NIH 지원 연구는 AI102838 및 AI117739 (CRW)을 부여 합니다. 우리는 기술 지원을 위한 리처드 Rossoll 감사합니다. 흐름 cytometric 분석은 DartLab, Dartmouthsupported (P30CA023108-37)에 의해 (P30GM103415-15)에서 공유 리소스에에서 실시 됐다.

인체와 관련 된 연구는 헬싱키의 선언에 표현 하는 원칙에 따라 실시 했다. 연구는 다트머스 대학 기관 검토 위원회와 보호의 인간의 과목 (CPHS)를 위한 위원회에 의해 승인 되었다. 서 면된 동의 다트머스-히치콕 병원 (레바논, NH) hysterectomies를 받고 HIV 음성 여성에서 수술 전에 얻은 했다. 숙련 된 병리학 ECX, 병 적인 장애의 자유롭고 병 리의 사이트에서, CX, 및 그들에서 조직 샘플을 선택. 혈액 샘플은 다트머스 히치콕 의료 센터에서 모집 하는 자원 봉사 건강 한 기증자 로부터 얻은 했다. 혈액 기증자 했다 익명입니다. 수술 실에서 갓 고립 된 전각, CX, 및 ECX 조직 고립과 분류 사전 별도, 살 균 하는 폴 리 프로필 렌 튜브에 우리의 실험실에 전송에 대 한 병 리로 옮겨 졌다.
1. 효소 소화의 조직
참고: 살 균 물질을 사용 하 고 생물 안전 캐비닛에서 작동.
<ol><li>수정 된 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)와 페 놀 레드, 100 U/mL 페니실린 스, 0.35 g/L NaHCO3, 20 mM HEPES 1 x HBSS를 사용 하 여 준비 합니다.</li>
	<li>효소 칵테일을 준비 (수정 HBSS, 450 U/mL 콜라 4, 0.01% [wt/집] deoxyribonuclease, 2 mg/mL D-포도 당). 살 균 0.22 μ m 필터를 통해 솔루션을 전달 합니다. 이상적으로,의 사용, 하루에 소화 효소를 준비 하지만 저장용-20 ° C에 얼 수 있다. 반복 및 주기를 해빙 하지 마십시오.</li>
	<li>수정 HBSS와 100 x 15 m m2 배양 접시에서 조직 린스. 조직의 사용 가능한 금액에 따라 페 트리 접시 크기와 사용 하는 효소 칵테일의 볼륨 조정 (단계 1.4.2 아래 참조). 참고: 조직 병 리, 1-10에서 배열에서 얻은 수술 샘플에 따라 크기가 다양 합니다.</li>
	<li>일회용 메스와 집게 물리적 처리:<ol>
<li>절단 하면서 건조를 방지 하기 위해 조직에 소화 효소 칵테일의 약 3 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>집게를 사용 하 여 조직을 안정화 하 고 칵테일 소화 효소에 노출 하는 직물의 표면 영역을 증가 하는 메스를 말하다. 작은 조각 (< 2mm 측에)에 조직을 잘라. 모든 조직 조각 (5 mL/g 조직)를 충당 하기 위해 충분 한 소화 효소 칵테일을 추가 합니다. 페 트리 접시에 뚜껑을 놓습니다.</li>
		<li>5% CO2 45 분 흘리 고 또는 거품을 생산 하지 않고 철저 하 게 혼합 소화 효소 칵테일을 회전 속도 확인을 위해 약 80 rpm에 회전에 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>4 X 거꾸로 가벼운 현미경으로 조직 준비 10 X 목표를 시각화. 참고: 소화, 후 작은 조직 조각 및 표시 상피 땀 샘을 포함 하 여 혼합된 셀 서 스 펜 션 존재 해야 ( 그림 1A참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 단일 셀의 물리적 분리
<ol><li>메 마른 환경에서 홀더를 가진 긴장 된 250 µ m 메쉬를 150 x 15 m m2 페 트리 접시에 놓습니다. 메쉬 페 트리 접시의 표면 위에서 약 0.5 c m 인지 확인 합니다.</li>
	<li>메쉬 수정된 HBSS의 2 mL와 습식 및 메쉬에 소화 조직 전송.</li>
	<li>10 mL 주사기 플런저의 평평한 표면에 사용 하 여, 부드럽게 하지만 단단히, 갈기는 메시를 통해 소화 다진된 조직. 주의: 너무 적극적으로 연 삭 메시 손상 되며 세포 사망률 증가. 이 단계 결합 조직 및 점액에서 상피 세포와 stromal 세포 (면역 세포를 포함 하는) 별도 것입니다.</li>
	<li>조직 파편 철저 하 게 분산 되어, 일단 상승 메시 및 홀더 페 트리 접시의 3 mL와 린스 위의 2-3 cm HBSS 복구 추가 셀을 수정.</li>
	<li>세포 현 탁 액을 수집 합니다. 페 트리 접시에 수정된 HBSS의 2 mL와 젖은 홀더 20 µ m 메쉬를 배치 합니다. 들고 메쉬 망을 통해 세포 현 탁 액을 부 어 2-3 cm 배양 접시와 수정된 HBSS 6 mL와 린스. 참고:이 단계는 메쉬를 통과 하는 단일 셀에서 위에 유지 됩니다 상피 시트 분리 됩니다. 통해 흐름 혼합된 셀 서 스 펜 션, 면역 세포 및 stromal 섬유 아 세포를 포함 하는.</li>
	<li>혼합된 셀 펜션과 10 분 Aspirate 액체에 대 한 500 x g에서 원심 분리기를 수집 하 고 펠 릿 조밀도 기온 변화도 원심 분리에 대 한 수정된 HBSS 4 mL에 resuspend.</li>
	<li>아니 브레이크와 혼합된 세포 현 탁 액 3 mL 이상 polysucrose 솔루션 및 30 분 동안 500 x g에서 상 온에서 원심 분리기의 레이어. Polysucrose 솔루션의 위에서 흰색 밴드를 수집 하 고 PBS로 세척. 참고:이 분수 농축된 혼합된 세포 현 탁 액, 면역 세포에 풍부 하 고 일부 stromal 섬유 아 세포를 포함 하는.</li>
