우리는 그의 멘토링에 대 한 마이클 Rosbash를 감사 하 고이 방법의 개발의 초기 단계 지원. 이 작품은 JST 프레스 토 프로그램, 스위스 국립 과학 재단 (31003A_149893 및 31003A_169548), 유럽 연구 회의 (ERC-StG-311194), 노바 티 스 의료 생물 의학 연구 (13A39)에 대 한 재단과 제네바의 대학에 의해 투자 되었다 .

1. 문화 후드 재고 솔루션의 준비
<ol><li>400 mL 슈나이더 활성 매체 (SAM) x 1 (참조24,25수정) 애벌레 머리의 비보 전 문화에 대 한 최적화의 준비 (표 1). 5 mL 및 플래시 약 수-80 ° c.에 저장, 액체 질소 (선2) 고정</li>
	<li>재고 솔루션 (참조26수정) x 10 희석 Dissecting 염 (DSS) x 1을 준비 (표 2).</li>
	<li>Aliquot fibrinogen 10mg을 4 ° c 단일 사용에 대 한 저장소. 주의: 층 류, 장갑, 그것은 유해한 입고 아래 fibrinogen 무게.</li>
	<li>SAM에서 트 롬 빈 재고 솔루션을 준비 (1500 NIH 단위/밀리 그램) 및 10 µ L aliquot, 플래시 LN2 에 고정 시키고-80 ° c.에 주의: 그것은 유해한 트 롬 빈을 처리할 때 장갑을 착용 한다.</li>
	<li>100의 aliquot 재고 솔루션 페니실린 스 x. -20 ° c.에 계속</li>
	<li>소계 (PTFE) 멤브레인의 동그라미를 잘라 (자료 표 참조) 유리 하단 접시의 안쪽에 맞는 크기를. 70%에 그들을 씻어 EtOH와 다음에 압력가 dH2O. Sterilize UV와 층 류에서 건조. 멸 균 페 트리 접시에 계속. 단일 사용 합니다. 참고: PTFE 가스 교환을 허용 하 고 장기적인 기록 중 증발에서 매체를 방지 하는 다공성 유연한 멤브레인입니다.</li>
</ol>2. 시간 경과 현미경 설치
참고: 다음 설치 연동 스캐너 거꾸로 confocal 현미경에 대 한 (자료 표 참조) 갖추고 있다 공명 스캐너 (8000 Hz). 시스템 공명 스캐너 함께 phototoxicity 및 photobleaching를 방지 하는 매우 중요 한 사진 배율 검출기를 포함 되어 있습니다. 온도 및 습도 제어 됩니다 현미경 환경 챔버 내에서 하는 현미경의 대부분을 커버 ( 자료 표참조).
<ol><li>무대-가기 습기 장소입니다.</li>
	<li>25 ° C와 80% 습도에 현미경 챔버 equilibrate를 온도 및 습도 컨트롤러를 켭니다.</li>
	<li>지속적인 암흑 (DD)에서 실험을 수행, (현미경 챔버는 불투명 재료의 만든) 않으면 불투명 천으로 현미경 환경 챔버를 커버.</li>
	<li>물 침수 목표를 사용 하 여 목표 위에 물 침수 마이크로 디스펜서 놓고 하는 동안 시간 경과 영상 일정 한 속도로 물 걸 Autoimmersion 목표 컨트롤러 소프트웨어 프로토콜 프로그램. 참고: 물 디스펜서 또는 건조 렌즈 물 침수 목표는 권장 장기 라이브 이미징, 침수 매체의 다른 유형을 건조 것입니다.</li>
	<li>무대, 습도 챔버 내부에 페 트리 접시 홀더를 배치 합니다.</li>
	<li>현미경 소프트웨어를 실행 하 고 첫 번째 대화 상자에서 스캐너를 공 진 모드를 선택 합니다. 메시지가 표시 되 면 단계를 초기화 하는 확인을 선택 합니다. 구성 탭에 하드웨어 구성 관련 레이저 라인에 스위치를 이동 합니다.</li>
