다. 이 제한을 우회 하 우리는 신중 하 게 그들의 기저 심 박수 및 생체 신호를 유지 하면서 댐의 적절 한 진정을 달성 하기 위해 흡입된 Isoflurane 수준을 적정. 둘째, 깊은 복 부에 있는 태아를 시각화 이며 어려운 차선, 최종 데이터 분석에서 이러한 태아의 배제로 이어지는. 컬러 도플러 이미지 섹션 및 변환기 및 혈액 흐름 사이의 적절 한 정렬의 향상 된 최적화를 허용 한다. 셋째, 모든 태아의 동시 분석을 수행 해야 합니다 신속 하 고 정확한 시각화 및 이미지 수집에 운영자의 효율성을, 실제적인 훈련의 중요성을 암시.
마지막으로,이 방법의 주요 단계 1를 포함 하 여 강조 될 필요가) 시스템의 적절 한 준비. 2) 안정 체온과 임신 마우스에 대 한 심장 박동을 유지. 3) 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해 배아의 초기 생리 상태를 유지 하기 위해 isoflurane의 유량 최적화. 4) 일치 하 고 가능한 짧은 시간 내 효율적인 이미지 수집. 5) 임신 나이, 성별, 및 동물 스트레인은 결과 크게 영향을 미칠 수 있는 중요 한 변수입니다. 따라서, 실험 프로토콜 데이터 분석 및 해석에 같은 동물 스트레인에서 일치 컨트롤을 포함 하 여 이러한 변수를 신중 하 게 설계 되어야 한다.
결론적으로, 높은 주파수 초음파 시스템은 태아 심혈 관 시스템에 utero에 중요 한 실험과 과학적 가치와 수 있습니다 잠재적인 미래의 애플 리 케이 션의 phenotypic 특성을 달성 하는 효과적인 방법 1 포함) 심장 개발 하는 동안 생리 적인 역학을 이해. 2) 달성 포괄적인 phenotypic 분석 CHDs. 3의 유전자 모델) Elucidating 심장 챔버 개발, 성숙, 그리고 스트레스 적응에 미치는 영향 feto-태 반 순환. 4) 수행 초음파 태아 주입 미래에 독 소, 기형, 또는 치료제를 연구 안내. 6) 구현 얼룩 추적 및 스트레인 분석 기능 개발 심근의 상세한 지역 심근 기능을 얻기 위해 미래 연구를 위한 기초를 제공할 수 있습니다.