</ol>3. 죽은 세포 제거
참고: 죽은 세포 (> 20%)의 큰 비율에에서 있는 농축된 혼합된 세포 현 탁 액 조밀도 기온 변화도 원심 분리 후, 자석 구슬 죽은 세포 제거 것이 좋습니다. 죽은 세포는 긍정적인 자기 구슬 선택 과정을 방해할 수 있기 때문에 제거 될 필요가 있다.
<ol><li>10 X 목적으로 가벼운 현미경에는 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 농축된 혼합된 세포 현 탁 액 (500 g, 10 분, 4 ° C)의 모든 셀을 아래로 회전 합니다. 완전히 발음 하 고는 상쾌한 삭제. 1 x 107 총 셀 (라이브 및 죽은), 제조업체의 지침에 따라 당 죽은 세포 제거 구슬의 100 µ L를 추가 합니다. 15 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>30 µ m 필터 자석 열에, 셀 서 스 펜 션 적용 놓고 자기 열을 구슬 표시 된 셀을 허용 합니다.</li>
	<li>권장된 (3 mL)으로 죽은 세포 제거 버퍼 열을 씻어. 흐름을 통해 라이브 셀을 포함 하는 수집 합니다. 죽은 세포 제거 후 셀 복구의 범위는 그림 1B에서 제공 됩니다. 참고: 이러한 셀 phenotypical 연구 (제 5) 얼룩이 cytometry 수행을 사용할 수 있습니다 또는 DC 절연 (제 4) 계속.</li>
</ol>4. DC 정화 긍정적인 자기 구슬 선택에 의해
<ol><li>죽은 세포 제거 (3.2 단계), 다음 셀 아래로 회전 하 고 상쾌한, 제거 하 고 셀 펠 릿 1 x 107 셀 (PBS, 0.5% 열 비활성화 인간의 AB 혈 청 (HS), 2 mM EDTA) 당 80 µ L 자석 선택 버퍼에 resuspend.</li>
	<li>DC 인구의 긍정적인 선택에 대 한 CD1a 또는 CD14 자석 구슬 (20 µ L 자기 당 구슬 1 x 107 셀) 제조 업체의 지침에 따라 추가 합니다. 4° c.에서 15 분 동안 품 어
</li>
	<li>자기 선택 된 셀을 세척 하 고 스핀 다운, 버퍼를 완전히 제거. 자기 선택의 500 µ L의 최소 셀 resuspend</li>
	<li>자석에 열을 연결 하 고 모든 나머지 세포 덩어리를 유지 하기 위해 열 상단 30 µ m 필터 추가. 필터 및 자기 선택 버퍼 권장 열 린스.</li>
	<li>열에 세포 현 탁 액을 적용 합니다. 마그네틱 선택 3 번 린스 합니다.</li>
	<li>15 mL 튜브에 열을 전송, 자기 선택 버퍼의 5 mL을 추가 하 고 열에서 선택한 셀을 출시 플런저를 적용.</li>
	<li>순도 높이려면 새 열을 사용 하 여 복구 된 세포 단계 4.4-4.6을 반복 합니다. 마그네틱 비드 선택 후 셀 복구의 범위는 그림 1C에서 제공 됩니다.</li>
</ol>5. 셀 순도의 평가: Flow Cytometry 그리고 현미경 검사 법
<ol><li>항 체 cytometry에 대 한 얼룩:<ol>
<li>20%를 포함 하는 PBS의 106 셀 100 µ L x 1 resuspend 열 비활성화 Fc 수용 체를 차단 하 고 얼음에 10 분 동안 품 어 버렸습니다.</li>
		<li>붙일 항 체 및 죽은 세포의 식별을 위해 시 약 분류는 원하는 추가 (예, 섹션 6.5 참조). 설정 하는 게이츠 고 보상 비즈를 사용 하 여 보상에 대 한 하나의 얼룩 컨트롤을 준비 하나 (FMO) 컨트롤 마이너스 형광을 설정 합니다. 사용 하는 항 체의 예는 표 1에 주어진 다. 빛 으로부터 보호 4 ° C에서 20 분 동안 품 어.</li>
		<li>자기 선택의 2 mL로 세포 세척. 참고: EDTA의 존재는 흐름 cytometric 분석에 대 한 응집 하는 세포의 형성을 피하기 위해 해야 합니다. 스핀 다운 하 고는 상쾌한 삭제.</li>
		<li>튜브 당 2 %paraformaldehyde 솔루션의 100 µ L을 추가 하 여 셀을 수정.</li>
		<li>교류 cytometer10,11에 샘플을 분석 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>열 (예를 들어, cytospin) 스핀과 Giemsa 얼룩 형태 분석을 사용 하 여:<ol>
<li>자기 선택의 200 µ L 셀 resuspend</li>
		<li>5 분 동안 스핀에 스핀 열 로드. 슬라이드를 완전히 건조 보자.</li>
		<li>수정 슬라이드 2 분 린스에 대 한 100% 메탄올에 침수에 의해 슬라이드 이온된 수로 그리고 건조 공기를 허용.</li>
		<li>표준 Wrights Giemsa 얼룩을 수행 합니다. 오신 셀 커버 하 고 10 분 동안 품 어, 이온을 제거 된 물으로 씻어 말리 면. Wrights Geimsa 얼룩과 셀 커버, 1 분 동안 품 어, 이온을 제거 된 물으로 헹 구 고 건조 한 공기.</li>
		<li>준비 (그림 2A, 40 X 목표) 거꾸로 현미경으로 검사 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 수용자 자극 DC 세포 기능을 평가 하기 위해 분석 결과
<ol><li>해 동 냉동된 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)<ol>
