We thank O. Subach for providing the original H2B-PSmOrange plasmid and our fish facility team for fish care. We are grateful to the Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg for access to microscopy equipment and analysis software. We acknowledge the support of the Core Facility Live Cell Imaging Mannheim at the CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). This work was supported by the Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Spatio-temporal coordination of signaling processes (EcTop 2), University of Heidelberg to C.A.B. and the Medical Faculty Mannheim of the University Heidelberg and the DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 and 298/6-1) to M.C.

1. H2B-PSmOrange mRNA의 시험 관내 전사 및 mRNA의 정제 <ol><li> 제조업체의 지시에 따라를 NotI 제한 효소를 사용 PCS2 + 플라스미드를 함유-H2B PSmOrange 선형화. 참고 : mRNA의 오염 및 열화를 방지하기 위해 같은 장갑, 실험실 코트 등의 적절한 보호를 사용하여 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 PCR 정제 키트 또는 페놀 - 클로로포름 계 방법을 사용하여 선형화 된 DNA를 정제. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 SP6-mRNA의 전사를위한 선형화 템플릿 DNA 1 μg의를 사용합니다. </li><li> 37 ° C에서 10 ~ 20 분 동안 1.0 U의 RNase 무료 DNaseI을 추가하여 DNA를 제거합니다. </li><li> RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 키트를 정리하여 mRNA의 정리. </li><li> mRNA의 순도 및 농도를 증가 6 μL 아세트산 나트륨 (3.0 M, pH를 5.2), 150 ㎕의 96 % 에탄올을 첨가하여 mRNA의 석출. m을 품어최소 30 분에서 24 시간까지 -20 ° C에서 ixed 솔루션입니다. </li><li> 4 ° C에서 45 분 18.407 XG에 솔루션을 회전시켜 mRNA를 수집합니다. 액체를 버리고, 150 μL의 70 % 에탄올의 mRNA를 재현 탁. 믹스와 4 ℃에서 추가로 15 분 동안 솔루션을 원심 분리기. 액체를 폐기 얼음에 5 분 동안 펠렛을 건조하고 20 μl를 초순수의 RNase 무료 물에의 mRNA를 재현 탁. </li><li> (100) mRNA의 희석 (99 μL의 초순수의 RNase없는 물 1 μl의 mRNA의) : 1 광도 측정에 의해 mRNA의 농도와 순도를 평가합니다. </li><li> 단기 저장을 위해, -20 ° C에서의 mRNA 용액을 유지한다. 장기간 저장을 위해, -80 ° C에서의 mRNA를 유지한다. </li></ol> Zebrafish의 배아에 2 H2B-PSmOrange mRNA의 미세 주입 <ol><li> TG 사용하여 주입하기 전에 쌍에게 밤에 짝짓기 설정 (foxD3 : GFP)를; TG (FLH : GFP)을 두 번 형질 전환 어류 (또는 다른 GFP 형질 전환 어류). 스페이서를 배치하여 분리 물고기를 남겨주세요그들 사이의 상대 시간을 제어한다. </li><li> 주입 아침에 스페이서를 제거하고 20 분 동안 물고기 짝을 할 수 있습니다. </li><li> 짝짓기 시간 동안, 130 페이지의 최종 농도-H2B PSmOrange mRNA의 희석 / NL 및 microloader 팁을 사용하여, 마이크로 인젝션 모세관에 전사 6 μL 주입 용액 (물에의 RNase 무료). 