이 연구는 교부 금에서 국가 연구 재단의 한국 (NRF) (MSIP; 보조금 번호 2016R1A2B4008199 Y-m 한국 정부에 의해 자금에 의해 지원 되었다. H.)와 사역의 건강 및 복지, 한국 (번호 부여: HI14C1324).

모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 연 세 대학의과 대학교의 지침에 따라 실시 했다. LysM-녹색 형광 단백질 (GFP; gfp / +) 마우스8 및 CX3Cr1 GFP (gfp / +) 나이의 8 ~ 12 주에9 마우스 intravital 이미징 사용 되었다. 모든 수술 도구 압력가 마로 소독 하 고 70% 알코올로 소독 했다.
1. 맞춤형 마우스 간 이미징 지원 도구와 챔버
<ol><li>마우스 간 이미징 챔버 디자인<ol>
<li>마우스 간 (그림 1) 이미징에 대 한 다음과 같은 크기의 방 만들기: 내부 챔버 (120 m m 길이 × 폭 160 m m × 30 m m 높이), 외부 챔버 (100 m m 길이 × 폭 100 m m × 24 m m 높이), 볼트 (Ф 높이 3 m m × 30 m m), 너트 (Ф 4 m m) 그리고 날개 모양의 너트 (Ф 4 m m).</li>
		<li>실리콘의 120 g의 총 수 있도록 경화 에이전트 및 1:9 비율에 탄성 중합체를 측정 합니다.</li>
		<li>250 mL 삼각 플라스 크에에서 액체 실리콘 혼합물을 넣고 잘 섞는다. 다음은 desiccator에 플라스 크를 넣어 고 펌프를 통해 진공에서 약 1 시간에 대 한 기포를 제거 합니다.</li>
		<li>높이 10 m m로 높은 맞춤형 마우스 챔버에 액체 실리콘 믹스를 부 어 하 고 며칠 (그림 1A)에 대 한 치료.</li>
	</ol>
</li>
	<li>표지 슬라이드와 침대 고정 간의 준비<ol>
<li>금속 프레임에서 실리콘 접착제를 사용 하 여 덮개 유리를 첨부 합니다. 1 일 (그림 1B)에 대 한 건조 하자.</li>
		<li>효과적으로 물 침수 렌즈에 대 한 증류수 보전, 반영구적 물 차단 구조는 필수적 이다. 1 m m 실리콘 접착제를 반올림 하 고 밤새 그것을 강화.</li>
		<li>경화 에이전트 및 기본 고무를 혼합 하 고에 부 어 그것은 높이 약 8-10 m m. 수행 6 잘 플레이트 강화 과정 1.1.2-1.1.4에 설명 된 대로.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. LPS의 준비
<ol><li>살 균 1 × 인산 염 버퍼 식 염 수 희석 살 모 넬 라 enterica serotype enteritidis에서 LPS 분말 (PBS)를 준비 합니다. (1 × PBS: 137 m m NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나2HPO4, 1.8 m m KH2포4).</li>
	<li>미리 37 ° C에 물 목욕에 PBS가 열 하 고 신중 하 게 LPS 분말 병 (25 mg)를 엽니다.</li>
	<li>피펫으로 원조를 사용 하 여, LPS 분말 병에 무 균 PBS (5 mL)을 부 어 부드럽게 저 어 하거나 재고 솔루션을 준비 하는 솔루션을 일시 중단 합니다. 참고: LPS 분말 액 화 후 가혹한 vortexing 거품을 일으킬 수 있습니다. 1.5 mL 튜브에 aliquots를 만들 때 손실을 최소화 하기 위해 거품을 만드는 하지 마십시오.</li>
	<li>−20 ° C, 재고 LPS 솔루션을 저장 하 고 주입을 위해 1 mg/mL LPS 솔루션으로 그것을 희석.</li>
	<li>1 mL 주사기를 사용 하 여 비 취 마우스의 복 막에 1 mg/mL LPS 솔루션 (20 mg/kg)를 삽입할. 제어 동물에 대 한 PBS의 동일한 볼륨을 주입.</li>
	<li>충분 한 염증 반응에 대 한 2 시간을 기다립니다.</li>
</ol>3. 혈관 얼룩 텍사스 레드 Dextran의 준비
<ol><li>두 개의 15 mL 원뿔 튜브 및 살 균 PBS의 10 mL를 준비 합니다.</li>
	<li>텍사스 레드 Dextran 분말 (25 밀리 그램) 3 ml PBS의 묽 게 하십시오와 잘 섞는다. 빈 15 mL 원뿔 튜브에 혼합물을 전송.</li>
	<li>Dextran 혼합물 (3 mL)를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 남아 있는 PBS (7 mL)를 전송 합니다.</li>
	<li>10 mL 주사기의 끝에 0.45 μ m 주사기 필터를 연결 합니다. 필터 주사기는 바늘을 교체 해야 합니다.</li>
	<li>Dextran 혼합물 (10 mL) 필터링. 흘리 고 피하기 위해 주사기를 균등 하 게 누르십시오.</li>
	<li>빛 차단 1.5 mL 튜브에 2.5 mg/mL dextran 솔루션의 500 µ L를 분배 하 고 −20 ° c.에 그것을 저장합니다 일단 해 동, 4 ° c.에 그것을 저장합니다</li>
</ol>4. 수술 과정
<ol><li>치료 수술 테이블 및 수술 하기 전에 70% 알코올을 사용 하 여 모든 악기. 다음, 간 수술 도구를 설정 하 고 (그림 2A, B) 37 ° C에 난방 격판덮개를 조정 합니다.</li>
	<li>마 취에 대 한 intraperitoneally에 30 mg/kg tiletamine/zolazepam와 xylazine의 10 mg/kg는 쥐 주사. 이러한 솔루션은 혼합 고 동시 주입에 대 한 PBS에 희석 수 있습니다. 마우스의 발가락을 부드럽게 눌러 anesthetization를 확인 합니다.  아니 반사 때 다음 단계를 진행 합니다.</li>
	<li>마우스의 망막의 건조를 방지 하기 위해 눈 연 고의 작은 금액을 적용 합니다.</li>
	<li>제 모 크림 (그림 2C)를 사용 하 여 복 부 주변 몸 머리를 제거 합니다.</li>
	<li>꼬리 정 맥 또는 인슐린 주사기 (그림 2D)를 사용 하 여 역 궤도 주입을 통해 텍사스 레드 Dextran 솔루션 (2.5 mg/mL의 농도)의 200 µ L을 주입.</li>
	<li>표시와 함께 바로 subcostal 영역을 표시 합니다. 라인은 갈비뼈의 끝에 칼 과정에서 그려야 한다. 집게와가 위 (그림 2E, F) 표 피를 잘라.</li>
	<li>마이크로-가 위, 집게를 사용 하 여 복 부 구멍 열고 간 신중 하 게 노출 합니다. 왼쪽된 측면 엽 면봉 (그림 2G, H)를 사용 하 여 밖으로 굴러 될 해야 합니다.</li>
	<li>간 건조를 방지 하기 위해 복 부 구멍에 살 균 PBS의 500 µ L를 붓는 다.</li>