<li>10% 셀 문화 미디어 따뜻한 HS 37 ° c</li>
		<li>적은 양의 언된 셀 미디어는 cryotube에 남아 때까지 37 ° C 물 목욕에는 cryotube를 배치 하 여는 PBMCs를 녹여. 메 마른 환경에서 미리 데워 진된 셀 문화 미디어 10%의 10 mL에는 cryotube의 내용을 전송 15 mL 튜브에 HS.</li>
		<li>원심에서 ~ 500 x g 7 분에 대 한 미디어를 제거, 펠 릿을 분산, 셀 문화 미디어 10 %HS, 그리고 원심 분리기의 10 mL에는 PBMCs resuspend 셀.</li>
		<li>세척 단계는 제 3 시간을 반복 합니다. 셀을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>순진한 T-셀 선택:<ol>
<li>부정적인 선택 자기 항 체 셀 선택 키트를 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 순진한 T-세포를 분리.</li>
		<li>절연, 후 CD45RA 및 CCR7 항 체를 사용 하 여 순도 확인 하십시오. 참고: 일반적인 순도 > 99% naïve T 세포입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>순진한 T 세포 확산 염료 얼룩이 지기:<ol>
<li>600 µ L 셀 확산 염료, 염료를 보호 하는 빛에 노출에서의 2 배 솔루션의 준비.</li>
		<li>순진한 T-세포 2 워시 x PBS. 500 µ L PBS에 셀 resuspend</li>
		<li>부드럽게 vortexing 동안 biosafety 내각에 셀 순 T-세포를 확산 염료의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>37° c.에서 10 분에 대 한 셀을 품 어
</li>
		<li>세포 배양 10%의 5 mL을 추가 하 여 셀 라벨 중지 셀에 HS. 5 분, 빛 으로부터 보호에 대 한 얼음에 품 어.</li>
		<li>원심에서 셀 ~ 7 분, 500g x 미디어, 발음 및 세포 배양 10%의 4 ° C에 셀 resuspend HS. 3 세척의 총에 대 한 두 번 더 반복 합니다. 마지막 원심 분리 이전 계산 셀의 약 수를 가져가 라. 참고: 일반적으로, 최종 순 T-셀 번호 초기 PBMC 세포 수의 15%와 5% 사이 범위 것입니다.</li>
		<li>10%로 셀 문화 미디어 셀 resuspend 원하는 셀 농도에서 HS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DC 수용자 naïve T 세포 공동 문화:<ol>
<li>1시 15분에서 격리 된 Dc와 순진한 T-세포는 96-글쎄, 라운드-하단 접시에서 접시 T-세포에 Dc의 비율. 3000 및 5000 셀/잘 Dc 범위에 대 한 최적의 수를 확인 합니다.</li>
		<li>원심에서 접시 ~ 500 x g 3 분 셀 우물의 센터에서 위치 확인. 셀 연락처 적절 한 신호 발생을 위해 중요 하다.</li>
		<li>6 일 동안 37 ° C에서 품 어. 확산 발생, 현미경 검사 법 (그림 3A)와 우물에 표시 되는 셀의 클러스터를 모니터링 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Flow cytometry 확산을 평가 하기 위해 얼룩:<ol>
<li>6 일 후 세포 cytometry에 의해 시험 될 수 있다. Cytometry에 대 한 공동 문화 얼룩.</li>
		<li>PBS에서 노란색 생존 염료 (최대 방출 572 nm)의 2 배 솔루션을 준비 합니다. 참고: 혈 청 하지 않고 PBS 사용 하 여 중요 한, 혈 청으로 단백질 방해 염료).</li>
		<li>에 세포 격판덮개 원심 ~ 5 분 동안 500 x g.</li>
		<li>상쾌한의 100 µ L을 제거 합니다. 참고:이 시점에서 수집 하 고 저장 성 요인의 별도 분석을 위한 상쾌한.</li>
		<li>두 번 PBS로 세포 세척: 150 µ L/잘 PBS의 추가에 원심 ~ 5 분 동안 500 x g 150 µ L를 피펫으로와 상쾌한의 제거. 각 잘에 남아 상쾌한의 50 µ L 인지 확인 합니다.</li>
		<li>각 우물에 2 x 생존 염료의 50 µ L를 추가 합니다. 빛 으로부터 보호 하는 10 분 동안 실내 온도에 품 어.</li>
		<li>부 화, 중 원하는 항 체 마커 마스터 혼합물을 준비 합니다. 예: CD3 APC/Cy7, PE CD4, CD8 FITC, 등
</li>
		<li>각 우물에 항 체의 혼합물을 추가 합니다. 빛 으로부터 보호 하는 10 분 동안 실내 온도에 품 어.</li>
		<li>셀 2 워시 x PBS + 2 %HS: 150 µ L/잘 PBS + 2%의 추가 HS. 원심에서 ~ 500 x g를 피펫으로와 상쾌한의 5 분 제거 150 µ L에 대 한.</li>
		<li>100 µ L / 2% 파라 포름알데히드의 우물을 추가 하 여 셀을 수정. 필요한 경우: 폴 리 프로필 렌 흐름 cytometry 튜브에 세포와 미디어를 전송. 튜브 4 ° C에서 보관 고 흐름 cytometric 분석까지, 빛에서 보호 될 수 있습니다.</li>
		<li>교류 cytometer에서 읽기 튜브입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자 공개할 게 없다