보정 된 유리 슬라이드와 주입량을 확인합니다. NL이 mRNA의 용액 (260 페이지)를 주입하는 주입 압력을 조정한다. </li><li> 1 배 배아 (E3​​) 매체를 포함하는 멸균 플라스틱 페트리 접시에 계란을 수집합니다. </li><li> 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 주입 접시에 20 ~ 30 배아를 전송합니다. </li><li> 한 세포 단계 (11)에서 노른자로 전지 셀에 또는 아래 사항 솔루션을 포함하는 2 NL의 mRNA를 주입한다. </li><li> 1 배 E3 매체를 포함하는 페트리 접시에 전송 주입 된 배아는, 미 수정 여부를 일반적으로 개발 배아를 제거하고 28 ° C에서 그들을 성장. 참고 : 가벼운 보호 O를배아 f를 실험을하는 동안 필요하지 않습니다. </li><li> 1 배 E3 매체에 제브라 피쉬의 배아를 올리고 색소 침착을 억제하는 낭 배기 후 0.2 mM의 PTU (1- 페닐 -2- 티오)를 추가합니다. 세균 오염의 위험을 최소화하기 위해 하루에 두 번 배지를 변경합니다. </li></ol> 3. 배아 퍼가기 <ol><li> GFP (녹색) 및 PSmOrange 형광 램프와 적절한 방출 필터가 장착 쌍안 현미경을 사용하여 (레드 / 오렌지)의 공동 발현 배아를 선택합니다. 1 배 E3 매체를 포함하는 멸균 페트리 접시에 긍정적 인 배아를 전송합니다. </li><li> 겸자 (12)를 사용하여 실체 현미경 Dechorionate 배아. </li><li> 1.0 ml를 포함하는 1.5 ML 튜브에 전송 한 배아 컷 팁 피펫 (P200)를 사용하여 초순수 제조 1.0 % 낮은 용융 아가로 오스 (LMA)를 미리은 예열. 참고 : 80 ° C에 LMA를 따뜻하게하고 배아를 삽입하기 전에 실온에서 3 ~ 5 분 동안 냉각. </li><li> 에 150 ㎕의 LMA에서 배아를 이동커브 글라스를 챔버 및 미세 플라스틱 팁을 사용, 아래로 반전 공 초점 레이저 주사 현미경 A1R + (또는 다른 적절한 현미경)에 기술 된 실험에서 배아의 방향, 예를 들어 지느러미 측면을 조정합니다. LMA가 중합되면, 마취 0.2 mM의 PTU 0.02 % 에틸 -3- 아미노 벤조 에이트 methansulfonate (Tricaine)를 함유하는 생선 물 챔버를 채운다. </li><li> 샘플을 이미징하기 전에 Tricaine의 효과를 확인하기 위해 15 분을 기다립니다. 마취는 브라이트 조명이 장착 된 실체 현미경을 사용하여 모니터링 할 수있는 배아의 움직임을 방지 할 수 있습니다. 주 : 챔버 회 재사용 될 수있다. </li></ol> 4. PSmOrange 광 <ol><li> 공 초점 현미경으로 시료를 넣고 488 nm의 각각 GFP 및 PSmOrange 촬상 561 nm의 레이저에 의한 photoconvert하는 영역을 식별하기 위해 표본을 검사한다. 주 : 반전 STA에 반전 촛점 레이저 주사 현미경을 사용 A1R +GE의 현미경 이미징 소프트웨어에 의해 TiEcontrolled 및 488 nm의, 561 nm의 광 및 이미징 640 nm의 레이저를 장착. 그러나, 애플리케이션이 확실히만큼 변환 이미징 레이저 라인이 가능한 현미경으로 한정되지 않는다. <ol><li> 제자리에 20X 공기 목적을 넣어 (NA : 0.75, WD를 : 1.0 mm, FOV : 0.64 X 0.64 mm)를. </li><li> 광 전에 PSmOrange 단백질을 검출하기 위해 다음과 같은 현미경 설정을 사용하여 561 nm의 레이저, 목적 위의 초점면에서 측정 된 0.74 mW의합니다. 주 :이 시스템이 40 %에 해당한다 (초점 평면에서 측정하는 유효 전력을 결정하기위한 유일한 방법이다). 변할 수-H2B PSmOrange 주사의 효율성 실험 필요에 따라 레이저 전력을 조정한다. </li><li> 관심 영역을 강조하기 위해 줌 요소를 추가합니다. 높은 배율 이미지 획득 시간 때문에 광독성을 감소시킨다. </li></ol></li><li> 구조를 포함하는 Z 스택 획득488 nm의 연속 모드 (라인 모드 1&gt; 4)에서 561 nm의 레이저를 사용하여 관심의. 1.0 및 2.0 μm의 사이의 Z-단계를 수정합니다. 라인 평균 주사 주파수는 화상 품질을 최적화하기 위해 사용될 수있다. </li><li> 샘플을 스캔하고 photoconvert 할 영역을 강조하기 위해 관심 (ROI) 도구의 지역을 선택합니다. 자극 곳은 투자 수익 (ROI)을 수정합니다. 