	<li>사용자 정의 설계 실에서 오른쪽 decubitus 위치에 마우스를 놓고 실리콘 침대에 조직 접착제의 작은 금액을 적용 합니다. 그럼, 신중 하 게 간 면봉 (그림 2I)를 사용 하 여 연결 합니다. 참고: 간 조직 매우 어렵다면 있기 때문에, 기계적으로 당기지 마십시오 간 밖으로. 부드럽게 롤 그것 밖으로 면봉으로.</li>
	<li>몇 초 후, 젖은 간 밖으로 건조 하지 않도록 하는 살 균 PBS의 500 µ L로 다시 간. 간장에 금속 프레임을 놓고 너트 (그림 2J)와 그것을 단단히 고정 합니다.</li>
</ol>5. intravital 영상 2 광자 현미경으로 간
<ol><li>880 nm, 그리고 녹색, 세트에 선 소프트웨어 (Carl Zeiss) 레이저에 설정, 파장을 설정 실행 및 빨간색 채널. 레이저 파워 형광 강도 (그림 3A)에 따라 조정 합니다. 배기 필터 정보는 다음과 같습니다: 그린/Alexa488, 500-550 nm와 적색/알 렉 사 555, 575-610 nm.</li>
	<li>이미징 단계에 챔버를 놓고 물 침수 렌즈 커버 유리에 가까운 X 20를 배치 합니다.</li>
	<li>실리콘 고무 히터의 온도 (그림 3B)를 유지 하기 위해 마우스 몸 아래의 수정.</li>
	<li>금속 프레임에 증류수 500 µ L를 삭제 하 고 (그림 3C) 간 가까운 대물 렌즈를 당겨.</li>
	<li>초점을 조정 하 고 깊이 이미지 영역의 시간 확인.</li>
	<li>행위 이미지입니다.</li>
	<li>장기적인 이미징, 이미징 동안 각 시간 tiletamine/zolazepam 및 xylazine 혼합물의 절반 복용량 주입. 이 단계 동안 37 ° C에서 쥐의 체온을 유지 필수적 이다. 항상 계속 눈에 마우스, 모든 마우스에서 anesthetization 시간 차이가 있기 때문. 참고:이 방법은 아니다 복구에 대 한 적절 한 수술 및 이미징 후. 우리는 윤리적으로 수술 후 즉시 마우스를 희생.</li>
	<li>안정적인 anesthetization에 대 일 분 마다 페달 반사를 확인 하십시오.</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>데이터 분석 소프트웨어 Volocity를 연 다음 소프트웨어 라이브러리에서 원시 데이터를 가져올 합니다.</li>
	<li>상황에 맞게 하 고 스냅숏을 이미지에서 노이즈를 제거 합니다. 참고: 부드러운 이미지를 얻기 위해 '벌금' 또는 '중간' 필터를 사용 합니다. 또한, '콘트라스트 향상' 기능을 사용 하 여 어둡거나 흐린 이미지를 선명 하 게.</li>
	<li>스냅숏 이미지를 JPEG 또는 TIFF 파일 및 AVI 파일 영화에 대 한 수출을 100% 편집된 항목에 맞게.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Girard, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fuels,+hormones,+and+liver+metabolism+at+term+and+during+the+early+postnatal+period+in+the+rat.">Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat.</a> J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).</li><li>Marques, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+liver+biology+in+vivo+using+conventional+confocal+microscopy.">Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy.</a> Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).</li><li>Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy+Imaging+of+the+Liver+following+Leishmania+Infection:+An+Assessment+of+Hepatic+Hemodynamics.">Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics.</a> J Vis Exp. (101), e52303 (2015).</li><li>Honda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+neutrophil+recruitment+in+hepatic+ischemia-reperfusion+injury+in+mice.">Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice.</a> Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).</li><li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation.">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis.">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).</li><li>Sierro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Liver+Capsular+Network+of+Monocyte-Derived+Macrophages+Restricts+Hepatic+Dissemination+of+Intraperitoneal+Bacteria+by+Neutrophil+Recruitment.">A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment.</a> Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).</li><li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages.">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li><li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice.">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li></ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