심장의 선 천 성 기형의 조기 심장 개발 하는 동안 발생 하는 다른 유형의 구조적 결함이 있습니다. 운영 절차의 현재 기술 진보는 CHDs1,2유아의 생존 율에 상당한 개선을 이끌어 냈다. 그러나, 삶의 질입니다 종종 장기간된 입원을 필요 손상 된 보조 외과 수리 절차1,2,3,,45을 벌였다. CHDs의 기본 분자 메커니즘의 태아 기 탐지 계획 초기 개입, 새로운 예방 전략을 실시 하 고 평생 결과6,7을 개선 하기 위해 결정적 이다.
여러 유전과 환경 요인 CHDs 병에 연루 되어, 비록 unmet 필요가 개선 진단, 치료, 그리고 예방 전략1,8,9 남아는 인과 관계를 설정 ,10,,1112. 또한, 미래의 조사11,12에 대 한 새로운 장소 열립니다 utero에 스트레스 요인과 epigenetic 한정자의 역할을 검토. 지난 10 년간 실제로 차세대 시퀀싱 기술 등 단일 염기 다형성 (SNP) microarray, 전체 exome 시퀀싱, 게놈 전체 메 틸 화 연구, 유전자 연구에 그들의 사용에서에서 급속 한 발전을 목격 했다 CHDs1,,89,10,11 소설 돌연변이 아직 되지 않은 유전 이체를 식별 하는 방법은 포장을 포함 하 여 복잡 한 인간의 질병의 원인 그들의 pathogenicity 적절 한 동물 모델에 대 한 테스트.
다른 질병 모델 시스템 가운데 마우스는 선택, 뿐만 아니라 초기 cardiogenesis13,14,,1516, 동안 뿐만 아니라 명료 CHDs의 메커니즘을 조사 동물 모델 임산부 및 주 스트레스 요인에 늦은 임신에서 기능과 심장 챔버 성숙에 그들의 영향. 따라서, vivo에서 phenotypic 특성 돌연변이 태아 마우스 심 혼의 개발 초기와 후반 단계를 수행 하는 것은 이러한 유전자 변이 심장 개발에 환경 요인의 역할을 이해 하는 중요 한 고 약 실 특정 성숙에 잠재적인 미래 영향 쥐에 처리합니다.
조기 발견 및 개발 하는 동안 심장 결함의 정확한 진단이 중재 계획17,18에 대 한 중요 합니다. 안전, 간단 하 고, 휴대용 하 고 반복 되 고, 태아 초음파 실제로 되고있다 이미징 병원에서 심장 평가 위한 기술 표준. 태아 순환 평가 도플러 초음파를 사용 하 여 널리 사용 되었습니다 임상 연습 심장 결함의 검출을 위한 뿐만 아니라 뿐만 아니라 혈관 이상, 태 반 부족 및 자궁내 성장 금지를 감지 하 고 평가 하 태아 복지 utero에 모욕 hypoxemia, 모성 질환 및 약물 독성17,18를 포함 하 여에 대 한 응답. 인간의 결함과 질병 평가에서 그 가치를 병렬로 태아 쥐의 초음파 평가 실험 설정19,20,,2122에서 증가 유틸리티를 얻고 있다 23. 특히, 태아 심장 초음파 (심장 초음파) 개발의 순차적 vivo에서 시각화를 수 있습니다. 많은 실험 연구 유전자 변형 태아 쥐에 태아 심장 혈관 개발 관찰을 초음파 이미징 기술을 사용. 도플러 초음파는 특히 유용 생리 적 문제 또는 질병 조건10,19태아 순환의 흐름 패턴 같은 pathophysiological 매개 변수를 명료 하 게 되었습니다. 둘 다 인간과 동물, 태아에 게 비정상적인 혈액 흐름이 나 산소 공급 utero에서 태아 환경 중단 하 고 fetoplacental 축, 태 반 이상를 포함 하 여 어머니 산소에 영향을 미칠 수 있는 다양 한 조건에서 발생할 수 있습니다. 임신 성 당뇨병, 고 약물 유도 혈관 수축15,22. 따라서 태아 쥐에 도플러 초음파를 수행 하기 위한 표준화 된 방법을 수립 강화할 것입니다 대단히 CHDs의 미래 연구 모니터링 흐름 패턴 및 동안 심혈 관 회로의 주요 hemodynamic 인덱스를 촉진 하 여 유전 마우스 모델. 에 심장 개발의 다른 단계
높은 주파수 초음파 마우스 모델 및 인간 질병18에서 심장 혈관 시스템의 개발 및 생리 적 매개 변수를 측정 하는 강력한 도구로 떠오르고 있다. 이 기술은 최근 몇 년 동안에서 더 세련 되어 있다. 우리와 다른 연구자는 태아 마우스 심 혼15,19,20,21,22에 매우 높은 주파수 초음파 연구 수행을 위한이 시스템의 타당성을 증명 하고있다 ,23. 시스템은 도플러 컬러 흐름 매핑 및 높은 주파수 (30 ~ 50 m h z) 프레임 레이트에서 2 차원, 동적 이미지를 생성 하는 선형 배열 센서를 갖추고 있습니다. 낮은 주파수 초음파 시스템 및22, 높은 주파수의 초음파21,이전 세대에 비해 이러한 이점을 제공 심층 평가 태아 순환에 대 한 필요한 감도 및 해상도 시스템, 심장 구조, 챔버 기능 및 태아 쥐의 흐름 지 수의 포괄적인 묘사를 포함 하 여 실험 설정에서. 여기, 우리가 높은 주파수 시스템을 사용 하 여 심장과 순환 및 배아 하루 E18.5에서 vivo에서 에서 feto 태 반 순환의 급속 한 평가 수행 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 약 60 µ m의 축 분해능과 – 150 µ m의 수평 해상도 30/45 MHz 트랜스듀서를 선택 했다. 그러나, 유사한 방법론 접근에 따라 이전 발달 단계를 분석 하는 더 높은 주파수 변환기 (40/50 MHz)를 선택할 수 있습니다. M 모드는 선택 된 높은 시간 해상도 수준 (1, 000 프레임/s)에서 모션 조직의 시각화 수 있습니다. 마지막으로, 우리가 태아 심장 혈관 hemodynamic 상태 및 기능 기준선에 쥐에 있는 태아 hypoxia 스트레스에 대 한 응답에서의 상세한 포괄적인 phenotypic 특성에 대 한 높은 초음파의 타당성을 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1606">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:189px;">Vevo 2100&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:291px;">VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada</td>
			<td style="width:301px;">N/A</td>
			<td style="width:827px;">High Freequency Ultrasound Biomicroscopy. The set up is available in animal physiology core facility, division of molecular medicine, UCLA. USA</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">inbred mice (c57/BL6)&#160;&#160;</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inbread wild type mouse strain</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fetal mouse cardiovascular imaging using a high-frequency ultrasound (30/45mhz) system

