저자는 교수 뤼트 Delwel 및 32D/G-CSF-R 셀 라인, 우리를 제공 하기 위한 교수가 보 Touw 및 Bosc23 셀 선 제공에 대 한 교수 다니엘 G. 되어 감사 합니다. 이 작품 MA j 체코 공화국 (GACR 15-03796S 및 GACR 17-02177S)의 그랜트의 교부 금에 의해 지원 되었다, MA-j, GA 영국 원정대 (프로젝트 번호 341015) 체코 과학 아카데미 (RVO 68378050)의 분자 유전학 연구소에서 지원 PD 프라하 찰스 대학교에서 MK, 하가 영국 원정대 (프로젝트 번호 1278217) 프라하에 있는 찰리 대학.

참고: 확장을 설명 하는 단계, 차별화, 및 32D/G-CSF-R 셀의 변환 되 게 됩니다 아래.
1입니다. 준비
<ol><li>미디어 준비
	<ol>
<li>문화 매체의 250 mL 준비: 10% 열 보충 (로스웰 파크 기념 연구소) RPMI 1640 매체 비활성화 FBS (태아 둔감 한 혈 청) 및 murine IL-3 (10 ng/mL).<ol>
<li>또는 집에서 만든 IL-3를 사용 하 여. 집에서 만든 IL 3 생산, IL-3 표현 벡터와 HEK293 세포 transduce 하 고 IL-3 표면에 뜨는22를 포함 하를 수집 합니다. 참고: 항생제, 페니실린 G 등 (100 IU/mL), 스 (100 µ g/mL), 및 gentamicin (40 µ g/mL), 달리 명시 하지 않는 한 프로토콜의 어떤 단계에서 세포 배양에 사용할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>차별 매체의 50 mL를 준비: RPMI 1640 매체 보충 10 %FBS, 그리고 인간의 G-CSF (100 ng/mL). 참고: 모든 혈 청 일괄 지원 32D/G-CSF-R 세포의 분화 (중요). 실험 시작 전에 혈 청의 다른 배치를 테스트 합니다. 4 다른 일괄 처리를 테스트 하 고 최적의 32D/G-CSF-R 세포의 분화 능력에 따라 선택 하는 것이 좋습니다. 32D/G-CSF-R 차별화 프로토콜 아래를 참조 하십시오.</li>
		<li>냉동 매체의 10 mL를 준비: RPMI 1640 매체 보충 40 %FBS, 그리고 10 %DMSO (디 메 틸 sulfoxide).</li>
	</ol></li>
	<li>레트로 바이러스의 생산
	<ol>
<li>Bosc23 셀 (6 × 106) 16 cm 배양 접시의 단일 세포 현 탁 액을 접시 하 고 10 %FBS 문화의 confluency까지 도달 80% (24 시간)를 포함 하는 18 ml DMEM (Dulbecco의 수정이 글의 중간)의 육성. 참고: 셀 문화에 단층 및 하지 양식 수 풀에서 성장 해야 합니다. 셀 세은 (여기에 제시 된 프로토콜의 나머지 부분에 대 한 유효한) 다른 방법을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 샘플의 낮은 수의 경우 현미경 Bürker 챔버를 사용 하 여 수동 계산 것이 좋습니다. 이 경우에, Trypan blue를 사용 하 여 죽은 세포의 배제에 대 한. 셀 1:1 혼합 0.4 %Trypan 파랑 PBS에. 샘플의 많은 수의 계산을 수행 하려면 자동 셀 카운터를 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>Retroviral 구문 (예: MSCV) 40 µ g, pCL 에코 (포장 벡터)23의 20 µ g, 페이 (polyethylenimine)의 80 µ l 감소-혈 청 매체 (예: Opti 메모리) (항생제) 없이 매체의 2 mL을 결합 합니다. 실 온 (RT)에서 20 분 동안이 혼합물을 품 어.</li>
		<li>신중 하 게 Bosc23 세포 매체 16 mL DMEM 2% 보완 대체 FBS. 미리 따뜻하게 사용 하기 전에 37 ° C에 매체. 참고:는 transfection 효율을 줄일 수 있습니다 그것 때문에, transfection, 동안 항생제를 사용 하지 마십시오.</li>
		<li>1.2.2에 혼합물을 추가 합니다. dropwise을 신중 하 게는 Bosc23 문화, 고 37 ° c.에 4 h에 대 한 품 어 미만 6 h 페이 독성 때문에 외피를 제한 합니다.</li>
		<li>부 화, 이후 18 ml Bosc23 매체 변경 사전 예 열 10% 포함 된 DMEM FBS, 37 ° c.에서 48 h에 대 한 셀을 육성 요리는 biosafety 수준 2 실험실에서 여기에,이 단계에서 계속 놓고 표준 안전 절차를 따르십시오.</li>
		<li>Bosc23 매체 (포함 ecotropic retroviral 입자) 50 mL 원뿔 튜브로 25 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 수집 및 4 ° c.에 저장 참고: (중요) Transfection 효율 높은 titer 바이러스 생산 90% 도달 한다.</li>
		<li>추가 18 mL 미리 따뜻하게 DMEM 10 %FBS Bosc23 세포와 24 h에 대 한 육성.</li>
		<li>1.2.6 단계를 반복 합니다. 참고: 일단 바이러스 무결성을 유지 하기 위해 동일한 온도 (4 ° C) 도달 하면 Retroviral supernatants 1.2.6 1.2.8에서 풀링된 수 있습니다.</li>
		<li>Bosc23 바이러스 supernatants 오염을 방지 하려면 스핀 4 ° c.에서 10 분 동안 1500 × g에서 수집 된 바이러스 Aliquot 바이러스, 동결 드라이 아이스 나 액체 질소를 사용 하 여 스냅 그리고-80 ° c.에 저장 그러나, 그 갓된 바이러스는 냉동된 주식 보다 감염 효율 측면에서 높은 품질의 note. 참고: (중요) 피하 반복적인 동결/녹고 바이러스, 때문에 그것은 바이러스 성 저하로 연결</li>
	</ol></li>
	<li>Lentivirus의 생산
	<ol>
<li>플레이트 HEK293T (인간 미 발달 신장 293T) 셀 (6 × 106) 16 cm 배양 접시의 단일 세포 현 탁 액 그리고 18 mL 10 %FBS 문화의 confluency까지 도달 80% (24 시간)를 포함 된 DMEM의 육성. 참고: 셀 문화에 단층 및 하지 양식 수 풀에서 성장 해야 합니다.</li>
		<li>15 µ g lentiviral 구문 (예: pGhU6), 플라스 미드 pCMVdR8.74 (개 그/폴, 12 µ g에 대 한 인코딩) 포장의 결합 및 pMD2.VSVG (1.4 µ g VSV G에 대 한 인코딩), 85.2 µ L 페이, 그리고 감소-혈 청 (항생제) 없이 매체의 2 mL. 실시간에서 20 분 동안이 혼합물을 품 어</li>
		<li>신중 하 게 2% 보완 DMEM의 16 mL HEK293T 매체를 바꿉니다 FBS. 미리 따뜻하게 사용 하기 전에 37 ° C에 매체. Transfection 효율을 줄일 수 있습니다 그것 때문에, transfection, 동안 항생제를 사용 하지 마십시오.</li>
		<li>신중 하 게 HEK293T 세포 배양에 1.3.2에 혼합물을 삭제 하 고 37 ° c.에 4 h에 대 한 품 어 페이 독성을 방지 하기 위해 6 h 이내에 부 화 기간을 제한 합니다.</li>
		<li>변경 매체 18 mL를 미리 예 열 DMEM 10% FBS 37 ° c.에서 48 h에 대 한 셀을 육성 요리는 biosafety 수준 2 실험실에서 여기에,이 단계에서 계속 놓고 표준 안전 절차를 따르십시오.</li>
		<li>HEK293T 매체 (포함 amphotropic lentiviral 입자) 50 mL 원뿔 튜브로 25 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 수집 하 고 4 ° c.에 그것을 저장합니다 참고: (중요) Transfection 효율 높은 titer 바이러스 생산 90% 도달 한다.</li>
		<li>신중 하 게 추가 미리 따뜻하게 DMEM의 18 mL 10% FBS HEK293T 셀에. 37 ° c.에 24 시간 배양</li>
		<li>1.3.6 단계를 반복 합니다. 참고: 일단 바이러스 무결성을 유지 하기 위해 동일한 온도 (4 ° C) 도달 하면 Lentiviral supernatants 1.3.6 1.3.8에서 풀링된 수 있습니다.</li>
		<li>HEK293T 세포와 바이러스 상쾌한의 오염을 방지 하려면 스핀 4 ° c.에서 10 분 동안 1500 × g에서 수집 된 바이러스 Aliquot 바이러스, 동결 드라이 아이스 나 액체 질소를 사용 하 여 스냅 그리고-80 ° c.에 그것을 저장합니다 그러나, 알 갓 바이러스 준비 냉동된 주식 보다 감염 효율 측면에서 높은 품질의. 참고: (중요) 피하 반복적인 동결/녹고 바이러스, 때문에 그것은 바이러스 성 저하로 연결</li>
	</ol></li>
	<li>GFP 기자를 포함 하는 바이러스의 적정
	<ol>
<li>씨앗 DMEM의 300 µ L에 1 × 105 NIH/3T3 세포 10% FBS 24-잘 접시에 잘 당. 7 웰 스 한 바이러스 titer에 채택 될 것입니다.</li>
		<li>37 ° C에서 바이러스를 해 동 하 고 추가 1, 5, 10, 50, 100 그리고 500 µ L 바이러스 NIH/3T3 문화. 추가 하지 마십시오 어떤 바이러스 부정적인 제어에 잘. 37 ° c.에서 48 h에 대 한 바이러스의 세포 배양</li>