점 막 Dc는 조직 환경, 조직3입력 일단 그들의 표현 형 및 기능 변경에 의해 강하게 영향을 희귀 세포 인구. 혈액 파생 하는 동안 Dc 매우 유용한 모델, 그들은 조직에서 발견 되는 DC 인구의 다양성을 완전히 대표 하지 않는다. 따라서, 점 막 Dc의 독특한 특성을 이해, 조직에서 1 차 셀의 격리 필요 하다. Dc는 FRT에 다른 해 부 사이트에서의 절연 DC 기능에서 생체 외에서 연구 하...

FRT 이식 및 임신1하면서 병원 균에 대 한 보호의 이중 기능이 있다. 이 작업을 수행 하는 FRT는 들 에게만, 각 해 부 지역 표시 하는 독특한 조직학, 면역학, 및 기능적 특성1.
DCs 점 막 표면에 존재 확인 폐, 창 자, 그리고 성 기 요로에 미생물과 접촉 하 고 잠재적인 병원 균2에 대 한 면역 감시를 제공 합니다. DCs 프라임 순진한 T-세포 및 적응 면역 반응3는 독특한 기능이 있다. Dc는 FRT에도 정자 및 성공적인 임신4있도록 개발 태아에 있는 등 외국 항을 용납을 전문화 된다. 따라서, 위치에 따라 DC 형 및 기능 있을 것 이다 고유. 그것은 그들의 숫자, 표현 형, 고 기능 조직 환경 존재 하는3에 의해 수정 되는 Dc는 조직 환경에 의해 강하게 영향을 알려져 있다. 따라서, FRT Dc 전염 성 질환, 임신, 그리고는 FRT에 암에 재생 하는 역할을 이해 하려면 거주 Dc 혈액 파생된 DC 모델은 FRT 조직에서 발견 규제 복잡성을 해결 하기 위해 적절 한 이후 공부 필요.
인간의 조직 특성 거주 Dc 세포 점 막 조직에의 낮은 수와 인간의 조직 샘플을 얻기 어려움 도전적 이다. Dc에서 FRT immunohistochemistry5,6, 조직 내의 셀 위치에 대해 알려줍니다 하지만 기능 연구 하는 걸로 하 고 셀 마커 분석 될 수 있는 식별 하는 수에 제한 됩니다를 사용 하 여 연구 에 한 번. 또한, 단일 세포 격리 프로토콜 흐름 cytometric 분석에 대 한 개발된7,,89되었습니다. 이러한 프로토콜의 일부 활용 마이그레이션하는 그 세포를 분리 하는 Dc의 철새 용량. 이러한 메서드는 일반적으로 하룻밤 외피 및 활성화 된 Dc의 선택을 요구 하지만 안정 된 상태에서 Dc의 연구에 대 한 허용 하지 않습니다.
여기, 우리는 FRT, endometrium (EM)에서 다른 해 부 사이트에서 Dc를 분리 하는 프로토콜 최적화 된 hysterectomy 표본을 사용 하 여, endocervix (CX), 그리고 ectocervix (ECX), phenotypical 및 기능 분석을 가능 하 게. 비 분해 효소 소화 프로토콜을 사용 하 여, 우리 조직 세포 활성화 없이 셀 고립과 흐름 cytometric 특성을 소화 후 즉시 진행할 수 있습니다. 다 색 cytometry 사용 하 고 적응 하는 셀의 낮은 수에 대 한 기능 연구, 우리 식별 하 고 Dc는 FRT.의 다른 사이트에서의 드문 하위 집합의 특성