	<li>XY 패널 양방향 모드를 선택 하 고 이미지 수집 매개 변수를 설정 하 고 취득 탭 이동 합니다. 참고: 설명된 영상 설치 여기에 제시 된 (그림 2, 그림 3 과 영화 1) 관찰 circadian 표현의 특정 형광 기자 최적화 됩니다. 다음 매개 변수는 가장 우리의 사양에 맞게 선정 됐다: 40 X 물 침수 목표, 8 X 선 평균 512 × 512 이미지 해상도. 멀티 컬러 이미징에 대 한 순차적 이미지 수집이 필요한 때 한 fluorophore와 다른 중복 (여기, 노란 형광 성 단백질 (YFP) 방출 및 토마토 여기 오버랩의 파장)의 여기 파장의 방출 파장. 그것은 빠른 고 Z 스택의 인수 중 시계 뉴런의 이동은 무시할 수 "스택" 사이 순차 모드를 선택 합니다. 현미경 설정을 각 실험의 목표에 맞게 적응 해야 합니다.</li>
</ol>3입니다. 애벌레 두뇌 Explant 문화의 설치
참고: 뇌 explants의 포함 해 부에서 전체 절차 ~ 30 분 걸립니다.
<ol><li>
문화 후드 시 약의 준비입니다.
	<ol>
<li>트 롬 빈의 약 수를 해 동 하 고 (3.3 단계) 포함 단계까지 실내 온도에 유지. 단일 사용 합니다.</li>
		<li>37 ° C에서 샘의 약 수를 빠르게 해 동 하 고 단일 사용에 대 한 얼음에 계속.</li>
		<li>10 mg/ml fibrinogen의 약 10 밀리 그램 수로 샘을 추가 하 고 부드럽게 터치 포함 단계 (단계 3.3) 및 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 품 어. 단일 사용 합니다. 참고: 않습니다 하지 품 어 2 h 이상 fibrinogen 솔루션 유해를 시작으로.</li>
		<li>100 x 재고 페니실린 스의 약 수 동 1 샘의 2.5 mL 준비 페니실린-스 (샘/항생제) x. 실내 온도에서 보관. 참고: 저장소 나머지 100 x 재고 페니실린 스 4 ° C에서 1 달까지.</li>
		<li>나머지 샘에서 500 µ L의 약 수를 준비 합니다. 얼음에 계속.</li>
		<li>장기적인 이미징에 대 한 유리 하단 접시 (그림 1A)의 바닥의 플라스틱 부분에 압력가 진공 그리스를 적용 하 고 UV 층 류에서 소독.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
중앙 신 경계와 복 부 신경 코드 절 개가 고
	<ol>
<li>청소는 집게와 2 x 3-잘 유리 해 부 요리 70 %EtOH. 4 우물에 DSS의 400 µ L와 한 우물에서 샘의 400 µ L를 붓는 다. 얼음에 계속.</li>
		<li>애벌레를 포함 하는 비행 중간에 밖으로 푸 고 집게와 방황 아닌 3 탈피 애벌레 (L3)를 선택. 2 DSS 가득 우물에 그들을 연속적으로 린스. 3 DSS 가득 잘 애벌레 anesthetizes 얼음에 그들을 유지. 참고: L3 지속 25 ° c.에 약 2 일 순수 관련 기간에 뇌를 관찰 하 우리는 방황 아닌 L3 유 충을 사용 하기로 결정 했다. L-LNvs, DN3s, 등 시계 뉴런의 다른 하위 방황 L3 단계에서 형성 시작 하지만 그들은 반드시 자전거 아직 (데이터 표시 되지 않음). 