선 천 성 심장 결함 (CHDs) 어린 시절 병 적 상태와 초기 사망률의 가장 일반적인 원인입니다. 태아 기 탐지 CHDs의 기본 분자 메커니즘의 새로운 예방 및 치료 전략을 발명에 대 한 결정적 이다. 돌연변이 마우스 모델은 새로운 메커니즘 및 심장 발달 및 그들의 잠재적인 CHDs 드라이브 환경 스트레스 한정자를 강력한 도구입니다. 그러나, 이러한 putative 참여자의 인과 관계를 설정 하는 노력 되었습니다 조직학 및 분자 비 생존 동물 실험에서 연구 하는 주요 생리 및 hemodynamic 매개 변수를 모니터링 하는 결 석. 라이브 이미징 기술을 CHDs의 병 인을 설정 하는 필수적인 도구가 되고있다. 특히, 초음파 영상 없이 사용할 수 있습니다 prenatally 수술 노출 태아, 심장 챔버의 hemodynamic 및 구조 측면에서 환경 스트레스의 영향을 모니터링 하는 동안 그들의 기준선 생리학을 유지 수 개발입니다. 여기, 높은-주파수 초음파 (30/45) 시스템 사용 하 여 심장 혈관 시스템 E18.5에서 utero에 기준선에 태아 쥐에 태아 hypoxia 노출에 대 한 응답에서을 검사 하. 우리 심장 챔버 크기, 형태, 심 실 기능, 태아 심장 박동, 그리고 탯 줄 동맥 흐름 인덱스, 그리고 조직의 만성 산소에 utero에서 진짜에서에 노출 태아 쥐에 그들의 변경 측정 시스템의 타당성 입증 시간입니다.