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="823">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:203px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30015.03</td>
			<td style="width:229px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES (1M)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td>Sigma Aldritch</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.22 um Stericup 500 mL&#160; filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm x 15mm polystyrene petri dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150mm x 15mm polystyrene petri dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB0875714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">150mm x 25mm polystyrene dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td>Treated cell culture dish</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Isotemp Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FICO3500TABB</td>
			<td>5.0% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">American Rotator V</td>
			<td>American DADE</td>
			<td>R4140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 um nylon mesh</td>
			<td>Sefar</td>
			<td>03-250/50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 um nylon mesh</td>
			<td>Sefar</td>
			<td>03-20/14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Beckman GS-6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>358702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human AB Serum</td>
			<td>Valley Biomedical</td>
			<td>HP1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma Aldritch</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Solution (PBS)</td>
			<td>National Diagnostics</td>
			<td>CL-253</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dead Cell Removal Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pre-separation filter (30um)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LS column</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quadro MACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACS multi-stand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>USB</td>
			<td>15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD1a Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-051-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD14 Microbeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eFluor 670 cell proliferation dye</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>9/8/2866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zombie yellow viability dye</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD3 APC/Cy7, anti-human</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>25-0038-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD4 PE, anti-human</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>12-0048-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CD8a FITC, anti-human</td>
			<td>Tonbo Biosciences</td>
			<td>35-0086-T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gallios Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter Life Sciences</td>
			<td>B43618</td>
			<td>10 color, VBR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSquant Analyzer 10</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-096-343</td>
			<td>8 color, VBR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of dendritic cells from the human female reproductive tract for phenotypical and functional studies