간은 많은 그룹3,10, 그것의 기능의 중요성 때문에 의해 적극적으로 연구 되었습니다. 예를 들어, Heymann 외. agarose를 사용 하 여 섬세 한 방법을 제안 했다. 이 메서드는 매우 정확 하 게 발견 되었다, agarose 설정 시간이 걸립니다. 그러나, 우리의 방법론으로 모든 절차 수 실행 될 다른 혼동 요인을 최소화 하는 30 분 이내. 하트 비트 비디오를 방해 할 수 있기 때문에 둘째, 간 안정화 매우 중요 하다. 이 현상 제거, 우리는 오른쪽 decubitus 위치에 쥐를 재배치.
이 프로토콜에서 다른 중요 한 단계 생산의 금속 커버 프레임 및 금속 막대에 위치 했다. 우리가 직면 하는 가장 중요 한 장애물 간 고정 압력의 적절 한 금액을 사용 하 여 따라 간의 friability를 극복 하는 방법을 결정 했다. 처음에 때만 나비 너트 커버 슬라이드를 적용, 혈액 순환 장애가 되었다 고 간 커버 슬라이드의 무게를 견딜 수 없었다. 대신, 우리는 롤 바에 따라 표지 슬라이드를 배치 하기 전에 볼트 다운 하는 방법을 고안 했다. 커버 슬라이드 볼트에 의해 지원 되었다, 이후 그것은 일부 공간 간 두께 대 한 본인, 않았다 하지 눌러 열심히 간으로 주었고 아직 고정 하 고 균형을 유지. LysM-GFP 마우스6을 사용 하 여, 우리는이 디자인 사인 및 중앙 정 맥에서 호 중구의 시각화 수 확인 했다. CX3Cr1-GFP 마우스5 LCMs LCMs를 관찰 하기 위해이 모델에도 사용 했다 간 표면에 자주 발견 됐다.
간 받침대 또는 실리콘 침대의 높이 또한 필수적 이었다. 너무 높은 경우에, 혈액 순환에에서 중단 될 것 이다. 간 받침대의 높이가 너무 낮은 때, 간 안정적인 고정을 유지 하기 어려웠다. 모든 마우스 다른 신체 크기 때문에, 우리는 실리콘 침대 6 잘 플레이트, 세포 배양에 사용 되는 유사한를 사용 하 여 서로 다른 높이 가진 제작. 이 방법에서는, 각 마우스의 크기에 따라 챔버를 사용자 지정할 수 있었습니다. 요약 하자면, 우리 소설과의 형태를 조사 하기 위하여 마우스 간 intravital 이미징 및 염증 성 조건에 면역 세포의 운동에 대 한 간단한 프로토콜을 설계 되었습니다.
이 새로운 프로토콜 간 급성 면역 반응을 관찰 하 고 싶은이 분야에 있는 연구원에 게 매우 도움이 될 수 있습니다. 그러나,이 방법은 연구원 조직 접착제로 간 고정 때문 6 h 보다 더 오랫동안 장기 이미징을 수행할 수 없습니다. 이 프로토콜은 한 번 유일한 방법, 그리고 따라서, 쥐 한다 즉시 희생 이미징 후. 간 실리콘 침대에서 분리 때 간 것 이다 결국 수 박탈 과도 한 출혈이 발생 하는 침대에서. 따라서, 다시 삽입 하 고 복 부 영역의 봉합 불가능 미래 관측을 위해.