심장 및 hemodynamic 인덱스의 통계 분석은 오프 라인으로 수행 되었습니다. 3 최적의 이미지에서 5 연속 측정 수단을 계산 했다. 데이터는 ± SEM. 학생의 t의미 표현 했다-테스트 intergroup 비교 유추 하는 데 사용 되었다. P 값이 0.05 통계적으로 간주 되었다.
위의 프로토콜에 따라 우리 특징 태아 쥐의 심장 혈관 상태에 태아 hypoxia에 만성 노출의 영향 늦은 임신에서 실시간 고주파 초음파 녹음에 C57/BL6 초과 임신 쥐에 여 임신 일 (GD) 18.5입니다.
그룹을 번 식의 설립, 후에 성공적인 짝짓기 확인 됐다. 초과 임신 댐까지 음식과 물 광고 libitum 와 12 h 빛 어두운 정권 아래에서 연습장에서 유지 되었다. GD14.5에 임신 쥐 normoxia 그룹 (주변 공기에서 유지) 또는 (10% FiO2 조직의 저 산소 증을 유발 하는 것에 산소 챔버에 배치) hypoxia 그룹에도 할당 했다. 출생 후, 댐 및 그들의 새끼까지 남아 있었다 그들의 실험 조건에 할당 된 출생 후 하루 7 (P7).
총, 6에서 댐이이 실험에서 공부 했다 고 42 태아 GD18.5에서 성공적으로 촬영 했다. 이들의 36 태아에서 얻은 데이터는 이후 분석 (표 1)에 대 한 사용 되었다. GD18.5에서 태아 심장 박동수의 분석 했다 hypoxic 태아 태아 bradycardia (낮은 심장 박동수)에서 고통 및 경험 태아 심장 기능의 인덱스 (EF %와 FS %)의 중요 한 감소 (표 1)입니다. 놀랍게도, 탯 줄 동맥 PkVs의 최대 흐름 속도 (PkVs) 태아 hypoxia 노출 (그림 4B 및 표 1)에서 감소 했다. 또한, 탯 줄 동맥 가속 시간/방출 시간 (에서 / 동부 표준시) 비율 공개 상당히 낮은 값에 hypoxic 제안 normoxic 태아에 비해 탯 줄 혈관 흐름 저항 증가. 계약에서, 오른쪽 심 실 벽 두께 2-D/M-모드 이미지 (그림 5)에 측정으로 태아 hypoxia 노출에 증가 되었다. 이러한 데이터 총칭 RV로 이어지는 feto 태 반 혈관 회로에 높은 흐름 저항을 제안 때문에 RV 태 산소에 대 한 기본 관 침대 역할을 하는 동안 태아의 개발 하는 동안 지배적인 펌프 기능 가정, 비 대입니다. 중요 한 것은, 노출 hypoxia 신생아 출생 후 초기 치를 직면 했다. RV 실패 및 증가 혈관 저항 태아 hypoxia에 만성 노출에 의해 유도 되는 잠재적으로 원인 기여 하 고. 다시 산소 상해, 빈약한 먹이 및 모성 질병에서 발생 하는 산화 독성 등의 다른 요소를 제외할 수 없습니다. 그럼에도 불구 하 고, 태아 hypoxia 유발 심장 병의 정확한 기본 메커니즘 및는 태아의 초기 치 미래 연구에 결정 남아 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57210/57210fig1.jpg"> 그림 1: 태아 쥐 주석 심장 시각화 Utero에 사용 하 여 스캔 B-모드 그리고 컬러 도플러 심문. (A) 회로도 표현의 태아 쥐 식별 및 주석 (l: 왼쪽, r: 오른쪽). (B)에서 좌 심 실 (LV), 우 심 실 (RV), 및 interventricular 심장 (IVS)의 parasternal 짧은 축 볼 임신 일 18.5 태아 심장의 방향을 안내 하는 태아에서 해부학 랜드마크의 대표 이미지. (C) parasternal 색상 심문 심장 챔버 시각화를 촉진 하기 위하여 LV와 RV 짧은 축 볼의 대표적인 이미지입니다. (D) 경도 4-챔버 LV, RV, 왼쪽 심 방 (LA)와 오른쪽 심 방 (RA) 컬러 도플러의 볼. (E) 경도 4 상공 회의소 보기 LV, RV의 컬러 도플러 심문 유출 책자의 시각화를 촉진 하기 위하여: 오른쪽 심 실 유출 지역 (RVOT), 좌 심 실 유출 지역 (LVOT), 대동맥 (AO), 및 오른쪽 심 실 유출 요로 (RVOT)입니다. (F) 대표 색상 RVOT와 실바의 도플러 심문 (G) 대표 색 LVOT AO의 도플러 심문. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57210/57210fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57210/57210fig2.jpg"> 그림 2: 태아 심 박수 및 심 실 기능 평가. (A) 대표 M-모드 추적 GD 18.5에서 긴 축 4 상공 회의소 보기에서 얻은. (LV: 왼쪽 심 실; RV: 우 심 실; 라: 좌 심; RA: 오른쪽 아 트리 움). 