		<li>NIH/3T3 세포의 트립 신/EDTA (ethylenediaminetetraacetic 산) 30 µ L를 사용 하 여 수확 (0.25 %Trypsin, PBS에 0.01 %EDTA) FACS (형광 활성화 된 세포 분류) 튜브에 250 µ L PBS에 셀을 배치 하 고.</li>
		<li>각 샘플24cytometry 여 GFP+ 세포의 주파수를 결정 합니다. Hoechst 33258 같은 생존 염료의 추가 의해 죽은 세포를 제외 합니다.</li>
		<li>GFP+ (도금된 셀 수와 GFP+ 세포의 비율에 따라), 세포의 총 숫자를 계산 하 고 바이러스 감염에 대 한 사용의 볼륨에 대 한 플롯. 참고: 감염의 (중요) 효율 도달 고원 큰 바이러스 성 복용량 적용 됩니다 때. 따라서, 그것은 효율성 선형 범위 (예를 들어 표 1에 표시 된)에서 발생 하는 어떤 감염에 바이러스 농도에 따라 titer를 추정 하는 것이 중요. GFP+ 셀 수 주어진된 바이러스 볼륨에서 기능 바이러스 성 입자 (TU-단위 변환)의 수를 나타냅니다. ML 당 투 수를 다시 계산.</li>
	</ol></li>
	<li>Puromycin 기자를 포함 하는 바이러스의 적정
	<ol>
<li>시드 3 ml DMEM의 5 × 104 NIH/3T3 세포 10% FBS 6 잘 플레이트;에 잘 당 6 우물 titer 1 바이러스를 사용 합니다. 37 ° c.에 하룻밤 문화</li>
		<li>표 2에 표시 된 대로 다음 날 바이러스 희석. 바이러스, 희석을 사용 하 여 미리 따뜻하게 DMEM 10 %FBS. 와 동 하지 마십시오.</li>
		<li>NIH/3T3 세포에서 문화 매체를 제거 하 고 희석된 바이러스의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>37 ° c.에서 밤새 품 어</li>
		<li>부드럽게 바꿉니다 바이러스 포함 된 매체 미리 따뜻하게 DMEM의 2 mL 10 %FBS, 고 37 ° c.에서 밤새 품 어</li>
		<li>부드럽게 NIH/3T3 매체를 바꿉니다 미리 따뜻하게 DMEM 10 %FBS 포함 puromycin (2 µ g/mL)의 2 mL.</li>
		<li>37 ° C 그리고 puromycin 매 3 일을 신중 하 게 새로 고침 매체 또는 중간 노란색에 문화.</li>
		<li>감염 후 10-12 일, 각 우물에서 매체를 발음 하 고 PBS로 부드럽게 씻어.</li>
		<li>크리스탈 바이올렛 솔루션 (20% 에탄올과 dH2O 0.5% 크리스탈 바이올렛)의 1 mL와 stain RT, 2 분 하 고 신중 하 게 PBS와 두 번 씻어.</li>
		<li>각 잘 (X4 확대) 현미경에 파란색 식민지를 계산 합니다. 아니 식민지 부정적인 제어에 잘 관찰 해야.</li>
		<li>TU/mL 희석 요인 고려의 총 숫자를 계산 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 확장 및 32D/G-CSF-R 셀의 유지 보수
<ol><li>32D/G-CSF-R 셀이 고정 되어 있으면 한 약 수 1 분 동안 37 ° C 물 욕조에 세포를 해 동 하 고 10% 보충 미리 따뜻하게 RPMI 1640 매체의 10 mL에 직접 유리병에서 세포를 부 어 15 mL 튜브에서 FBS. 튜브 3 시간 및 400 × g.에 아래로 셀 스핀 반전 상쾌한을 제거 하 고 0.3 × 106 셀/mL의 농도에서 IL-3 포함 문화 매체에 셀 resuspend.</li>
	<li>최적의 세포 성장 농도 0.25-0.5 × 106 셀/mL. 0.1-0.2 × 10의 농도에 그들을 데리고 2 일 마다 셀 분할6 셀/mL. 참고: (중요) 32D/G-CSF-R 셀 부분적으로 그들의 능력을 1 × 106 셀/mL 이상의 농도에 성장 하는 경우를 차별화 하를 잃을 수 있습니다. 따라서, 그것은 매우 시간에 32D/G-CSF-R 셀을 분할 하는 것이 중요입니다.</li>
	<li>필요에 따라 동결 하 고 오랜 기간-80 ° C에 또는 액체 질소에 대 한 셀 aliquots를 저장 합니다. 3 × 106 셀 아래로 회전 시키십시오, 상쾌한, 제거 하 고 냉동 매체의 1 mL에 resuspend. 튜브-80 ° c.에는 냉동 컨테이너에 배치 장기 저장을 위해 액체 질소를 셀 위치를 변경할.</li>
</ol>3. 32D/G-CSF-R 셀의 변환
<ol><li>0.3 × 106 셀/mL의 농도에서 6 잘 플레이트에 플레이트 32D/G-CSF-R 셀.</li>
	<li>10과 40 사이 나 (감염의 다양성)에 도달 하는 바이러스의 적절 한 금액을 추가 합니다. 참고: 높은 MOI는 GFP+ 세포의 증가 비율으로 관심사의 유전자의 표현의 상부에서 발생 합니다. 10;의 나와 셀 0.3 × 106 감염 예: 3 × 106 화 32D/G-CSF-R 셀에 추가 해야 합니다.</li>
	<li>최종 농도 8 µ g/mL에 polybrene를 추가 하 고 37 ° c.에 6 h에 대 한 품 어 또는 스핀 접종 절차: 스윙 양동이 터를 사용 하 여 자란 접시에 30 ° C에서 90 분 동안 1200 × g에서 원심 고 37 ° c.에 3 h에 대 한 품 어</li>
	<li>수집 셀, 15 mL 튜브에 전송 하 고 5 분 (4 ° C) 450 × g에서 회전.</li>
	<li>상쾌한, 수송과 세포 배양의 6 ml에서 resuspend, T25 세포 배양 플라스 크, 고 37 ° c.에서 문화에</li>
	<li>48 h 후, 세포를 수확 하 고 5 분 (4 ° C) 450 × g에서 그들을 회전. 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>GFP 기자 경우: 500 µ L 흐름 cytometry 정렬을 사용 하 여 PBS 및 정렬 GFP+ 셀의 셀 배치. Puromycin 기자 벡터를 포함 하는 경우: puromycin의 2 µ g/mL를 포함 하는 배양 세포 에서도.</li>
	<li>추가 분석 및 실험에 대 한 필요에 따라 셀을 확장 합니다. 참고: (선택 사항) Transduced 셀 미디어-80 ° C에서 냉동 컨테이너에서에 냉동 고 추가 액체 질소에 저장 될 수 있습니다.</li>
</ol>4. 32D/G-CSF-R 세포 확산 분석 결과
<ol><li>확산 속도 0.2 × 106 세포 배양의 1ml에 평가 하 고 37 ° c.에서 밤새 품 어를</li>
	<li>셀의 수를 계산 하는 다음 날 고 문화 매체를 사용 하 여 0.2 × 106 셀/mL의 농도에 다시 그들을 희석. 37 ° c.에서 밤새 품 어 세포 농도 및 표 3를 사용 하 여 매일 문화에 적용 하는 희석의 기록을 유지.</li>
	<li>로 확산 평가 하는 데 필요한 많은 일에 대 한 4.2 단계를 반복 합니다. 참고: 확산 분석 실험의 길이 관심사의 유전자의 영향에 따라 달라 집니다. 강한 형의 경우 8-9 일 (참조 그림 3A)는 상당한 효과 관찰 하기에 충분 한 수 있습니다. 그러나, 가벼운 표현 형의 경우 오랜 시간 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>표 3에 표시 된 대로 확산 곡선을 함으로써 세포 성장을 평가 합니다.</li>
</ol>5. 32D/G-CSF-R 세포 감 별 법 분석 결과
<ol><li>0.2 × 106 32D/G-CSF-R 세포 cytokines 없이 RPMI 매체와 두 번 씻는 다. 참고: 문화 G-CSF의 추가 하기 전에 세척 단계 중요 하다, 때문에 잔여 일 3의 존재는 차별화를 억제 수 있습니다.</li>
	<li>1 mL 차별화 매체 (100 ng/mL G-CSF 포함)는 24 잘/접시 셀 농도 0.2 × 106 셀/mL (0 일)의 결과에 셀을 배치 합니다. 37 ° c.에 하룻밤 문화</li>
	<li>셀/mL (1.2.1 단계) 위에 표시 된의 수를 계산 합니다.</li>
	<li>Cytospin 2-5 × 104 셀 (76 X 26 mm) 유리 슬라이드에 20 × g에서 필요한 어댑터와 원심 분리기를 사용 하 여.</li>
	<li>24 잘/접시 (1 일)에 0.2 × 105 셀/mL의 농도에서 차별화 매체와 플레이트 셀을 새로 고칩니다. 오래 된 접시를 삭제 하 고 날 새로운 플레이트 5.6 단계를 진행.</li>
	<li>2 ~ 7 일에 5.3-5.5 단계를 반복 합니다. 단계 4에서에서 설명한 G-CSF의 세포 증식을 평가 합니다. 참고: (중요) 차별화, 동안 세포 증식 속도가 느려집니다, 따라서 G-CSF의 3 ~ 4 일 후 그것은 높은 농도에 문화 세포에 적절 한.</li>
	<li>셀 형태에 따라 32D/G-CSF-R 세포의 분화 상태를 평가 합니다.<ol>
<li>RT 5 분에 대 한 메탄올에 5.4 단계에서 셀을 수정 하 고 건조를 슬라이드를 둡니다. 참고: 하루 0 ~ 7에서에서 슬라이드에 RT, 저장 고 동시에 고정 될 수 있습니다. 마찬가지로, 그들은 또한 보관할 수 있습니다 RT에 고정 후 오랜 동안.</li>
		<li>5 월-그 룬 발트 Giemsa 얼룩 다음 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여 셀을 얼룩.</li>
		<li>확대 X40 및 현미경을 사용 하 여 얼룩진된 셀을 시각화.</li>
		<li>계량 수 폭발, 판매인 차별화 된 세포와 성숙한 granulocytes 설명 그림을 사용 하 여 그림 1 과 표 4에 설명.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