따라서, 이미지 수 시계 뉴런 (데이터 표시 되지 않음),이 단계에서 사이클링 그것 이지만 신중 하 게 데이터 분석에 대 한 개발에서 이미 기능 애벌레 시계 신경 세포를 구별 하는 것이 중요 합니다. 비 방황 L3 25 ° c.에 누워 계란 후 약 4.5 4 일 표시 이 프로토콜을 사용 하 여 circadian 리듬을 공부, 하려면 동기화 (끌고가 다)에서 12 h/12 h LD 개발 애벌레 L3 애벌레를 수집 하기 전에 3 일 동안 25 ° C에서 주기.</li>
		<li>4 DSS 가득 잘, 애벌레,27내부 메서드 사용 하 여 세 정을 위해 사용 되지 않은 어떤 좋은 집게와 애벌레 두뇌를 해 부.<ol>
<li>간단히, 유 충 2에, 부드럽게 입 고리 집게의 쌍 꼬집어 잘라내어 집게, 따라서 뇌를 노출의 다른 쌍을 사용 하 여 몸 벽 내부를 롤. 모든 기도는 시체의 나머지 부분에 연결 된 신경을 절단 하 여 뇌를 무료.</li>
			<li>20 µ L 피 펫 (DSS 미리 씻어 서)와 DSS의 약 3 µ L에서 뇌를 발음 하 고 샘 가득 잘에서 분배. 최대 7 두뇌에 대 한 절차를 반복 합니다. 주: 해 부 취 애벌레 및 냉장 두뇌 차가운 표면에 수행 되어야 한다. 예를 들어 얼음 냉장 물 순환 펌프에 연결 된 냉각 블록에 해 부 접시를 놓습니다. 해 부 절차 소요 ~ 30의 뇌 당. 그것은 두뇌와 그대로 복 부 신경 코드에 연결 된 눈/더듬이 imaginal 디스크를 유지 하는 것이 중요입니다. 이러한 부분을 찢 어 두뇌를 손상 하 고 문화의 질을 줄일 것입니다. 또한, 공기에 머리를 노출 하지 마십시오. 첫 번째 뇌 해 부 애벌레의 부분을 포함 하는 DSS 위아래로 피 펫을 발음 하기 전에 그것으로 두뇌에서 방지 팁의 벽에 고정 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3 차원 매트릭스에 장착 (~ 20 분) 뇌 explants의 포함.
	<ol>
<li>잠수함 fibrinogen 작업 솔루션 (fibrinogen 최종 농도 ~3.3 mg/mL, 뇌 당 10.5 µ L)에서 해 부 두뇌 다음과 같습니다.</li>
		<li>(동일한 팁 섹션 3.2.3에서에서 사용)와 샘/항생제의 3.5 µ L 발음. 동일한 피 펫 팁으로 잘 해 부 해 부 두뇌에 있는 샘/항생제 매체를 분배 하지 않고 발음.</li>
		<li>분배는 두뇌와 멸 균 페 트리 접시의 뚜껑에 매체. 두뇌를 포함 하는 드롭에 샘/항생제의 또 다른 3.5 µ L와 따뜻한 fibrinogen/샘 10 mg/mL 해결책의 3.5 µ L를 추가 합니다. 20 µ L 피 펫 팁 pipetting으로 뇌 주변의 솔루션을 부드럽게 혼합. 참고:이 단계에서 겸 자 보다는 피 펫을 사용 하 여 강조 하는 두뇌 피 한다.</li>
		<li>2 µ L에서에서 fibrinogen 작업 솔루션의 고 작은 원으로 유리 하단 접시의 coverslip에 적용. 트 롬 빈의 0.8 µ L을 추가 하 고 피 펫 팁 매우 신속 하 게 혼합. fibrinogen 섬유 소에 변환 되 고 유해 하기 시작.</li>