인간의 수지상 세포 (DCs) 점 막 조직에서의 특성화 샘플, 취득에 어려움으로 인해 도전 이며 DCs의 낮은 수는 조직 당 제시. 그러나, 표현 형 및 Dc의 기능 조직 환경에 의해 수정 되는, 그것은 조직 거주 DC 인구 분석, 혈액 파생 Dc 불완전 이후 반영 Dc의 복잡 한 조직에 필요한. 여기 우리는 인간 여성 생식 관에서 (FRT) 자 군 절제 견본을 사용 하 여 phenotypical 및 기능 분석을 허용 하는 Dc를 분리 하는 프로토콜을 제시. 조직 소화 혼합 세포 현 탁 액, 긍정적인 자기 구슬 선택 다음 단일 셀을 생성 하는 프로토콜에 의하여 이루어져 있다. 우리의 조직 소화 프로토콜 않습니다 하지 쪼개 다 표면 마커, phenotypical 기능 분석 Dc 야간 보육 또는 셀 활성화 없이 안정 된 상태에 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 면역 세포 유형의 격리 또는 다른 조직에서 Dc의 격리에 대 한 적응 될 수 있다.

다음 조직 소화, 상피 시트와 땀 샘의 릴리스 관찰 될 수 있다, 그림 1A;와 같이 이것은 효소 소화 성공적인 나타내는 긍정적인 컨트롤입니다. 총 실행 가능한 세포 및 조직의 그램 당 복구 Dc의 숫자도 표시 됩니다 그림 1B 및 그림 1C, 각각. 면역 세포 밀도 원심12,13</sup...

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Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

Phenotypical 및 기능 연구에 대 한 인간의 여성 생식 관에서 수지상 세포의 고립

여기 분리 하 고 그들의 phenotypical 및 기능 특성의 평가 대 한 인간의 여성 재생산 지역에 다른 해 부 격실에서 수지상 세포를 정화 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 다른 면역 세포 또는 다른 점 막 조직에서 수지상 세포를 분리 적용할 수 있습니다.