사진 활성화 / 표백 모듈을 선택, 각 박스를 선택하여 488 nm의 레이저를 활성화하고 80 % (목적에서 측정 한 mW의 레이저 파워)로 488 nm의 레이저를 설정합니다. 0.5 초 / 프레임의 스캔 속도를 설정합니다. </li><li> 광 변환 유틸리티 (ND 자극)을 열고 광 설정을 지정합니다. <ol><li> 광 프로토콜을 지정하려면 &quot;추가&quot;명령을 클릭합니다. </li><li> &quot;취득 / 자극&quot;메뉴의 &quot;취득&quot;에서 &quot;단계&quot;한 설정과 이미지의 개수는 &quot;루프&quot;메뉴의 광 전에 취득 할 나타냅니다. </li><li> 세인트 &quot;로 설정&quot;단계 &quot;2imulation &quot;자극 이벤트의 수를 입력을 수행한다. </li><li> 조정 &quot;단계&quot;3 &quot;상&quot;1 선택적으로 기술 한 바와 같이, 이미지 수집의 마지막 라운드 전에 대기하는 시간을 입력하여 &quot;상&quot;이 후 대기 &quot;단계&quot;를 삽입합니다. </li><li> 모든 매개 변수가 설정되면, 자극 설정을 적용하고 광을 실행합니다. 레이저 전원 다를 수 있습니다 광 각 라운드에 대한 검사 및 반복 수의 주파수 및 배아로 배아 다릅니다 있습니다. 설정은 표 1에 나타내었다 시작합니다. </li></ol></li><li> 488 내지 561 nm이고, 상기와 같이 설정을 적용 640 nm의 레이저를 이용하여 마지막 Z 스택 획득. (mW의 4.5까지) 고 레이저 전력을 사용하여 변환 PSmOrange 시각화 640 nm의 레이저를 설정한다. </li></ol> LMA 5. 마운트 해제 배아 <ol><li> 현미경에서 챔버를 포함하는 배아를 제거합니다. 조심스럽게 아가로 오스 유에서 배아를 제거집게를 노래. </li><li> 새로운 멸균 플라스틱 페트리 접시로 또는 1 배 E3 0.2 mM의 PTU를 포함하는 멸균 6 웰 플레이트에 배아를 전송합니다. 개발의 원하는 단계까지 28 ° C에서 배아를 품어. </li></ol> 6. Photoconverted PSmOrange 단백질 발현하는 세포의 운명을 분석 <ol><li> 점 3.3 3.4에 기재된 바와 같이 배아를 다시 삽입. </li><li> 공 초점 현미경으로 시료를 놓고 관심 (488 ㎚)의 GFP 유전자 변형 구조 photoconverted 세포 (640 나노 미터)을 식별하기 위해 표본을 검사합니다. </li><li> 488 nm의, 561 nm의 연속 모드 (라인 모드 1&gt; 4)에서 640 nm의 레이저를 사용하여 관심의 구조를 다루는 Z 스택 획득. 1.0 및 2.0 μm의 사이의 Z-단계를 수정합니다. 라인 평균 주사 주파수는 화상 품질을 최적화하기 위해 사용될 수있다. </li><li> 어느 공동 특급 GFP와 photoconverted 단백질을 세포를 식별하기 위해 다음 방법 중 하나를 사용하십시오. <ol><li> 사용자 정의 만든 자동 피지 이미지J 매크로 3 <ol><li> 에서 Convolve &quot;GaussianBlur&quot;플러그인을 사용하여 원래 스택 (→ 과정 → GaussianBlur → 필터) 및 &quot;이미지 계산기&quot;플러그인 (→ 프로세스 → 이미지 계산기)를 사용하여 원래의 부드러운 스택을 뺍니다. 관심있는 구조를 시각화하고 분석 연산 시간을 줄이기 위해이 공정을 사용한다. </li><li> photoconverted 세포를 강조하기 위해 녹색과 원적외선 채널에 특정 임계 값을 적용 (→ 이미지 → → 임계 값을 조정합니다). 적절한 설정으로 임계 영역을 검출하기 위해 &quot;입자를 분석&quot;도구를 사용하여 (→ 입자를 분석 → 분석). </li><li> &quot;이미지 계산기&quot;플러그인을 열고 노란색 (→ 프로세스 → 이미지 계산기)에 녹색과 원적외선 채널의 중복의 ROI를 표시됩니다. </li></ol></li><li> 3D 데이터 평가 현미경 이미징 소프트웨어 <ol><li> 의 스택을 표시(3D 시각화 메뉴 →보기 볼륨보기 →) 쇼 볼륨보기 옵션을 사용하여 3D. , 녹색, 빨간색과 원적외선 채널을 선택 밝기와 대비를 조정하고 photoconverted 영역 (그림 1)을 강조 3D 스택을자를 그래픽 인터페이스를 사용합니다. 참고 : 데이터가 이미지 분석을위한 일반적인 대부분의 소프트웨어에서 사용할 수있는 분석 비슷한 방법. </li></ol></li></ol></li></ol>