		<li>두뇌 fibrinogen 작업 솔루션 (단계 3.3.1) 집게의 쌍 사이에서 앉아 고 섬유 소의 흰색 매트릭스 표시 되는 행렬에 위치. (시계 신경 세포 이미징)에 대 한 뇌 앞쪽 측면 아래로 동양. 밀어 최대한 가까이 커버 유리에. 섬유 소 응고 섬유 소의 레이어의 구성 됩니다. 한 레이어를 선택 하 고 매트릭스를 분리 하지 않고 작고 부드러운 움직임을 뇌 위에 접어.<ol>
<li>뇌를 안정 시키기 위해 응고의 다른 부분에서 2 ~ 3 회 반복 합니다. 참고: 때 집게와 두뇌를 처리, 건조 또는 물리적 스트레스 부과 주의 해야 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>트 롬 빈의 행동을 막으려고 포함된 뇌 위에 샘/항생제의 20 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>나머지 머리를 탑재 하는 절차를 반복 합니다. 그것은 최대 5 유리 하단 접시에 6 두뇌를 포함 수 있습니다.</li>
		<li>장기 라이브 이미징에 대 한 내부 잘 (유리 부분)에서 샘/항생제의 600 µ L를 추가 합니다. 매체 위에 미리 잘라 PTFE 멤브레인을 하단 (3.1.5) (그림 1A)의 플라스틱 부분에 적용 하는 진공 그리스에 그것을 막대기.</li>
		<li>약리학 적인 분석에 대 한 샘/항생제 (그림 1B)의 2 개 mL로 접시를 채우십시오. 매체의 osmolality은 신경 세포의 생존에 중요 한 참고: 그것을 매체의 증발을 피하기 위해 매우 중요 하다. 따라서, 장기 이미징 실험에 대 한 그것은 문화 접시 PTFE 막으로 밀봉 하는 데 필요한입니다. 반면 단기 실험, 멤브레인 씰링 필요 하지 않습니다 접시 중간의 2 개 mL 가득 고 습도 챔버에 모니터링.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 시간 경과 이미지 수집
<ol><li>페 트리 접시 홀더 무대 최고 습도 챔버 내부에 유리 바닥 접시를 놓습니다.</li>
	<li>인식 탭에서 z-스택 패널에가 고 현미경 소프트웨어 (2 µ m × 40에서 그림 2 와 그림 3, 영화 1에 표시 된 실험)에서 z-섹션 단계를 설정. coverslip와는 coverslip 가까이 뇌 explant의 표면에 끝에서 멀리 비행기에서 z 스택의 시작 부분을 설정 합니다. 비록 뇌 움직임 무시할 수 있습니다, 그리고 시작 및 z 스택의 끝 부분에서 여분의 z-섹션 추가.</li>
	<li>마크 & 패널 설정 다 위치 이미지 수집을 찾을로 이동 합니다. 40 X 목표 1 두뇌 반구 보기의 필드 내에서 캡처할 수 있습니다.</li>
	<li>수집 모드 패널 및 선택 xyzt (z-스택 시간 경과)로 이동 합니다. 시간 수집 패널 하 고 원하는 시간 간격 및 주파수 매개 변수 설정. 참고: 원하는 주파수와 시간 경과 이미지를 취득 합니다. Note 시간 경과 간격 2 시간 보다 짧은 장기 라이브 영상 (24-72 h) 적은 자전거 신경에 있는 결과 경향이 아마도 때문에 뉴런의 생존 능력을 감소 시킨다. 데이터 볼륨 확장 시키는 데이터 분석 및 저장 더 도전 이미지 수집 증가의 비율으로.</li>
</ol>5. 약리 치료 단기 라이브 영상으로 뇌 Explants의
참고: 다음 절차는 본질적으로 동일 장기 이미징에 대 한 하지만 PTFE 멤브레인을 필요 하지 않습니다. 화학 물질 문화에 추가 될 때 빛을 파랑 머리 노출 피하려고 현미경 붉은 빛으로 어두운 방에 두어야 한다.