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

isolation-dendritic-cells-from-human-female-reproductive-tract-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.4K 조회수.  Geisel School of Medicine at Dartmouth. 여기 분리 하 고 그들의 phenotypical 및 기능 특성의 평가 대 한 인간의 여성 재생산 지역에 다른 해 부 격실에서 수지상 세포를 정화 하는 방법을 설명 합니다. 이 메서드는 다른 면역 세포 또는 다른 점 막 조직에서 수지상 세포를 분리 적용할 수 있습니다.

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Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

심장 기능 면역 세포의 분리

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the respiratory tract. At least three main subsets of lung dendritic cells have been described in mice: conventional DC (cDC) 4, plasmacytoid DC (pDC) 5 and the IFN-producing killer DC (IKDC) 6,7. The cDC subset is the most prominent DC subset in the lung 8. 
The common marker known to identify DC subsets is CD11c, a type I transmembrane integrin (&beta;2) that is also expressed on monocytes, macrophages, neutrophils and some B cells 9. In some tissues, using CD11c as a marker to identify mouse DC is valid, as in spleen, where most CD11c+ cells represent the cDC subset which expresses high levels of the major histocompatibility complex class II (MHC-II). However, the lung is a more heterogeneous tissue where beside DC subsets, there is a high percentage of a distinct cell population that expresses high levels of CD11c bout low levels of MHC-II. Based on its characterization and mostly on its expression of F4&#47;80, an splenic macrophage marker, the CD11chiMHC-IIlo lung cell population has been identified as pulmonary macrophages 10 and more recently, as a potential DC precursor 11. 
In contrast to mouse pDC, the study of the specific role of cDC in the pulmonary immune response has been limited due to the lack of a specific marker that could help in the isolation of these cells. Therefore, in this work, we describe a procedure to isolate highly purified mouse lung cDC. The isolation of pulmonary DC subsets represents a very useful tool to gain insights into the function of these cells in response to respiratory pathogens as well as environmental factors that can trigger the host immune response in the lung.

A highly purified preparation of mouse lung dendritic cells is described. Specific emphasis is given to the isolation of conventional dendritic cell subset.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

Lung dendritic cells (DC) play a fundamental role in sensing invading pathogens 1,2 as well as in the control of tolerogenic responses 3 in the ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and food antigens while concomitantly remaining poised to mount inflammatory responses toward invasive pathogens1,2. Antigen presenting cells, particularly DCs and macrophages, play critical roles in maintaining intestinal immune homeostasis via their ability to sense and appropriately respond to the microbiota3-14. Efficient isolation of intestinal DCs and macrophages is a critical step in characterizing the phenotype and function of these cells. While many effective methods of isolating intestinal immune cells, including DCs and macrophages, have been described6,10,15-24, many rely upon long digestions times that may negatively influence cell surface antigen expression, cell viability, and/or cell yield. Here, we detail a methodology for the rapid isolation of large numbers of viable, intestinal DCs and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is carried out by directly staining isolated intestinal cells with specific fluorescence-labeled monoclonal antibodies for multi-color flow cytometric analysis. Furthermore, highly pure DC and macrophage populations are isolated for functional studies utilizing CD11c and CD11b magnetic-activated cell sorting beads followed by cell sorting.

Here, we detail a methodology for the rapid isolation of mouse intestinal dendritic cells (DCs) and macrophages. Phenotypic characterization of intestinal DCs and macrophages is performed using multi-color flow cytometric analysis while magnetic bead enrichment followed by cell sorting is used to yield highly pure populations for functional studies.