실험적인 모델의 연구의 주요 문제 중 하나입니다. 기본 인간과 동물 세포 가장 생물학적으로 관련 데이터를 생산으로, 이러한 모델 윤리적 우려를 포함할 수 있습니다 고은 종종 비싼 및 정교한 분리/배양 절차와 관련 된. 1 차 셀 숫자에 제한 됩니다 그리고 유전자 조작 하기 어렵다. 또한, 1 차 셀 데이터 해석29을 복잡 하 게 수 있습니다 다양 한 세포 유형의 구성 유형이 다른 인구를 대표 한다. 대조적으로, 셀 라인 생물학 물자의 거의 무제한 소스 제공, 비용 효과, 고을 윤리적인 문제를 무시할. 그러나, 그것은 라인 유전자 수는 근원의 그들의 조직에서 다 phenotypically 인공 실험 시스템 간주 됩니다 해당 셀을 고려 하는 것이 중요. 그럼에도 불구 하 고, 셀 라인 다른 실험적인 접근법과 결합 될 때, 재현할 수 및 생물학 관련 데이터의 생성에 대 한 유용한 모델을 제공 합니다.
32D cl-3 셀 뿐 아니라 32D/G-CSF-R 셀 라인, 잘 설립 하 고 널리 이용 되는 세포 문화 모델 murine neutrophilic 차별화14,15,,2430의. 여러 연구 그룹에서 myelopoiesis, 특정 유전자의 역할을 평가 하기 위해 이러한 세포를 사용 있고 vivo에서 모델 및 1 차 셀16,31를 사용 하 여 얻은 데이터와 상관 하는 결과 얻었습니다. 그러나 여기 우리 32D/G-CSF-R 셀 라인을 처리 하기 위한 프로토콜을 제공,, 유사한 절차 경작 하 고 32D cl-3 셀에 적용할 수 있습니다. 그것은 지적 32D cl-3 셀의 다른 배치 다른 실험실에서 현재 차이 karyotype, 다른 그룹 그들의 자신의 subclones32일 하 수 있습니다 제안에 사용 하는 것이 중요. 이 관찰을 바탕으로, 우리가 가설 유전적 다양성 마찬가지로 32D/G-CSF-R 셀에 있을 그리고이 다양 한 연구 그룹에 의해 얻은 결과 비교 하는 때 고려 될 필요가. 32D/G-CSF-R 셀에 다른 셀 문화 모델은 불멸 하 게 조 혈 모 조상 라인22,33,,3435,36. 이 방법은 대규모 조상 확장 예를 들어에 필요한 경우 유용 단백질 상호 작용22공부. 32D/G-CSF-R 셀에 장점은 시간 라인을은 상당히 긴37어떤 유전자 변형된 마우스에서 불멸 하 게 창시자를 생성할 수 있습니다 것입니다. 또한, 처리 및 골 불후 창시자의 조작 32D/G-CSF-R 셀 보다 더 많은 전문 지식을 필요 합니다.
32D/G-CSF-R 모델의 대표적인 결과의 첫 번째 부분에는 독자를 우리 IL 3, G-CSF의 32D/G-CSF-R 세포의 증식과 분화 활동을 설명 했다. GCSF 유도 분화의 다른 시간 지점에서 뿐만 아니라 IL 3 확산 조건에서 셀의 형태를 보여 주는 대표적인 이미지 제시 했다. 그러나 그것은 알려졌다 32D cl-3 세포 분화는 CD11b 세포 표면 마커27,31를 사용 하 여 흐름 cytometric 분석에 의해 결정 될 수 있다 우리 형태소 분석, neutrophilic 분화 평가 38,39. 우리의 지식과 전문성, CD11b은 upregulated 32D/G-CSF-R 셀의 neutrophilic 차별화 하는 동안. 표준화, 32D/G-CSF-R 확산 분석 실험에서 우리가 상용 IL-3 사용. 그러나, 우리는 셀 집에서 만든 IL-3, Drobek와 동료22에 설명 된 대로 생산에서 잘 증식을 관찰. G-CSF 유도 neutrophilic 차별화의 좋은 학위를 얻으려면, 그것은 경우 셀 1 × 106 셀/mL의 농도 이상 교양 32D/G-CSF-R 세포의 분화 능력 손상 될 수 있습니다 기억 하는 것이 중요. 또한, 학위와 차별화의 속도 수 있습니다 영향을 받을 혈 청 성분으로. 따라서, 몇 개의 FBS 배치에, 32D/G-CSF-R 세포의 분화 능력을 테스트 하 고 더 나은 문화 G-CSF 존재의 6 ~ 9 일에 성숙 호 중구의 개발을 지 원하는 것을 선택 하는 것이 좋습니다.
우리는 골수성 차별화 (그림 3 및 그림 4)에 있는 특정 단백질의 역할을 연구 하기 가능한 방법을 보여 주는 두 개의 대표적인 실험 제공. 32D/G-CSF-R 셀에 골수성 차별화의 블록 조 혈 모 세포에 표현 하는 막 횡단 단백질 첫째, 리드 EVI2B의 그 downregulation를 살펴보았습니다. 이러한 데이터 분석 1 차 셀 및 Evi2b 녹아웃 쥐16를 사용 하 여 수행과 함께에서 우리의 그룹에 의해 최근에 출판 되었다. 둘째, 우리는 32D/G-CSF-R 셀의 neutrophilic 차별화에 BCR ABL, (q34; q11)를 유전 전 t(9,22)에서 유래 융해 단백질의 효과 조사. 이 전 원래 만성 골수성 백혈병40,41고통 받아 환자에서 확인 되었다. 그것은 이전 골수성 차별화 체포27,2832D cl-3 셀 리드에서 그 표현의 BCR ABL 융합 oncoprotein 표시 했다. 여기 우리 BCR ABL overexpression 32D/G-CSF-R 셀에 비슷한 효과가지고 입증. 실험의 두 세트에서 ( Evi2b downregulation BCR ABL overexpression 포함) 여기에 제시 된, 32D/G-CSF-R 세포의 유전자 조작 바이러스 성 변환, 안정적인 유전자 발현을 통해 수행 되었다. Lentiviral 배달 대 retroviral의 확산 또는 32D/G-CSF-R 세포의 분화에 영향을 미치지 않습니다. 그러나, lentiviral 감염 32D/G-CSF-R 셀에 내 인 성 레트로 바이러스의 존재로 인해 retroviral 변환 보다 더 효율적입니다. 우리의 경험에의 하면 표준 질 성 시 약을 사용 하 여 이러한 세포의 transfection 비효율적 이다. 그러나, 일시적인 구조 식이 필요한 경우 transfection electroporation에 의해 가능한 접근42,,4344이다. 여기, 우리가 제시 GFP 정렬 다음 32D/G-CSF-R 세포의 유전자 조작 및 대량 감염 된 세포의 분석. 그러나, 필요한 경우, 단일 셀 정렬 수 수 고용 이전에 보고 된12,45단일 세포 클론을 생성 하.
확산 및 감 별 법 분석 실험 이외에 32D/G-CSF-R 셀 셀 마이그레이션 및 apoptosis13,,4647,48에에서 특정 단백질의 역할을 성공적으로 확인을 고용 되어 . 또한, 32D/G-CSF-R 라인은 cytokine 독립적인 성장 oncoproteins19,20에 의해 중재를 결정 하기 위해 사용 되었습니다. 자주 cytokine 독립을 공부 하는 데 사용 하는 또 다른 선 학사/F3 셀21,49이다. 학사/F3 32D/G-CSF-R 셀에 마찬가지로 C3H 마우스 변형에서 파생 된 IL 3 종속 murine 셀 라인입니다. 두 시스템은 cytokine 독립적인 확산 연구 채택 될 수 있다, 비록 바/F3 셀 제대로 G-CSF의 차별화.
전부, 32D/G-CSF-R 셀, 비록 1 차 셀 보다 덜 선호 되 고 무제한 확산 용량 및 간단한 처리를 포함 하 여 여러 가지 이점을 제공 하는 것이 좋습니다. 우리는 신뢰할 수 있는 데이터의 생성에 대 한 실험 32D/G-CSF-R 셀에서 수행 해야 보완 될 murine 모델 등 주요 문화 다른 실험 방법을 사용 하 여 인수 데이터 믿습니다.