<ol><li>시간 수집 패널 하 고 원하는 시간 간격 및 약물 응용 프로그램 전에 초기 계획 데이터를 스캔 수 설정. 스캔을 시작 합니다.</li>
	<li>베이스 후 검사가 완료 되 면, 현미경 시스템의 스캔 헤드를 리프트. 무대 최고 습도 컨트롤러의 뚜껑을 제거 하 고 매우 신중 하 게 그것을 이동 하지 않고 유리 하단 접시의 뚜껑을 제거 합니다.</li>
	<li>필요한 경우 적절 한 양의 문화 매체를 제거 합니다. 매체에서 실험적인 솔루션을 추가 하 고, 신중 하 게, 아주 부드럽게 조화를 살 균 파스퇴르 피 펫 두뇌 explants 건드리지 않고. 참고: PDF의 목욕 용, (10 %DMSO)에서 2 µ M PDF 재고 솔루션을 사용 합니다.</li>
	<li>유리 바닥 접시와 습 한 챔버 스캔 머리 뚜껑을 교체 합니다. 사용 하 여, 현미경 챔버 주위 검은 불투명 천으로 재조 정할.</li>
	<li>라이브 스캔 모드에서 그들의 원래 위치에서 두뇌 인지 확인 하십시오. 필요한 경우 조정 합니다.</li>
	<li>시간 수집 패널 하 고 원하는 시간 간격 및 스캔 수 설정. 스캔을 시작 합니다. 참고: 여기 우리가 테스트 시간 경과 이미지 최대 10 h에 대 한 모든 시간을 획득.</li>
</ol>

<ol>
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A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels.">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).</li><li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+larval+CNS+in+Drosophila+melanogaster.">Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (1), e85 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culturing+of+Drosophila+brain+as+a+method+to+live+image+pupal+brains:+insights+into+the+cellular+mechanisms+of+neuronal+remodeling.">Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling.</a> Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+keep+non-adhering+living+cells+in+place+on+glass+for+perfusion+or+fixation.">Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation.</a> Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).</li><li>Lukinavi&#269;ius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiR-Hoechst+is+a+far-red+DNA+stain+for+live-cell+nanoscopy.">SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy.</a> Nature Communications. 6, 8497 (2015).</li><li>Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+axonal+transport+in+Drosophila+pupal+brain+explants.">Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants.</a> Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).</li><li>Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+fluorescence+imaging+of+circadian+rhythms+detected+with+a+Nipkow+spinning+disk+confocal+system.">Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system.</a> J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).</li><li>Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development.">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain.">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리 교양된 애벌레 머리의 장기 형광 시간 경과 현미경에 대 한 방법을 설명합니다. 이 유형의 실험의 성공에 따라 달라 집니다 문화, 건강 등의 여러 요소 두뇌 explant, 형광 강도 및 기자, 시간적 및 공간적 해상도의 신호 대 잡음 비율의 동원 정지를 위한 방법 및 explant에 대 한 접근 이러한 요소는 상호 배타적 될 수 있습니다. 예, 문화, 건강에 영향을 미치는 시간 경과 주파수를 증가 하 고 뇌 explant의 동원 정지 가스 교환을 방해 수도. 따라서, 연구에서 현상에 대 한 (말 장난 의도) 중 찾는 성공적인 프로토콜 열쇠입니다. 여기 설명 하는 방법은 일 시간 규모에서 형광 circadian 기자의 식 모니터링 최적화 됩니다. 그것은 또한 중요 한 프로세스는 불변 하 고 주의 실행 초파리 신경 생물학에 다른 과목 공부에 적용 됩니다.