간은 포유류; 주요 대사 기관 그것은 에너지, 호르몬, 및 해독1에 대 한 컨트롤 타워 역할을 합니다. 그 중요성으로 인해 연구팀은 염증 동안에 변화를 명료 하 많은 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험을 실시 했습니다. Intravital 현미경 검사 법은 간2 에서 라이브 이미지를 캡처하는 데 사용 되었습니다. 실제로, 다양 한 간 이미징 방법 되었습니다 도입2,,34,,56. 그러나, 더 단순화 된 외과 접근을 개발 하 고 대상 기관 및 면역 세포의 안정화를 달성, 우리는 intravital 이미징에 대 한 그들의 노력을 최소화 하기 위해 연구원 안내 하는 간단한 프로토콜을 설계 되었습니다.
이 연구에서 우리는 안정적이 고 새로운 이미징 챔버 및 출혈 및 가능한 감염을 최소화 하기 위해 사용 될 수 있는 수술 기법 도입. 우리는 간 이상 2 시간에 대 한 온전 하 게 남아 확인 했다. 이 방법으로, 우리는 성공적으로 LCMs7 및 부패 시키는 조건 하에서 호 중구의 형태학 식별. 이 방법에 대 한 응답에서에 면역 세포의 급성 반응을 관찰 하 사용 될 수 있기 때문에이 방법은 수술 중 떨림과 예기치 않은 염증 등 물리적 및 생물학적 혼동 요인 최소화, 기대 시 약 같은 LPS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1004">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Custom designed chamber</td>
			<td style="width:239px;">Live Cell Instruments</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;">Custom-designed size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Metal cover slide</td>
			<td style="width:239px;">Live Cell Instruments</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;">Custom-designed size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Cover glass</td>
			<td style="width:239px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:272px;">#72204-03</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sylgard 184 Silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:239px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Erlenmeyer flask</td>
			<td style="width:239px;">DURAN</td>
			<td style="width:272px;">21 216 36</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Cell culture plate (Flat type)</td>
			<td style="width:239px;">HYUNDAI Micro Co.</td>
			<td style="width:272px;">H31006</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Desiccator</td>
			<td style="width:239px;">ADARSH</td>
			<td style="width:272px;">55204</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">High Q BOND SE 5 mL</td>
			<td style="width:239px;">BJM LAB</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;">To make semi-permanent dam</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Flexible Silicone Rubber Heaters</td>
			<td style="width:239px;">Omega</td>
			<td style="width:272px;">SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DC power supply</td>
			<td style="width:239px;">Toyotech</td>
			<td style="width:272px;">DP30-03A</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;">Home-made</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:260px;">Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:272px;">L6011</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Texas Red Dextran</td>
			<td style="width:239px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:272px;">D1830</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:260px;">15 mL High-clarity polypropylene 
			conical tube</td>
			<td style="width:239px;">FALCON</td>
			<td style="width:272px;">14-959-49B</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:260px;">0.45 &#956;m filter (Minisart Syringe Filter)</td>
			<td style="width:239px;">Sartorius</td>
			<td style="width:272px;">16555k</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">1.5ml Micro Tube, Amber</td>
			<td style="width:239px;">Axygen</td>
			<td style="width:272px;">MCT-150-X</td>
			<td style="width:233px;">For light-blocking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:239px;">Korea Vaccine</td>
			<td style="width:272px;">KV-S01</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">3 mL syringe</td>
			<td style="width:239px;">Korea Vaccine</td>
			<td style="width:272px;">KV-S03</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">10 mL syringe</td>
			<td style="width:239px;">Korea Vaccine</td>
			<td style="width:272px;">KV-S10</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">0.3 mL insulin syringe</td>
			<td style="width:239px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:272px;">324900</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Hair removal cream 100 mL</td>
			<td style="width:239px;">Body natur</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Cotton swab</td>
			<td style="width:239px;">ABDI</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Zoletil 50 5 mL</td>
			<td style="width:239px;">Virbac</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Rompun 10 mL</td>
			<td style="width:239px;">Bayer</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Heating plate</td>
			<td style="width:239px;">Live Cell Instruments</td>
			<td style="width:272px;">PH-S-10</td>
			<td style="width:233px;">Custom-designed size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">DC controller</td>
			<td style="width:239px;">Live Cell Instruments</td>
			<td style="width:272px;">CU-301</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Microdessection Scissors</td>
			<td style="width:239px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:272px;">72-5418</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Scissors</td>
			<td style="width:239px;">Roboz</td>
			<td style="width:272px;">RS-5882</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Forceps</td>
			<td style="width:239px;">Roboz</td>
			<td style="width:272px;">RS-5137</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Vet bond</td>
			<td style="width:239px;">3M</td>
			<td style="width:272px;">1469SB</td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">ZEN software (Black Edition)</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;">Program for LSM 7 MP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">LSM 7 MP</td>
			<td style="width:239px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Volocity</td>
			<td style="width:239px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:272px;"></td>
			<td style="width:233px;">Analysis program</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon intravital imaging of leukocytes during the immune response in lipopolysaccharide-treated mouse liver