조 혈 줄기 및 조상 인구 유기 체 세포 (호 중구, 호 산 구는, basophils, 및 monocytes) 골수성 계보에서를 포함 하 여 성숙한 셀의 큰 범위를 제공 합니다. Myelopoiesis, 조 혈 줄기 세포에서 골수성 세포의 생산을 구동 하는 과정 이라고 변화 하는 요구에 대 한 응답에서 골수성 세포로 성숙의 적절 한 생산 이며 스트레스와 유기 체의 적절 한 대처에 대 한 전제 조건 조건, 감염 등 혈액 손실입니다. 성숙한 골수성 세포의 부족 한 생산 병원 체, 감소 된 혈액 응고, 및 다른 생명을 위협 조건1,2를 발생할 수 있습니다. 또한, 골수성 혈통 개발에서 변경 관련 혈액 악성 종양, 급성 골수성 백혈병 (AML)3등 된 수도 있습니다. Myelopoiesis 변경 결함 세포 표면 수용 체4, 녹음 방송 요인5, 변경된 식에에서 장애 신호 경로6, 변이 형성의 결과로 같은 다양 한 이유로 인해 발생할 수 있습니다 / 7oncogenes 또는 종양 억제기 유전자8의 비활성화의 활성화.
다양 한 방법은 골수성 개발, 연구 하 고이 과정에서 특정 유전자 변경의 영향을 평가 개발 되었습니다. Myelopoiesis를 공부 하는 데 사용 하는 일반적인 방식 기본 세포와 유전자 변형 쥐를 포함 한다. 이러한 모델 생물학 관련 데이터의 수집을 허용, 하지만 그들은 특정 제한이 있다. 일차 전지를 사용 하 여 셀의 수를 제한 및 변경 유전자 발현 및 후속 생물 학적 또는 생화학 분석 가능성을 축소 하는 문화의 제한 기간 발생 합니다. 유전자 변형 쥐 비용이 고 생물 칭의의 합리적인 학위 필요. 또한, vivo에서 모델 작업 지정된 된 프로세스에 관심사의 유전자의 역할을 이해 복잡성의 정도 추가 합니다. 따라서, 이러한 제한을 우회 하는 대체 접근 필요 합니다. 셀 라인 명백한 이점이 있다: (1) 그들은 생 화 확 및 생물 학적 연구에 대 한 충분 한 자료를 생성 수 무제한 확산 능력을가지고, (2) 그들은 (최저, 녹아웃, 유전자 조작에 취약 overexpression), (3) 비용은 상대적으로 낮은, 그리고 (4) 그들은 생물 학적 단순화 특정 실험적인 접근에 필요한 정도의 허용.
부모의 일 3 (인터 루 킨-3) 종속 32D 셀 라인에서 친구 murine 백혈병 바이러스9C3H/HeJ 마우스 골 수 세포의 감염에 의해 Greenberger와 동료에 의해 1983 년에 설립 되었다. 여러 32D 클론 문학에서 설명 했다: cl-239, cl-310및 cl 1011. 32D cl-3 셀 IL 3에 증식 하 여 치료 granulocyte-콜로 니 자극 인자 (G-CSF)10시 neutrophilic 차별화를 받아야 표시 했다. 그와 반대로, 32D cl-10의 세포, IL-3 의존 하면서 원래 했다 하지 차별화 G-CSF 치료에 대 한 응답. 1995 년에 박사가 보 Touw의 그룹 retrovirally이 수용 체11의 기능적으로 중요 한 영역을 식별 하기 위해 야생 종류와 돌연변이 형태의 G-CSF 수용 체 (G-CSF-R) 32D cl-10 셀을 불리고. 이 연구 결과 마찬가지로 IL 3에 의존, 32D/G-CSF-R 세포의 생성 하지만 IL-3 G-CSF의 교체 후 6 ~ 10 일 이내 셀 격 증 하 고 irreversibly 성숙한 호 중구로 차별화를 중지 합니다. 이러한 속성 32D cl-3 및 2 개의 잘 정의 된 성장과 감 별 법 요인-일 3 G-CSF로 변조 수 murine neutrophilic 차별화의 32D/G-CSF-R 셀 단순화 된 모델을 확인 합니다. 지난 십년 동안 여러 그룹 사용 32D/G-CSF-R 셀 확산에 특정 유전자의 역할 및 문화12,13,,1415 에 골수성 세포의 분화 연구 , 16, 그리고 G-CSF 신호17,18공부 하. 중요 한 것은,이 셀 라인을 사용 하 여 얻은 결과 기본 세포와 유전자 변형 마우스16,19,,2021얻은 데이터와 상관 된다. 따라서, 우리가 널리 사용 하 고 잘 설립 모델, 32D/G-CSF-R 셀 골수성 차별화 병행이이 문제를 해결 하는 다른 접근에 사용 될 수 있는 연구에 귀중 한 시스템 대표 믿습니다.
여기, 상세한 프로토콜 32D/G-CSF-R 셀 라인의 처리를 설명 하는 커버 확장, 차별화, 및 확산의 평가 및 이러한 셀의 제공 됩니다. 32D/G-CSF-R 세포의 유전 수정에 대 한 자세한 정보를 retroviral 또는 lentiviral 변환 뿐만 아니라 바이러스 적정에 대 한 프로토콜에 의해 제공 됩니다. 또한, 32D/G-CSF-R 세포의 잠재적인 응용 프로그램을 보여 주는 몇 가지 대표적인 결과 제공 됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 powder medium</td>
			<td>Merck, Kenilworth, NJ, USA</td>
			<td>T 121-10</td>
			<td>without NaHCO3, with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>15028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>31985-047</td>
			<td>L-Glutamine, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA)</td>
			<td>MT35011CV</td>
			<td>For differentiation of 32D/G-CSF-R cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>10270</td>
			<td>Used for culturing HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>S9137</td>
			<td>Streptomycin sulfate salt powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>G1914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>murine IL-3</td>
			<td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human G-CSF</td>
			<td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td>
			<td>300-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine</td>
			<td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td>
			<td>23966</td>
			<td>Linear, MW 25,000 (PEI 25000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>H9268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>VWR Chemicals, Radnor, PA, USA</td>
			<td>0458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>C0775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>T6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Gr&#252;nwald Giemsa</td>
			<td>DiaPath, Martinengo, BG, Italy</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