이 프로토콜에서 뇌 explants는 3D 매트릭스를 생성 하는 섬유 소 응고에 움직일 수 있습니다. 비록 동원 정지에 대 한 다른 방법 존재, 폴 리 또는 커버 유리의 laminin 코팅 등이 천천히 애벌레 머리29 의 개발 하 고 따라서 그들의 생리 적인 견고성을 손상 수 있습니다. 자연, 섬유 소 뇌 explant 도달 하는 영양분을 허용 하도록 충분히 느슨한 이며 뇌16그것을 부 수 없이 커버 유리에 가까운가 대 한 충분 한 끈 적 한 우수한 매트릭스를 제공 합니다. 이러한 장점 때문에 섬유 소 응고 방법 세포 배양에 대 한 다양 한 프로토콜에 고용 되어 및 뇌 explant 문화14,,1729,30,31,32 ,,3334. 이상 몇 시간 마지막 비교적 단기 실험에도 애벌레 뇌 문화에 대 한 섬유 소 3 차원 매트릭스를 사용 하는 것이 좋습니다. 3 차원 매트릭스 없이 애벌레 뇌 문화 두뇌 개발에 필요한 실제 지원의 부족으로 인해 엉뚱한 결과 (데이터 표시 되지 않음), 아마 제공 합니다.
그것은 신중 하 게 전에, 고통의 어떤 표시 든 지 감지 하 시간 경과 영상 중는 explant와 조직에 세포의 형태를 관찰 하는 것이 중요. 여기에 제시 된 실험에서 막 도약 mCD8::YFP의 표현 했다 뉴런의 본래 형태와 뇌 explant 실용적이 고 내내 건강 한 남아를 나타내는 예상 대로 당 TDT 세포질과 핵 감지 되었습니다. 화상의 기간입니다. Circadian rhythmicity는 최대 72 h에 대 한 하지만 그 두뇌 explants 최대 5 일 동안 신경 세포와 뇌 (데이터 표시 되지 않음)의 무결성을 악화 하지 않고 교양 수 있습니다 관찰. neurites 될 점이 나 버스트 뉴런의 세포 체,이 일반적으로 phototoxicity의 표시 하 고 쉽게 적응 현미경 설정에 의해 차단 하는 경우 그에 따라. 예를 들어 스마트 이득 및 탐지의 창, 작은 구멍 크기 증가 하면서 레이저 전력을 줄여 보십시오. 그러나, 일반적으로, 기자의 형광 강도 높은 강도 레이저 조명 없이 좋은 신호 대 잡음 비율의 영상을 얻기 위한 제한 요소 이다. 따라서, 기자, fluorophore, 그리고 기자 복사본 수의 선택의 설계는 생존 문제를 해결할 때 고려해 야 할 첫 번째 것 들. (여기에 제시 된 실험에서의 tdt 당 기자 4 복사본 사용 되었다.)
손상 된 뇌 문화의 다른 증상 경과 이미징 및 뇌 explant에서 액체의 움직임 동안 반구의 버스트를 포함합니다. 이것은 마이크로 구멍 두뇌의 해 부 동안 발생으로 인해입니다. 애벌레의 뇌에 연결 된 imaginal 디스크 제거 구멍의 주요 원천입니다, 따라서 우리가 좋습니다 그것.
생물 발광 영상에 형광 circadian 라이브 이미징의 장점은 높은 공간 해상도입니다. 또한, 리듬 기자 함께 세포 마커를 사용 하 여 쉽게 셀 형 특이성의 분석을 촉진 한다. 대조적으로, 생물 발광 우수한 시간적 해상도 우수한 신호 대 잡음 비율19,,2021있다. 그럼에도 불구 하 고, 전반적인 뇌 생물 발광에 의해 몇 군데 당 자전거 뉴런의 수가 아니다 우수한 우리의 방법8,,1921얻은 숫자에 비해. 대부분의 경우, 생물 발광19와 같이 우리의 방법으로 검출 하는 형광 기자의 리듬의 시계 ( 그림 2C참조), 동일한 클러스터 내에서 동기화 됩니다. 시계 신경 클러스터 사이의 위상 차이 형광 및 생물 발광 circadian 이미징8,,1921에서 관찰 되었다. 따라서, 모두 방법론 교양된 두뇌에 circadian 리듬을 관찰에 동등 하 게 유효한 되며 연구의 목적에 따라 개화와 생물 발광 사이 선택 하 여야 한다.