패 혈 증은 조직 기관 실패를 일으킬 수 있는 심각한 감염의 유형을 손상. 패 혈 증과 관련 된 사망률과 병 적 속도 매우 높은, 아니 직접 치료 이나 기관 관련 메커니즘을 실시간으로 자세히 검사 합니다. 간 독 소 및 인체에 감염을 관리 하는 핵심 기관 이다. 여기, 우리 면역 세포, 호 중구 등 간 capsular 세포 (LCMs)의 운동 성을 추적 endotoxemia의 유도 후 마우스 간 intravital 이미징 수행 목적입니다. 따라서, 우리는 최소 침 습 수술으로 간의 노출에 대 한 새로운 수술 방법 설계 되었습니다. 마우스 intraperitoneally lipopolysaccharide (LPS), 일반적인도로 주입 했다. 노출 및 LPS 처리 LysM-녹색 형광 단백질 (GFP)에 마우스 간, 우리는 그 neutrophil 발견 채용의 intravital 이미징에 대 한 우리의 새로운 외과 접근을 사용 하 여 마우스 간 그 인산 염 버퍼에 비해 증가 했다 염 분 처리 간입니다. LPS 치료 후, 호 중구 수 시간 크게 증가. 또한, 우리가 성공적으로 간 상주 대 식 세포 라는 LCMs 시각 CX3Cr1 GFP 마우스를 사용 하 여. 따라서, vivo에서면역 이동성 제어를 새로운 시 약의 효능을 조사, 운동 성 및 간에서 호 중구 및 LCMs의 형태 결정 수 기관 실패 및 조직 손상으로 인 한 치료 효과 확인 하 패 혈 증에 백혈구 활성화입니다.