심장 (LVID, d;에서 왼쪽과 오른쪽 심 실 내부 직경을 포함 하 여 심 실 크기의 (B) 대표 정량화 (arrowed 라인) 방법 RVID, d)와 systole (LVID, s; RVID, s), 왼쪽 및 오른쪽 심장 (LVAW, d;에서 심 실 벽 두께 RVW, d), Interventricular 심장 (IVS), HR의 비트 비트 측정 4에서 표시 됩니다 평면 이미징 챔버. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57210/57210fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57210/57210fig3.jpg"> 그림 3: 펄스 파 도플러 추적 태아 폐, 대동맥 및 Mitral 흐름 인덱스의. (A) 폐 동맥 펄스 파 도플러 추적 (왼쪽)의 대표 이미지. 정량화 방법 (라인) (가속 시간) 폐 흐름 인덱스 PkV (최대 속도), 동부 (방출 시간) 표시 됩니다 (오른쪽) 경도 4 상공 회의소 보기에서. Mitral 및 대동맥의 대표 이미지 (B) 펄스 도플러 흐름 패턴 (왼쪽) 그리고 승 모 판 흐름 인덱스 E의 정량화 (초기 확장기 속도) (심 방 수축)에서 동부 표준시, 대동맥 흐름 인덱스 및 PkV (오른쪽)에서 표시 되는 4-챔버 이미징 비행기입니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57210/57210fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57210/57210fig4v2.jpg"> 그림 4: Feto 태 반 순환의 평가. (A) Feto 태 반 혈관 회로 사용 하 여 도플러 심문 (위)의 대표 이미지와 모성 ECG 기록 (아래). (B) 의 펄스 파 도플러 녹음 및 부 량 측정 (라인) 탯 줄 동맥 흐름 인덱스 hypoxia (위)에 normoxia 컨트롤의 대표 이미지 노출 태아 쥐 (아래). (가속 시간) PkV (최대 속도), 동부 (방출 시간). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57210/57210fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57210/57210fig5.jpg"> 그림 5: Hypoxia에서 우 심 실 벽 두께의 평가 치료 태아 쥐. (A, B) 대표 M-모드 추적 normoxia 및 산소 조건에서 GD 18.5에서 긴 축 4 상공 회의소 보기에서 얻은. LV: 왼쪽 심 실, RV: 심, 오른쪽 심 실 벽 오른쪽. 줄은 systole (s) 및 (d) 심장 RVW 두께의 정량적 측정을 나타냅니다. (C) RVW, s 정량화 저 산소 증 치료 태아 쥐 normoxia에 비해 증가 RVW 두께를 보여줍니다. 오차 막대: 의미의 표준 오류입니다. GD 18.5 묘사에 태아 심 혼의 (D) 대표적인 단면 이미지 hypoxia 취급 및 처리 하는 normoxia 그룹에서 RV 벽 두께를 증가 했다. 원래 확대 10 배입니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57210/57210fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>매개 변수, 단위</td>
			<td>Normoxia</td>
			<td>태아 저 산소 증</td>
		</tr>
<tr>
<td>성공적으로 이미지 태아의 수</td>
			<td>20</td>
			<td>16</td>
		</tr>
<tr>
<td>출생 후 사망 율</td>
			<td>5%</td>
			<td>68.75%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hemodynamic 매개 변수</td>
			<td>(평균 ± SEM)</td>
			<td>(평균 ± SEM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>태아 심장 박동, bpm</td>