proliferation and differentiation of murine myeloid precursor 32d/g-csf-r cells

조 혈 줄기와 조상 세포 생물학의 이해 재생 의학 및 혈액 병 리 치료에 대 한 중요 한 의미를 갖는다. 가장 관련성이 높은 데이터를 취득 될 수 있다 vivo에서 모델 또는 기본 문화권을 사용 하 여에 불구 하 고 조 혈 줄기와 조상 세포의 낮은 풍부 상당히 그들의 조사에 대 한 적합 한 기술을 풀을 제한 합니다. 따라서, 세포의 사용 검사 또는 큰 휴대 번호를 필요로 하는 분석의 성능에 대 한 생물학 자료의 충분 한 생산을 수 있습니다. 여기 자세한 설명, 판독, 및 myelopoiesis 및 neutrophilic 분화에 관련 된 프로세스의 조사를 위해 사용 되는 확산 및 감 별 법 분석 실험의 해석 하는 것이 선물이. 이러한 실험 32D/G-CSF-R cytokine 종속 murine 골수성 세포 선, IL-3의 확산 및 G-CSF 차별화 능력을 보유 하 고 사용 합니다. 32D/G-CSF-R 셀을 처리 하기 위한 프로토콜 최적화 제공 하며 주요 함정 및 기술된 분석 및 예상된 결과 손상 시킬 수 있는 단점에 대해. 또한,이 문서 lentiviral retroviral 생산, 적정, 및 32D/G-CSF-R 셀의 변환에 대 한 프로토콜을 포함합니다. 이 세포의 유전자 조작 기본 조 혈 줄기와 조상 세포 또는 vivo에서 모델 결과 보완할 수 있는 기능과 분자 연구를 성공적으로 수행을 채택 될 수 있다 설명 합니다.