간단 하 고 매우 안정적인 이미징 챔버 고안 되었다. 챔버의 하단 마우스 몸과 장기의 미 끄 러 방지 실리콘으로 덮여 있었다. 또한, 실리콘 탄성의 적절 한 금액을가지고, 때문에 그것은 커버 슬라이드 (그림 1A, C)의 압력에 의해 유도 된 예상된 피해를 막을 수 있습니다. 두 번째, 조직 안전한 접착제 (본드 수 의사)는 원 모양의 실리콘 침대에서 추출 된 간 해결 하기 위해 적용 되었습니다. 이 메서드는 하트 비트 또는 respirational 운동으로 인 한 떨림 방지를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 금속 커버 슬라이드 배치 되었고 볼트와 너트 쥐의 몸 크기와 튀어나온 간 (그림 1B-D)의 위치에 기반 하 여 고정. 마 취는 제대로 수행 되었다 때 이미징 설정과 6 h 보다 더 이상 마지막 수 있습니다.
시작 하기 전에 수술, 쥐의 체온은 37 ° C (그림 2A)을 미리 설정 된 난방 약 실에는 동물을 배치 하 여 통제 되었다. 다음, 2 차 감염을 방지 하기 위해 마우스 수술 및 이미징에 대 한 모든 필요한 도구 70% 알코올로 소독 하거나 (그림 2B) 2 차 감염을 방지 하기 위해 압력가 했다. 제 모 크림 (그림 2C)와 복 부 지역에서 특히, 마우스 체 모 제거 되었습니다. 절 개를 하기 전에 피부 povidone 요오드 살 균 되었다. 혈액 흐름은 정 맥 주입 (그림 2D) 통해 텍사스 레드 Dextran와 이라는. 칼 프로세스에서 시작 하 고 오른쪽 갈비뼈 끝난 줄 그려 했다. 이 바로 subcostal 절 개 라인 출혈을 최소화 하는 데 도움이. 메스와 마이크로-가 위, 해 부 시작 되었다; 복 부는 복 부 구멍 (그림 2E, F)에서 내장의 퇴 학을 피하기 위해 너무 많이 열리지 않습니다. 마이크로 해 부가 위, 집게와 지방 및 조직 계층 제거 및 절 개 지역 PBS 면 멸 균된 면봉 (그림 2G)와 청소 했다. 왼쪽된 측면 엽, 4 개의 간 엽의 가장 큰 면봉으로 밖으로 촬영 되었고 조직 본드 (수 의사 본드)를 사용 하 여 실리콘 침대에 부착 된. 간 조직 했다 매우 어렵다면, 간 면봉 (그림 2 H, I)를 사용 하 여 밖으로 이동 되었다. 금속 커버 유리를 적용 한 후 간 영상에 복종 되었다. 건조를 방지 하기 위해, 소독된 PBS 간, 커버 유리 (그림 2J) 사이의 공간에 적용 되었습니다. 커버 유리의 높이 필요할 때 너트로 조정 되었다.
두 광자 현미경 X, Y, 장착 했다 하 고 Z 축 마이크로미터 컨트롤러 블랙 커튼 (그림 3A)와 차폐. 레이저는 안정적으로 모드에 선 소프트웨어 잠겨 했다. 안정적인 영상 취득 대상 기관의 표류를 방지 되어야 한다. 따라서, 이미징 챔버와 수술 방법, 전자 난방 패드의 전선 되었고 이미징 단계에서 보안 스티커 테이프 (그림 3B)에 의해 잘 조직. 마지막으로, 충분 한 양의 증류수 물 침수 렌즈 (그림 3C)에 대 한 커버 유리의 상단에 추가 되었습니다.
혈액의 흐름은 명확 하 게 텍사스 레드 Dextran의 정 맥 주입 후 화면에 표시 됩니다. 레드와 그린 모두를 동시에 캡처하기 위해 수행 하는 이미징 880의 파장으로 nm. Intravital 이미징 분석에 따라 호 중구의 적절 한 수 항상 PBS 상태에서 혈액을 순환 했다. 반면에, LPS에서 호 중구 수가 치료 쥐 크게 증가 되었다. 호 중구의 많은 혈 류 안으로 회람 했다 그러나 그들은 염증 성 조건에서 선박 외부 마이그레이션되지 않은 note. (그림 4A, 보충 영화 1). LPS 처리 생쥐에서 호 중구 (그림 4A, 보충 영화 1) 그릇에 호 중구의 더 자주 검색을 만든 선박의 luminal 표면에 더 확고 하 게 준수 했다 됩니다. 호 중구의 운동 성, 떨어져 CX3Cr1 GFP 마우스에 LCMs는 간 조직 보다 깊이 (그림 4B) 조직 내에서 표면에 관찰 되었다. LCMs는 LPS 처리 마우스에도에 작은 운동 또는 활성화를 보여주었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57191/57191fig1.jpg"> 그림 1 . 간 약 실 및 보조 도구의 디자인. (A) 사용자 정의 설계 마우스 챔버에 실리콘 혼합물을 붓는. (B) 금속 커버 슬라이드의 크기 (1 인치 = 25.4 m m, Ф = 직경). (C) 이미지 간 챔버 맞춤형 실리콘 탄성 중합체로 가득 플라스틱을 보여 줍니다. (D) 다른 부품 간 챔버를 사용 했다. 