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P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+conversion+of+eGFP-+into+Gal4-transgenic+lines+in+zebrafish.">CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish.</a> Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).</li><li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Research. 24, 142-153 (2014).</li><li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy.">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

형광 기자를 운반하는 형질 전환 배아는 배아 발달을 이해하는 것이 근본적으로 도왔다. 그러나, 특정 구조의 특정 시각화를 용이하게하기위한 촉진제 중요한 필요성은 여전히​​ 존재한다. 자신의 부재에서 연구자들은 관심의 그 구조의 기원과 발전에 대해 알고 형광 단백질의 광과 같은 기술에 의존하고 있습니다. 이것은 차례로 개발에 관련된 분자 메커니즘을 식별하는 중요한 조건이다. 제브라 피쉬 분야의 기술 진보는 지금 접근 14,15에 CRISPR-Cas9 매개 노크를 사용하여 예를 들어와 유전자 변형 라인, photoconvertible 단백질의 FP를 교체 할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 비교적 시간 소모적 항상 성공적이지. 대조적으로, 보편적으로의 응용 프로그램이 GFP에 H2B-PSmOrange 및 가능한 다른 유전자 변형 배경 표현은 그들을 통해 세포를 수행하는 직선 앞으로 기술이다bryonic 개발. 예를 들어, 제브라 피쉬 복부 habenulae의 기원, 척추 동물의 등 간뇌의 보존 신경 전도 시스템의 한 부분은, 최근에 따라서 개발의 기초가 어떤 유전 폭포가 발견되지 않을 때까지 애매하고있다. 마이그레이션 세포를 따라 PSmOrange 시스템과 장기적인 시간 경과 분석을 사용하여, 우리는 왼쪽과 골단에 바로 인접 유래 등의 habenular 핵 달리, 복부 habenular 뉴런은 시상 (3)에이 지역에 후방을 개발하는 것을 보여 수 있습니다. 이 지식은 우리가 다음 복부 habenular 뉴런 개발을위한 다운 스트림 유전자 Tcf7l2 신호 표준의 Wnt의 중요한 기능을 식별 할 수 있었다. photoconvertible PSmOrange 시스템의 애플리케이션은 빠르고 간단하며 배아 조명 전에 강한 단백질 발현을 위해 선택 될 수 photoactivati​​ble 단백질상에서 장점을 갖는다. 합성 MR을H2B-NA PSmOrange위한 인코딩은 보편적으로 모든 핵의 오렌지 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 배아 GFP 주입된다. 우리는 주입시 어떤 부작용이 발생하지 않은 단백질은 적어도 96 시간 동안 안정하다. 단백질은 488 nm의 여기 용 레이저를 이용하여 ROI의 GFP 형질 전환 세포 photoconverted되고 배아 이후 약 48 시간 이내에 세포를 포함하는 지금까지 적색 형광 단백질을 분석 할 수있다. 이 조건이 배아의 발달 단계와 대상 조직에 따라 달라질 수있는 성공적인 광을 모니터링하는 것이 중요합니다. 현미경 이미징 소프트웨어 전과 후에 광 (적색 및 원거리 적색, 녹색) 각 채널의 화상을 취득한다. 광 변환 효율은 광 전과 후 다른 채널 사이의 ROI의 평균 형광 강도를 측정 평가할 수있다. 더 원적외선 형광 광 등록 직후에 검출되지 않으면광 ditional의 발사가 적용되어야한다. GFP 표백은 광 변환 후 일반적이다. 그러나, 형광 단백질 유전자의 연속적인 번역이 약 2 시간 내에이 문제를 극복한다. 피지 ImageJ에 대한 사용자 정의 만든 매크로 셀 photoconverted 단백질을 공동 발현과 유전자 변형 GFP 3 사용할 수의 식별을 용이하게합니다. 또한이 절차를 단순화 H2B-PSmOrange을 표현 안정적인 유전자 변형 라인의 미래 설립. 또한 조직 재생과 같은 분야를 연구하는 흥미로운 값을 가질 수 있습니다 사일 게시물 수정 후 발달 이벤트의 분석을 용이하게합니다. 또한, 모체 표현 PSmOrange의 형질 전환 및 시간 경과 영상 (16)의 조합은 단일 세포 수준에서 낭 배기 전에 시작 셀 철새 사건을 조사하기위한 강력한 도구가 될 것입니다. 또한 애플리케이션은 F와 H2B 핵 태그의 교환을 포함 할 수있다또는 인스턴스, GAP43는 개발 배아에서 세포막과 잠재적으로 축삭을 시각화합니다. 이 기술의 한 가지 제한은 단백질 접합체만을 낭배 후 발현되기 시작하므로 낭배 프로세스의 분석에 적용될 수 없다는 것이다. 그것은 또한 배아 깊은있는 세포 단백질 photoconvert 오히려 어려운 것으로 생각되어야한다. 광 설정이 높은 레이저 파워 세심한 모니터링을 필요로 조직 손상을 초래할 수 광 필요한 자극 비교적 긴 시간으로서 채택되어야한다.