확산 및 32D/G-CSF-R 세포의 분화
32D/G-CSF-R 프로 증식 및 프로 차별화 조건 하에서 세포의 확산을 평가, 32D/G-CSF-R 셀 IL 3, G-CSF, 각각 포함 된 미디어에서 경작 했다. IL-3 포함 매체 (10 ng/mL)에 경작 하는 세포 (그림 2A) 약 24 시간 모든 분할 관찰 되었다. G-CSF (100 ng/mL) 확산 점차적으로 감속 하 고 4 일 (그림 2A) 후 중지와 IL-3의 교체 시. 또한, G-CSF cytospun 5 월-그 룬 발트 Giemsa 얼룩 세포를 사용 하 여 존재 배양 세포의 분화 상태 평가 했다. 그것은 하루 0 (G-CSF 치료의 시작) 전에,에 셀 미 숙 myeloblast 같은 형태학, 큰 핵과 어두운 세포질 (그림 2B)에 의해 특징을 제시 표시 했다. 치료의 과정 동안 핵 크기 감소와 달 모양의 핵 변경 또는 도넛 모양 모양. 또한, 세포질 확대 하 고 진한 바이올렛 색을 잃는다. G-CSF와 치료의 6 일 후 셀 전체 neutrophilic 차별화, lobulated 핵과 빛 바이올렛 세포질 (그림 2B)에 의해 특징의 징후를 제시. 32D/G-CSF-R 세포의 분화는 점진적 과정, 모든 셀 정확한 동일한 속도로 성숙 호 중구 쪽으로 진화. 차별화 (즉 폭발, 판매인 차별화 된 셀 및 neutrophil)의 과정 동안 여러 단계에서 세포의 정량화는 그림 2B에 표시 됩니다.
Murine Evi2b 최저 차단 32D/G-CSF-R 셀에 neutrophilic 차별화
Downregulation의 EVI2B에 대 한 (Ecotropic 바이러스 성 통합 사이트 2B) 32D/G-CSF-R 셀, 3 Evi2b-(Sh3, Sh2 Sh4)를 대상으로 하 고 1 비 대상으로 입을 비 제어 (NSC1) shRNAs 설계 되었습니다; 이러한 GFP 기자16들고 lentiviral 벡터에 복제 했다. 32D/G-CSF-R 세포 제어 및 Evi2b불리고 있었다-10 나를 사용 하 여 shRNAs를 입을. 2 일 후 변환, GFP+ (불리고) 셀 정렬, 되었고 추가 실험에 대 한 확장. 그러나 Sh2 downregulate EVI2B 단백질 수준을 효율적으로 하지 못했습니다 하 고 따라서 추가 제어로 사용 되었다 여기 참조 경우 Sh3 및 Sh4, EVI2B 소모는 80%에 도달, 비 입을 제어 2 (NSC2)로. 변환, 후 4 일 G-CSF, 존재 감 별 법 그리고 확산 분석 실험 수행 하 고 이러한 프로세스에서 Evi2b downregulation의 효과 평가 했다. 그것은 관찰 되었다 그 Evi2b-고갈 된 셀 (Sh2, Sh3) 지속 존재 GCSF, 세포 증식 제어 셀 (NSC1 및 NSC2) 하루 4 (그림 3A) 확산을 감소 하는 반면. 또한, Evi2b-침묵된 32D/G-CSF-R 셀 생산 제어 셀 (그림 3B)에 비해 적은 중간 및 성숙한 호 중구. 놀랍게도, 가난한 Evi2b 최저 효율 시연, NSC2로 불리고 세포도 성숙 호 중구 (그림 3B)의 수에 약간의 감소를 보였다. 이러한 데이터는 최근에 출판 된16했다.
BCR ABL 융합 단백질 손상 32D/G-CSF-R 셀에 neutrophilic 차별화
BCR ABL 융합 단백질 손상 골수성 차별화, 만성 골수성 백혈병25,26의 급성 단계 동안 조 혈 실패 귀착되는 골수성 창시자의 광범위 한 확장을 일으키는 것으로 표시 되었습니다. 이전 학문 32D cl-3 셀에 BCR ABL의 적용된 식 블록 호 중구 차별화27,28의 결과 설명 했다. 따라서, 우리는 32D/G-CSF-R 셀 라인으로 비슷한 결과 얻을 수 있는지 조사 합니다. 32D/G-CSF-R 셀 BCR ABL 또는 제어 MSCV retroviral 벡터 들고 GFP 기자로 불리고 있었다 (나 = 20). 변환, 후에 2 일 GFP+ 셀 정렬 하 고 IL 3 포함 매체에 2 주 동안 확장 했다. 다음, 차별화 분석 G-CSF의 수행 했다. 우리 날 0 (전송 하기 전에 셀 G-CSF 포함 매체), MSCV 제어 BCR ABL 32D/G-CSF-R 세포 표현 제시 비슷한 형태, 주로 미 숙 골수성 폭발 세포 (그림 4)를 나타내는 것을 관찰. 그러나, 우리는 빈 벡터 동안 불리고 제어 셀을 받았다 G-CSF (성숙 호 중구의 11.5%와 56.4% 판매인 차별화 된 셀의 생산), 치료의 6 일 후 neutrophilic 차별화 아니 시연 성숙 호 중구 BCR ABL 불리고 32D/G-CSF-R 셀 (그림 4)에서 생성 했다. 일관 되 게, BCR ABL 표현 셀 G-CSF에 미숙한 폭발의 비율 남아 IL-3 조건에서 폭발의 비율이 비슷한.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57033/57033fig1.jpg"> 그림 1입니다. 고유한 32D/G-CSF-R의 대표 이미지 셀 형태학. 32D/G-CSF-R 세포 형태학 상으로 폭발으로 분류 될 수 있다, 판매인 분화 세포와 성숙한 호 중구. 설명 표 4 를 참조 하십시오.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57033/57033fig2.jpg"> 그림 2입니다. 확산 및 32D/G-CSF-R 셀의. (A) 매체 포함 된 10 ng/mL IL-3 (검은 선) 또는 100 ng/mL G-CSF (파란 선) 32D/GCSFR 셀의 확산. X 축은 치료의 일을 나타냅니다. Y 축 눈금 (로그2)에 표시 되 고 셀 × 105의 수를 나타냅니다. 결과 3 독립적인 실험의 평균을 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. (B) 32D/G-CSF-R G-CSF 포함 된 매체 (100 ng/mL)에서 세포의 감 별 법. 상단 패널에서 파이-플롯 폭발 (검정)의 비율을 보여, 판매인 분화 세포 (분홍색), 및 호 중구 문화 0, 2, 4, 후에 (빨간색)와 G-CSF 치료의 6 일. 각각에서 cytospun 셀의 대표 이미지를 포함 하는 낮은 패널 포인트 5 월-그 룬 발트 Giemsa로 얼룩진 시간. 최소 100 셀의 각 시간 지점에 대해 평가 했다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57033/57033fig3.jpg"> 그림 3입니다. Evi2b 입을 32D-G-CSF-R 셀에 neutrophilic 차별화를 차단합니다. (A) Evi2b의 확산-입 막 음된 (오렌지 라인) 및 컨트롤 (검은 선) 32D/G-CSF-R 셀 100 ng/mL G-CSF 포함 매체에. X 축은 치료의 일을 나타냅니다. Y 축 눈금 (로그2)에 표시 되 고 셀 × 105의 수를 나타냅니다. 결과 3 독립적인 실험의 대표적인 결과 보여 줍니다. Evi2b로 불리고 32D/G-CSF-R 세포의 분화의 (B) 평가-입 및 제어 shRNAs G-CSF 포함 된 매체 (100 ng/mL)에서 cytospun 셀의 5 월-그 룬 발트 Giemsa 얼룩을 사용 하 여. 상단 패널에서 파이-플롯 폭발 (검정)의 비율을 보여, 판매인 (분홍색), 세포 및 호 중구 (레드) 문화에 분화. 낮은 패널 cytospun 셀의 대표 사진을 포함합니다. 차별화는 차별화의 7 일에 평가 했다. 적어도 100 셀 각 조건에 대해 평가 했다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57033/57033fig4.jpg"> 그림 4입니다. BCR ABL 융합 단백질의 overexpression 32D/G-CSF-R 세포의 손상. 32D/G-CSF-R 세포의 분화의 평가 불리고 제어 MSCV 또는 G-CSF 포함 된 매체 (100 ng/mL)에 BCR ABL 융합 유전자. 위 파이-플롯 폭발 (검정)의 비율을 보여, 판매인 차별화의 날 6 (분홍색), 세포 및 호 중구 (레드) 분화. 낮은 패널 5 월-그 룬 발트 Giemsa로 얼룩진 cytospun 세포의 대표적인 사진을 표시 합니다. 적어도 100 셀 각 시간 지점에 대해 평가 했다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>바이러스 V [µ L]</td>
			<td>도금 된 셀의 개수</td>
			<td>GFP+ %</td>
			<td>GFP+ 세포 수</td>
			<td>선형?</td>
			<td>TU/mL</td>
			<td>평균 (TU/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>100 000</td>
			<td>1.83</td>
			<td>1 830</td>
			<td>예</td>
			<td>1 830 000</td>
			<td rowspan="3">2 350 000</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>100 000</td>