철의 고정 볼트와 너트 했다. 화살표에에서 표시 된 볼트와 너트, 각각, (C)와 (D). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57191/57191fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57191/57191fig2.jpg"> 그림 2 . 간 수술을 위한 외과 단계. (A) 금속 고 37 ° C에서 수술 전에 DC 온도 조절기는 번호판을가 열 하는 고무. (B) 전반적인 수술과 간 수술 (a. 목화 면봉과 컨테이너, b. 70% 알코올, c. 종이 직물, d. 면도기, e. 제 모 크림, f. 맞춤형 챔버, g. 외과 테이프, 헤 집에서 만든 간 받침대, i. 날개 견과류와 견과류, 제이 금속 커버에 대 한 지원 도구 슬라이드, k. 마이크로 해 부가 위, l. 집게, m.가 위, 명. 3 mL 주사기, o. 마커, p. 0.3 mL 인슐린 주사기, 질문 1 mL 주사기). 간 수술 (C-J)에 대 한 절차. 복 부 사이트에서 (C) 적용 헤어 제거 크림. (텍사스 레드 Dextran와 쥐의 하는 D) 역-궤도 주입 (E) 절 개 사이트 표시와 함께 표시. (F) 집게와가 위 표 피 절단. (G) 복 부 구멍으로 절 개를 만들기. (H) 왼쪽된 측면 엽 밖으로 부드럽게 당기. (I)는 엽 수 의사 본드를 사용 하 여 간 받침대 부착. (J)의 최종 이미지를 설정합니다. 너트 금속 커버 슬라이드에 고정 하 고 커버 슬라이드 나비 너트로 고정 되었다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57191/57191fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57191/57191fig3.jpg"> 그림 3 . 두 광자 현미경 및 이미징 단계 설정. (A) 두 광자 현미경 (LSM 7 MP)와 이미징 단계, x 및 y 방향으로 이동할 수 있는 볼 수 있습니다. (고무 패드를가 열 B)는 간 영상 실 테이프를 사용 하 여 마우스를 첨부 되었다. (C) 떨어지는 렌즈와 커버 유리 피 펫을 증류수. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57191/57191fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57191/57191fig4.jpg"> 그림 4 . 호 중구 및 라이브 쥐의 간에서 간 capsular 세포의 시각화. (A) 확장 LysM GFP 마우스의 간 호 중구의 초점 스냅. 컨트롤 이미지 PBS 취급 생쥐에서 했다. LPS 이미지는 LPS 처리 쥐에서. 이미지는 20 X를 사용 하 여 인수 했다 / 1.0 나 물 침수 렌즈 (시야 [FOV] 424.3 µ m × 424.3 µ m, 깊이 = 40 µ m, 분할 간격 = 1 µ m, 시간 간격을 = = 60 s, 주기 = 31). 눈금 막대 = 50 µ m. (B) 내부 및 표면 영역 스냅숏 LCMs의 CX3Cr1 GFP 마우스의 간. 이미지 20 × / 1.0 나 물 침수 렌즈를 사용 하 여 인수 했다 (FOV 424.3 µ m × 424.3 µ m, 깊이 = 40 µ m (내부) = 10 µ m (표면), 슬라이스 간격 1 µ m, 시간 간격 = = 60 s (내부) / 20 s (표면), 주기 = 31). 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57191/57191fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57191/57191mov1.jpg"> 보충 영화 1입니다. PBS의 비교는 LPS 처리 간 대 간 치료. 두 개의 서로 다른 조건에 분명 한 차이가 잘 관찰. LPS 치료에서 간, 호 중구 수가 크게 증가 하 고는 운동 성 감소. 두 조건에서 영화의 안정성 관찰 된다. 혈은 텍사스 레드 dextran으로 표시 됩니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57191/Movie_1.avi" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver at JoVE.com