Exponentially improving imaging techniques allow following developmental processes over time periods of up to about four consecutive days3. In zebrafish and many other animal model systems, specific cells, tissues, axonal or vascular structures are marked by transgenic green or sometimes red or yellow fluorescent proteins to facilitate visualization. However, in most transgenic lines the transgene is not specifically expressed in the cells of interest but also additional structures, which hinders the precise tracking of for instance single cells or groups of cells.
Fluorescent photoconvertible proteins are well suited for cell tracking during embryonic development. The prerequisites for the application of such proteins are a long-lived nature, a well-separated emission range upon conversion and bright fluorescence. Available photoconvertible proteins comprise those that change their emission range upon conversion such as Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 or Dendra27 and others which are only fluorescent when photoactivated (PAmCherry8, PAGFP9 or PATagRFP10). Their applications to track cells in existing FP-transgenic animals are however limited as they often involve a green fluorescent state or do not fulfill all of the above criteria. Only recently, Subach and colleagues reported the PSmOrange protein, which changes its emission from orange/red to far red upon photoconversion and was successfully applied in cells in culture and cultured cells injected into mice2.
To investigate the protein's suitability for cell tracking in a living embryo, we generated an expression construct for the microinjection of nuclear-tagged H2B-PSmOrange into zebrafish embryos. We find that the protein fulfills all prerequisites for successful cell tracking in GFP transgenic backgrounds during the first 4 (and possibly more) days of zebrafish embryonic development. During this time, most of the cell migratory events are completed in fish making the PSmOrange system an excellent addition to the zebrafish toolkit.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="821">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:303px;">PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:233px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy MiniElute Cleanup kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic Pasteur</td>
			<td>alpha laboratories</td>
			<td>LW4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Original H2B-PSmOrange Plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>31920</td>
			<td>The plasmid described in the paper is available in the Carl lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FemtoJet Microinjector</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5247 000.013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps (5 Inox)</td>
			<td>NeoLab</td>
			<td>2-1633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System&#160;</td>
			<td>Nunc</td>
			<td align="right">155382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon A1R+</td>
			<td>Nikon GmbH Germany</td>
			<td>No Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon PLAN Apo &#955; 20x air objective&#160;</td>
			<td>Nikon GmbH Germany</td>
			<td>No Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)</td>
			<td>Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging</td>
			<td>No Number</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking cells in gfp-transgenic zebrafish using the photoconvertible psmorange system