마우스 소장에서 돌기 세포 및 Macrophages의 분리 및 특성화

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Throughout the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII) to various aspects of immune regulation in the lung has been increasingly recognized. AECII have been shown to participate in cytokine production in inflamed airways and to even act as antigen-presenting cells in both infection and T-cell mediated autoimmunity 1-8. Therefore, they are especially interesting also in clinical contexts such as airway hyper-reactivity to foreign and self-antigens as well as infections that directly or indirectly target AECII. However, our understanding of the detailed immunologic functions served by alveolar type II epithelial cells in the healthy lung as well as in inflammation remains fragmentary. Many studies regarding AECII function are performed using mouse or human alveolar epithelial cell lines 9-12. Working with cell lines certainly offers a range of benefits, such as the availability of large numbers of cells for extensive analyses. However, we believe the use of primary murine AECII allows a better understanding of the role of this cell type in complex processes like infection or autoimmune inflammation. Primary murine AECII can be isolated directly from animals suffering from such respiratory conditions, meaning they have been subject to all additional extrinsic factors playing a role in the analyzed setting. As an example, viable AECII can be isolated from mice intranasally infected with influenza A virus, which primarily targets these cells for replication 13. Importantly, through ex vivo infection of AECII isolated from healthy mice, studies of the cellular responses mounted upon infection can be further extended.
Our protocol for the isolation of primary murine AECII is based on enzymatic digestion of the mouse lung followed by labeling of the resulting cell suspension with antibodies specific for CD11c, CD11b, F4/80, CD19, CD45 and CD16/CD32. Granular AECII are then identified as the unlabeled and sideward scatter high (SSChigh) cell population and are separated by fluorescence activated cell sorting 3.
In comparison to alternative methods of isolating primary epithelial cells from mouse lungs, our protocol for flow cytometric isolation of AECII by negative selection yields untouched, highly viable and pure AECII in relatively short time. Additionally, and in contrast to conventional methods of isolation by panning and depletion of lymphocytes via binding of antibody-coupled magnetic beads 14, 15, flow cytometric cell-sorting allows discrimination by means of cell size and granularity. Given that instrumentation for flow cytometric cell sorting is available, the described procedure can be applied at relatively low costs. Next to standard antibodies and enzymes for lung disintegration, no additional reagents such as magnetic beads are required. The isolated cells are suitable for a wide range of functional and molecular studies, which include in vitro culture and T-cell stimulation assays as well as transcriptome, proteome or secretome analyses 3, 4.

We describe the rapid isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells (AECII) by flow cytometric negative selection. These AECII show high viability and purity and are suitable for a wide range of functional and molecular studies regarding their role in respiratory conditions such as autoimmune or infectious diseases.

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

산모 - 태아 인터페이스에서 쥐의 조직에서 백혈구의 분리

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

대사 표현형을 각기 다른 미성숙, 성숙 및 Tolerogenic 수지상 세포의 생성

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are used for host defense. For the quantitative determination of the functional status of the humoral immune response of an individual, both serum Abs and circulating ASCs are commonly measured as functional readouts. In humans, peripheral blood is the most convenient and readily accessible sample that can be used for the determination of the humoral immune response elicited by host B cells. Distinct B-cell subsets, including ASCs, can be isolated directly from peripheral blood via selection with lineage-specific Ab-conjugated microbeads or via cell sorting with flow cytometry. Moreover, purified na&#239;ve and memory B cells can be activated and differentiated into ASCs in culture. The functional activities of ASCs to contribute to Ab secretion can be quantified by ELISpot, which is an assay that converges enzyme-linked immunoabsorbance assay (ELISA) and western blotting technologies to enable the enumeration of individual ASCs at the single-cell level. In practice, the ELISpot assay has been increasingly used to evaluate vaccine efficacy because of the ease of handling of a large number of blood samples. The methods of isolating human B cells from peripheral blood, the differentiation of B cells into ASCs in vitro, and the employment of ELISpot for the quantification of total IgM- and IgG-ASCs will be described here.

Human peripheral blood is commonly used for the assessment of the humoral immune response. Here, the methods for isolating human B cells from peripheral blood, differentiating human B cells into antibody (Ab)-secreting B cells (ASCs) in culture, and enumerating the total IgM- and IgG-ASCs via an ELISpot assay are described.

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

전혈로부터 인간 단핵구 유래 수지상 세포의 생성

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...