			<td>12.9</td>
			<td>12 900</td>
			<td>예</td>
			<td>2 580 000</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>100 000</td>
			<td>26.4</td>
			<td>26 400</td>
			<td>예</td>
			<td>2 640 000</td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td>100 000</td>
			<td>71.4</td>
			<td>71 400</td>
			<td>아니요</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>100 000</td>
			<td>85.1</td>
			<td>85 100</td>
			<td>아니요</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>500</td>
			<td>100 000</td>
			<td>85.6</td>
			<td>85 600</td>
			<td>아니요</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. 바이러스 titer GFP 기자 포함 하는 벡터에 대 한 결정입니다. 바이러스 titer를 추정 하는 MSCV 레트로 바이러스와 계산으로 얻은 데이터의 예를 수행. 바이러스 titer GFP+ 세포 바이러스의 특정 금액 적용 된 취득의 수에 따라 계산 했다. 바이러스 감염에 대 한 고용의 양을 측정 하는 GFP+ 세포의 백분율을 가진 선형 상관 관계에 있어야 합니다. 부 엉: 단위 변환.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>튜브</td>
			<td>튜브 설명</td>
			<td>DMEM + 10% FBS</td>
			<td>바이러스</td>
			<td>총 볼륨</td>
			<td>희석 비율</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>(Μ L)</td>
			<td>(Μ L)</td>
			<td>(Μ L)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>희석 1</td>
			<td>1485</td>
			<td>15 µ L 바이러스 성 주식</td>
			<td>1500</td>
			<td>1 x 102
</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>희석 2</td>
			<td>1350</td>
			<td>150 µ L 튜브 1</td>
			<td>1500</td>
			<td>1 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>희석 3</td>
			<td>1350</td>
			<td>150 µ L 튜브 2</td>
			<td>1500</td>
			<td>1 x 104
</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>희석 4</td>
			<td>1350</td>
			<td>150 µ L 튜브 3</td>
			<td>1500</td>
			<td>1 x 105
</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>희석 5</td>
			<td>1350</td>
			<td>150 µ L 튜브 4</td>
			<td>1500</td>
			<td>1 x 106
</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2입니다. 바이러스 titer puromycin 기자 포함 하는 벡터에 대 한 결정입니다. 바이러스 희석 전략 puromycin 포함 하는 벡터에에서 바이러스 titer 결정 하. 표 (1-5) 포함 하는 바이러스 성 주식의 직렬 희석 5 튜브를 준비 하는 방법을 나타냅니다. 튜브 1 포함 1485 µ DMEM L + 10 %FBS 및 1 × 102 를 제공 하는 생산된 바이러스의 15 µ L 희석 바이러스. 튜브 2 포함 1350 µ DMEM L + 10 %FBS 및 1 × 102 의 150 µ L 희석 바이러스 (튜브 1), 1 × 103 희석된 바이러스를 제공. 튜브 3 포함 1350 µ DMEM L + 10 %FBS 및 1 × 103 의 150 µ L 희석 바이러스 (튜브 2), 1 × 104 희석된 바이러스를 제공. 튜브 4 포함 1350 µ DMEM L + 10 %FBS 및 1 × 104 의 150 µ L 희석 바이러스 (관 3), 1 × 105 희석된 바이러스를 제공. 튜브 5 포함 1350 µ DMEM L + 10 %FBS 및 1 × 105 의 150 µ L 희석 바이러스 (튜브 4), 1 × 106 희석된 바이러스를 제공. 1 ml 튜브 1-5에서에서 사용 되는 바이러스 titer를.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="8">
셀 계산 (x = ml 당 세포의 수)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>하루 0</td>
			<td>제 1 일</td>
			<td>제 2 일</td>
			<td>제 3 일</td>
			<td>제 4 일</td>
			<td>제 5 일</td>
			<td>제 6 일</td>
		</tr>
<tr>
<td>샘플 1</td>
			<td>0 x
</td>
			<td>1 x
</td>
			<td>x2
</td>
			<td>x3
</td>
			<td>x4
</td>
			<td>5 x
</td>
			<td>6 x
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">
희석 (d) (y = [mL]; replating에 사용 되는 셀의 볼륨 z = 최종 볼륨 [mL])</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>하루 0</td>
			<td>제 1 일</td>
			<td>제 2 일</td>
			<td>제 3 일</td>
			<td>제 4 일</td>
			<td>제 5 일</td>
			<td>제 6 일</td>
		</tr>
<tr>
<td>샘플 1</td>
			<td>d0= 1</td>
			<td>d1= y1/z1
</td>
			<td>d2y2/z2 =
</td>
			<td>d3= y3/z3
</td>
			<td>d4= y4/z4
</td>
			<td>d5= y5/z5
</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="8">총 세포 수</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>하루 0</td>
			<td>제 1 일</td>
			<td>제 2 일</td>
			<td>제 3 일</td>
			<td>제 4 일</td>
			<td>제 5 일</td>
			<td>제 6 일</td>
		</tr>
<tr>
<td>샘플 1</td>
			<td>0 x
</td>
			<td>1 /d0 x
</td>
			<td>2/d1 x
</td>
			<td>3/d2/d1 x
</td>
			<td>4/d3/d2/d1 x
</td>
			<td>5/d4/d3/d2/d1 x
</td>
			<td>6/d5/d4/d3/d2/d1 x
</td>
		</tr>
</tbody></table>테이블 3입니다. 성장 곡선 생성. 표에서 32D/G-CSF-R 세포의 확산 속도의 평가에 필요한 방정식.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>핵</td>
			<td>세포질</td>
		</tr>
<tr>
<td>폭발</td>
			<td>어둡고, 둥근</td>
			<td>어두운, 핵에서 거의 구별할 수 없는</td>
		</tr>
<tr>
<td>판매인 세포 분화</td>
			<td>종종 도넛 모양의 핵 형태로 변화를 발음 또는 달 같은 모양</td>
			<td>가볍고, 구별할 수 세포질</td>
		</tr>
<tr>
<td>성숙한 호 중구</td>
			<td>Lobulated 핵; lobules 사이의 연결이 거의 없음</td>
			<td>빛 세포질</td>
		</tr>
</tbody></table>표 4. neutrophilic 차별화 동안 32D/G-CSF-R 셀 형태학. 테이블 요약 주요 형태학 기능 미 숙 폭발, 판매인 차별화 된 세포와 성숙한 호 중구의 구별을 사용 합니다. 핵과 세포질 특성 설명 되어 있습니다. 대표 이미지 그림 1 을 참조 하십시오.