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

도 1은 PSmOrange 광 변환 시스템의 일례를 도시한다. 뇌의 복잡한은 척추 동물의 등쪽 간뇌의 보존 구조입니다. 많은 다른 척추 동물에서와 마찬가지로,이 단지는 간뇌 왼쪽 양면 parapineal 세포의 중앙에 뇌의 기관으로 구성되어 있습니다. 우아한하지만 시간이 많이 소요되는 uncaging 실험은 parapineal 세포가 뇌의 기관 (13)의 앞쪽 부분에 발생한 것으로 나타났다. TG에서 (foxD3 : GFP); TG (FLH : GFP) 유전자 변형 배아는, 뇌의 및 parapineal 모두 세포를 개발하는 동안 표시되어 있습니다. PSmOrange 시스템의 적합성을 평가하기 위해, 우리는보고 된 솔방울 복잡한 현상 재현이 배아를 사용 하였다. PSmOrange, H2B-PSmOrange의 핵 형태를 인코딩 260 페이지의 mRNA의 모든 세포의 핵에서 단백질을 발현 한 세포 단계 이중 유전자 변형 배아에 주입 하였다. 주입 된 배아는 24 시간 후 fertilizat 때까지 28 ° C에서 배양 하였다이온 (HPF), GFP 강한 H2B-PSmOrange 식으로 선택하고 아래 지향 등의면 챔버 커버 슬립 시스템에서 LMA에 포함. 시편은 현미경 이미징 소프트웨어에 의해 제어되는 488 내지 561 nm 내지 640 nm의 레이저 광과 추적을위한 공기 20X 대물 구비 반전 공 초점 레이저 주사 현미경으로 배치 하였다. 송과선의 앞쪽 부분에 두 개의 세포 클러스터는 photoconverted 즉시 (그림 1A - F) 몇 군데 있었다. photoconverted 세포는 640 nm의 레이저 (까지 적색 -도 1C)을 이용하여 가시화 할 수 있지만 561 나노 레이저 (적색 / 주황색 -도 1b). 이들 세포에서 GFP 발현이 초기 인해 (도 1A, 1D, 1F)를 photobleaching에 감소되었다. 52 HPF에서 GFP 및 H2B-PSmOrange이 photoconverted H2B-PSmOrange 단백질 발현하는 세포에서 발견되었다 (그림 </strong&gt; 1A &#39;- F&#39;). 실제로, 이들 세포의 몇 가지 뇌의 왼쪽 parapineal 형성 (도 1a에 화살표 머리 &#39;- F&#39;). 이 결과 parapineal 세포 기원 이전보고와 일치하고 살아있는 척추 배아 PSmOrange 기술의 적용을 도시한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53604/53604fig1.jpg" /> . 제브라 피쉬 배아 생활에 PSmOrange 광 변환 시스템을 사용하여 parapineal 세포의 출처를 식별 그림 1. (A - F &#39;) TG의 등 간뇌에 초점을 맞춘 가기 앞쪽과 등쪽 조회수 (foxD3 : GFP); TG (FLH : GFP) 유전자 변형 배아에서 뇌의 (P)과 parapineal 세포 (PP) 강조 (A를 - F) 26 HPF 직후 광 및 (A &#39;- F &amp; #<html> 39) 26 시간 후 52 HPF에서. 배아는 mRNA를-H2B PSmOrange 인코딩을 주입 하였다. 사진 표시 3D 재구성. (A, A &#39;) 형질 전환 GFP (B, B&#39;)의 발현되지 광 (원적외선 채널) 후 H2B-PSmOrange (적색 채널) 및 (C, C &#39;)를 변환. 흰색 점선 원은 레드 / 오렌지 형광없는 것입니다 광의 영역을 강조 표시합니다. (D, D &#39;) 세 채널의 병합 (녹색, 원적외선, 적색), (E, E&#39;) 빨간색과 원적외선 채널 (F, F &#39;) 녹색과 원적외선 채널. (A&#39;-F &#39;) 화이트 화살촉은 그린, 오렌지 / 빨간색과 멀리 붉은 형광을 보여 parapineal 세포의 위치를​​ 강조 표시합니다. (AF &#39;) 스케일 바는 각 이미지의 오른쪽 하단 모서리에 표시됩니다.PLOAD / 53604 / 53604fig1large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 단계 </td><td> 루프의 수 </td><td> 활성 레이저 </td></tr><tr><td> 취득 방식 </td><td> 1주기 </td><td> 488 nm의, 561 nm의, 640 nm의 </td></tr><tr><td> 자극 </td><td> 15~30 회 </td><td> 488 nm의 </td></tr><tr><td> 성숙 </td><td> 1 분 </td><td> # </td></tr><tr><td> 취득 방식 </td><td> 1주기 </td><td> 488 nm의, 561 nm의, 640 nm의 </td></tr></tbody></table> 표 1 : H2B-PSmOrange의 광 조건.