			<td>138 ± 4</td>
			<td>89 ± 8 * * *</td>
		</tr>
<tr>
<td>좌 심 실 EF %</td>
			<td>71.2 ± 3</td>
			<td>55 ± 2 * *</td>
		</tr>
<tr>
<td>좌 심 실 FS %</td>
			<td>43 ± 2</td>
			<td>29 ± 4 * *</td>
		</tr>
<tr>
<td>폐 동맥 PkV, m m/s</td>
			<td>102 ± 10</td>
			<td>129 ± 8 * *</td>
		</tr>
<tr>
<td>외 비 폐 동맥에</td>
			<td>0.42 ± 0.05</td>
			<td>0.35 ± 0.03*</td>
		</tr>
<tr>
<td>탯 줄 동맥 PkV, m m/s</td>
			<td>58 ± 4</td>
			<td>40 ± 1.5* * *</td>
		</tr>
<tr>
<td>외 비에서 탯 줄 동맥</td>
			<td>0.5 ± 0.03</td>
			<td>0.42 ± 0.025*</td>
		</tr>
<tr>
<td>탯 줄 정 맥 PkV, m m/s</td>
			<td>13 ± 1.2</td>
			<td>19.6 ± 3 * *</td>
		</tr>
<tr>
<td>탯 줄 동맥 정 맥 지연, 석사</td>
			<td>122 ± 4</td>
			<td>238 ± 20 *</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">EF, 방출 분수; FS, 소수 단축; 나, 사용할 수 없습니다; NS, 중요 하지; PkV, 피크 속도; PkV, d, 피크 속도 동안에 심장; PkV, s, systole; 중 최대 속도 학생의 t 시험 intergroup 차이 유추 하는 데 사용 되었습니다. P < 0.005. * * P < 0.01. * P < 0.05 남북 그룹 비교에 큰 차이 나타냅니다. 스튜던트 t-검정. 비의 빈 남아 있지 않았다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: normoxic의 임신 일 18.5에 hypoxic 태아 쥐 Hemodynamic 매개 변수. EF, 방출 분수; FS, 소수 단축; PkV, 피크 속도; AT, 가속 시간; 동부, 방출 시간입니다. 학생의 t 시험 intergroup 차이 유추 하는 데 사용 되었습니다. * * * P < 0.005. P < 0.01, 그리고 * P < 0.05 남북 그룹 비교에 큰 차이 나타냅니다.
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/57210/57210vid1v2.jpg"> 비디오 1: B 모드 짧은 축 보기. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57210/Video_1-B_mode-Short_axis_View.avi" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/57210/57210vid2v2.jpg"> 비디오 2: 컬러 도플러-꼭대기 경도 보기. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57210/Video_2-Color_Doppler-Apical_Longtudinal_View.avi" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/57210/57210vid3v2.jpg"> 비디오 3: M-모드. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57210/Video_3-M-Mode.avi" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/57210/57210vid4v2.jpg"> 비디오 4: 폐 동맥-펄스 파 도플러. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57210/Video_4-Pulmonary_Artery_Pulsed_wave_Doppler.avi" target="_blank"> (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>