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

우리는 최소한의 침공과 라이브 쥐 간 2 광자 영상에 대 한 새로운 수술 프로토콜을 설립. 이 기술을 우리 lipopolysaccharide 유도 endotoxemia 동안 간의 상세한 구조를 확인 할 수 있습니다. 우리는이 방법을 간 백혈구 이동에 다양 한 시 약 처리의 효과 결정 하기 위해 활용 될 수 있습니다 예상.

Lipopolysaccharide 취급 마우스 간에 면역 반응 동안 백혈구의 2 광자 Intravital 이미징

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

two-photon-intravital-imaging-leukocytes-during-immune-response

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.1K 조회수.  Yonsei University College of Medicine. 우리는 최소한의 침공과 라이브 쥐 간 2 광자 영상에 대 한 새로운 수술 프로토콜을 설립. 이 기술을 우리 lipopolysaccharide 유도 endotoxemia 동안 간의 상세한 구조를 확인 할 수 있습니다. 우리는이 방법을 간 백혈구 이동에 다양 한 시 약 처리의 효과 결정 하기 위해 활용 될 수 있습니다 예상.

비디오: Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

의 기생충 말벌에 대한 소개<em&gt; Drosophila</em&gt; 그리고 Antiparasite 면역 반응

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

연구

면역학 및 감염병학

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

면역 반응과 수면에서의 양적 측정<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

웨스트 나일 바이러스 돌연변이 균주의 감염에에서 MyD88 매개 세포 면역 반응의 생체 외 분석

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

다음 간 생체 내에 현미경 이미징<em&gt; 슈만 편모충</em&gt; 감염 : 간 혈류의 평가

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

CXCR6.Gfp 기자 마우스를 사용하여 건강하고 병에 걸린 간에서 면역 세포의 장기 생체 내에 다중 광자 현미경 이미징

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

의 Zebrafish의 애벌레 모델의 선천성 면역 반응의 비 침습적 영상<em&gt; 연쇄상 구균 iniae</em&gt; 감염

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can result in disease. Understanding the underlying molecular mechanisms surrounding cell membrane repair is, therefore, an important objective to the development of novel therapeutic strategies for diseases associated with dysfunctional cell membrane dynamics. Many in vitro and in vivo studies aimed at understanding cell membrane resealing in various disease contexts utilize two-photon laser ablation as a standard for determining functional outcomes following experimental treatments. In this assay, cell membranes are subjected to wounding with a two-photon laser, which causes the cell membrane to rupture and fluorescent dye to infiltrate the cell. The intensity of fluorescence within the cell can then be monitored to quantify the cell's ability to reseal itself. There are several alternative methods for assessing cell membrane response to injury, as well as great variation in the two-photon laser wounding approach itself, therefore, a single, unified model of cell wounding would beneficially serve to decrease the variation between these methodologies. In this article, we outline a simple two-photon laser wounding protocol for assessing cell membrane repair in vitro in both healthy and dysferlinopathy patient fibroblast cells transfected with or without a full-length dysferlin plasmid.

Cell membrane wounding via two-photon laser is a widely used method for assessing membrane resealing ability and can be applied to multiple cell types. Here, we describe a protocol for in vitro live-imaging of membrane resealing in dysferlinopathy patient cells following two-photon laser ablation.

세포 막 복구 분석 결과 2 광자 레이저 현미경을 사용 하 여

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...