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Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Photoconvertible PSmOrange 시스템을 사용하여 GFP 유전자 변형 Zebrafish의 세포를 추적

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

tracking-cells-gfp-transgenic-zebrafish-using-photoconvertible

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.5K 조회수.  Heidelberg University. We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

비디오: Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

애벌레 Zebrafish의 피부에 유도 GAL4 / UAS 식 시스템을 사용하여 선천성 면역과 종양 전 세포 상호 작용의 라이브 영상

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

연구

발생학

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

트랜스포존 시스템을 사용하여 마우스 양수 세포로부터 다 능성 줄기 세포의 제조

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

내피 콜로니 형성 세포및 중간엽 줄기 세포에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 이용한 3차원 혈관신생 분석 시스템

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, proliferation, and differentiation. Time-lapse imagining offers unique insight to the behavior of cells during eye development because it allows us to visualize oculogenesis in vivo. Zebrafish are an excellent model to visualize this process due to their highly conserved vertebrate eye and their ability to develop rapidly and externally while remaining optically transparent. Time-lapse imaging studies of zebrafish eye development are greatly facilitated by use of the transgenic zebrafish line Tg(rx3:GFP). In the developing forebrain, rx3:GFP expression marks the cells of the single eye field, and GFP continues to be expressed as the eye field evaginates to form an optic vesicle, which then invaginates to form an optic cup. High resolution time lapse imaging of rx3:GFP expression, therefore, allows us to track the eye primordium through time as it develops into the retina. Lightsheet microscopy is an ideal method to image ocular morphogenesis over time due to its ability to penetrate thicker samples for fluorescent imaging, minimize photobleaching and phototoxicity, and image at a high speed. Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software. The resulting dataset can provide valuable insights into the process of ocular morphogenesis, as well as perturbations to this process as a result of genetic mutation, exposure to pharmacological agents, or other experimental manipulations.

Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software.&#160;

rx3:GFP 형질전환 제브라피쉬를 이용한 라이트시트 현미경으로 안구 형태생성 시각화

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, ...