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Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

태아 마우스 심장 혈관 이미징 높은 주파수 초음파 (30/45 m h Z) 시스템을 사용 하 여

태아 마우스의 높은 주파수 초음파 이미징 영상 해상도 개선 하 고 심장 개발 및 구조적 결함의 정확한 비-침략 적 특성을 제공할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 실시간 태아 쥐 심장 초음파에서 vivo에서수행 하도록 설계 되었습니다.

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

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Circulatory and Pulmonary Systems

SCIENTISTS IN ACTION

11.5K 조회수.  University of California, Los Angeles. 태아 마우스의 높은 주파수 초음파 이미징 영상 해상도 개선 하 고 심장 개발 및 구조적 결함의 정확한 비-침략 적 특성을 제공할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 실시간 태아 쥐 심장 초음파에서 vivo에서수행 하도록 설계 되었습니다.

비디오: Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

고주파 초음파를 사용하여 마우스 태아에 대비 이미징

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

연구

발생학

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Photoconvertible PSmOrange 시스템을 사용하여 GFP 유전자 변형 Zebrafish의 세포를 추적

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

마우스에서 초기 임신 특성에 대 한 3 차원 높은-주파수 초음파의 새로운 사용

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances early in the gestation. The rationale behind IUT for therapeutic purposes is based on the small size of the fetus, the fetal immunologic immaturity, the accessibility and proliferative nature of the fetal stem or progenitor cells, and the potential to treat a disease or the onset of symptoms prior to birth. Taking advantage of these normal developmental properties of the fetus, the delivery of hematopoietic stem cells (HSC) via an IUT has the potential to treat congenital hematologic disorders such as sickle cell disease, without the required myeloablative or immunosuppressive conditioning required for postnatal HSC transplants. Similarly, the accessibility of progenitor cells in multiple organs during development potentially allows for a more efficient targeting of stem/progenitor cells following an IUT of viral vectors for gene therapy or genome editing. Additionally, IUT can be used to study normal developmental processes including, but not limited to, the development of immunologic tolerance. The murine model provides a valuable and affordable means to understanding the potential and limitations of IUT prior to pre-clinical large animal studies and an eventual clinical application. Here, we describe a protocol for performing an IUT in the murine fetus through intravenous and intra-amniotic routes. This protocol has been used successfully to elucidate the necessary conditions and mechanisms behind in utero hematopoietic stem cell transplantation, tolerance induction, and in utero gene therapy.

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

We describe a protocol for performing an in utero transplantation (IUT) through intravenous and intra-amniotic routes of injection in the murine model. This protocol can be used to introduce cells, viral vectors, and other substances into the unique immune-tolerant fetal environment.

정 맥 및 양수 내 Utero Murine 모델에 이식

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

연구 조직 이식에 세균성 부착을 병렬 플레이트 관류 시스템의 생체 외에서 모델

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and painless, and the application is easy, fast, and can be done anywhere, even with mobile devices. During pregnancy, ultrasound imaging is standardly used to closely monitor fetal development. The technique is important to assess intrauterine growth restriction (IUGR), a pregnancy complication with short- and long-term health consequences for both the mother and fetus. Understanding the process of IUGR is indispensable for developing effective therapeutic strategies. 
The ultrasound system used in this manuscript is an ultrasound device produced for the analysis of small animals and can be used in various research fields, including pregnancy research. Here we describe the usage of the system for in vivo analysis of fetuses from natural killer (NK) cell/mast cell (MC)-deficient mothers that give birth to growth-restricted pups. The protocol includes preparation of the system, handling of the mice before and during measurements, and the usage of the B-mode, color doppler mode, and pulse-wave doppler mode. Fetal size, placental size, and blood supply to the fetus were analyzed. We found reduced implantation sizes and smaller placentas in NK/MC-deficient mice from mid-gestation onwards. In addition, MC/NK-deficiency was associated with absent and reversed end diastolic flow in the fetal Arteria umbilicalis(UmA) and an elevated resistance index. The methods described in the protocol can easily be used for related and non-related research topics.

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Here we describe the technique of high frequency ultrasound for in vivo analysis of fetuses in mice. This method allows the follow-up of fetuses and the analysis of placental parameters as well as maternal and fetal blood flow throughout pregnancy.

비보에 태아 및 태 반 개발의 분석에 대 한 높은 주파수 초음파

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...