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Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

여기 자세한 위한 프로토콜 murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R 셀 라인 경작, 수행 하는 바이러스 성 감염, 확산 및 감 별 법 분석 실험 수행 되 게 됩니다. 이 셀 줄은 골수성 세포 개발, 골수성 세포 성장 및 neutrophilic 분화의 유전자의 역할을 공부 하 고 적합 합니다.

확산 및 Murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R의 셀

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

proliferation-differentiation-murine-myeloid-precursor-32dg-csf-r

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.8K 조회수.  Institute of Molecular Genetics of the ASCR. 여기 자세한 위한 프로토콜 murine 골수성 전조 32D/G-CSF-R 셀 라인 경작, 수행 하는 바이러스 성 감염, 확산 및 감 별 법 분석 실험 수행 되 게 됩니다. 이 셀 줄은 골수성 세포 개발, 골수성 세포 성장 및 neutrophilic 분화의 유전자의 역할을 공부 하 고 적합 합니다.

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3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3D의 Organotypic 공동 문화 모델

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

연구

발생학

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

배아 줄기 세포와 조직의 심장 차별화의 성적인 규정

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

성인 및 노인 인간의 골격 근육에서 근육 조직 전구체 세포 / 차 근육 아세포의 준비 및 문화

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells (NPCs)

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and neurite outgrowth; and later stages characterized by axon/dendrite outgrowth and synapse formation. In neurodevelopmental disorders, often one or more of these processes are disrupted, leading to abnormalities in brain formation and function. With the advent of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology, researchers now have an abundant supply of human cells that can be differentiated into virtually any cell type, including neurons. These cells can be used to study both normal brain development and disease pathogenesis. A number of protocols using hiPSCs to model neuropsychiatric disease use terminally differentiated neurons or use 3D culture systems termed organoids. While these methods have proven invaluable in studying human disease pathogenesis, there are some drawbacks. Differentiation of hiPSCs into neurons and generation of organoids are lengthy and costly processes that can impact the number of experiments and variables that can be assessed. In addition, while post-mitotic neurons and organoids allow the study of disease-related processes, including dendrite outgrowth and synaptogenesis, they preclude the study of earlier processes like proliferation and migration. In neurodevelopmental disorders, such as autism, abundant genetic and post-mortem evidence indicates defects in early developmental processes. Neural precursor cells (NPCs), a highly proliferative cell population, may be a suitable model in which to ask questions about ontogenetic processes and disease initiation. We now extend methodologies learned from studying development in mouse and rat cortical cultures to human NPCs. The use of NPCs allows us to investigate disease-related phenotypes and define how different variables (e.g., growth factors, drugs) impact developmental processes including proliferation, migration, and differentiation in only a few days. Ultimately, this toolset can be used in a reproducible and high-throughput manner to identify disease-specific mechanisms and phenotypes in neurodevelopmental disorders.

Rapid Detection of Neurodevelopmental Phenotypes in Human Neural Precursor Cells NPCs

Neurodevelopmental processes such as proliferation, migration, and neurite outgrowth are often perturbed in neuropsychiatric diseases. Thus, we present protocols to rapidly and reproducibly assess these neurodevelopmental processes in human iPSC-derived NPCs. These protocols also allow the assessment of the effects of relevant growth factors and therapeutics on NPC development.

인간의 신경 선구자 세포 (Npc)에서 Neurodevelopmental 고기의 신속한 감지

Human brain development proceeds through a series of precisely orchestrated processes, with earlier stages distinguished by proliferation, migration, and ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

꼬마 선 충 생식 핵의 분포, 단백질, 및 골격을 전산 분석

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies have demonstrated the wide differentiation capacity that these cells possess. The ovary represents a promising candidate for cell-based therapies due to the fact that it is rich in MSCs and that it is frequently discarded after ovariectomy surgeries as biological waste. This article describes procedures for the isolation, expansion, and differentiation of MSCs derived from the canine ovary, without the necessity of cell-sorting techniques. This protocol represents an important tool for regenerative medicine because of the broad applicability of these highly differentiable cells in clinical trials and therapeutic uses.

Herein, we describe a method for the isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from canine ovarian tissue.

파생 및 개 난소 중간 엽 줄기 세포의 분화

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...