이 방법의 주요 기술적인 어려움 포함 단계입니다. 거꾸로 현미경 confocal 영상 빠른 검색에 대 한 호출 하는 프로토콜 때문에 조직에 깊은 이미징 하는 경우에 특히 뇌 조직에 산란 형광 탐지 감소, 뇌 explants 거치 되어야 한다로 가까이 커버 유리에 가능 합니다. 또한, 이미징 결과의 재현성의 뉴런의 z 위치의 일관성에 따라 달라 집니다. 따라서, 그것은 오리엔트 및 연습을 요구 한다 같은 방식으로, 항상 두뇌를 탑재 하는 것이 중요입니다. 신경 이미지를 클러스터에서 해부학 다른 위치, 다른 뇌 explant 방향으로 별도 실험을 실행 하는 데 필요한 수 있습니다. 두 광자 현미경 및 현미경 검사 법 조명 시트와 같은 조직, 경작 하지 않아도 깊은 조직 라이브 이미징에 대 한 대체 방법이 있습니다. 후자는 성공적으로 사용 되었습니다 라이브 초파리 두뇌22,23이미지 circadian 칼슘 역학. 그러나, 밝은 시트 현미경 confocal 현미경 검사 법 보다 낮은 공간 해상도 있으며 따라서 단일 셀 해상도 이미징에의 응용 도전 남아 있습니다.
요약 하자면,이 프로토콜 애벌레 뇌 explants 형광 기자 일 동안 시간 경과 이미지 수집 및 생물 학적 리듬의 정량 분석을 지 원하는 조건 하에서 간단한 문화 시스템을 결합 한. 있지만 위에서 설명한 특정 제한이 있습니다, 방법론은 애벌레와 성인 초파리 두뇌에서 다른 기자 들에 이미지에 맞게 고 추가 감도 해상도 증가 하도록 수정 수 있습니다. 예를 들어 axonal 계획 두뇌에 깊이 있는 또는 기공을 전송 2 광자 현미경35우리의 두뇌 explant 문화 기술을 결합 하 여 감지 될 수 있습니다. 그, 그것은 여전히 성인 뇌의 미토 콘 드리 아 등 세포의 라이브 이미지를 수행할 수 explants이 프로토콜 (데이터 표시 되지 않음)를 사용 하 여. 우리는 또한 약리 분석 실험에서 실험 솔루션의 응용 프로그램 목욕이이 프로토콜의 변화를 제시. 하나 수동으로 대체 약물을 배양 하거나 관류 챔버18,36을 사용 하 여 "펄스-체이스" 실험을 수행 하기 위해이 프로토콜을 확장할 수 있습니다.

Circadian 시계 도움이 지구의 24 시간 회전에 의해 생성 된 주기적인 환경 변화에 적응 하는 생물. 연동된 transcriptional 변환 피드백 루프는 일반적으로 종1에 걸쳐 circadian clock의 분자 기계를 기반이 됩니다. Circadian 심장 박 동기 회로 구성 포함 하는 클록의 명암 (LD) 등 통합 하는 매일의 과다의 리듬을 온도 사이클 환경 단서에 의해 전달 하는 일의 시간 정보를 통합 하는 신경 생리와 행동 프로세스2,3. 신경 입력 / 출력을 갖는 분자 리듬의 조정 circadian 회로 하지만 부분적 으로만 이해 하는 남아의 작업에 대 한 비판적으로 중요 하다.
초파리, 분자 시계의 코어에 클록/사이클 (CLK/CYC) heterodimer 활성화 기간 (당)의 전사와 영원한 (팀). 당 및 팀 복합물을 형성 하 고 그들은 CLK/CYC 그리고 결과적으로 그들의 자신의 전사의 transcriptional 활동을 억제 핵를 입력 합니다. Post-transcriptional 및 포스트 번역 상 규정 CLK/CYC-중재 전사와 당에 의해 억압 사이 지연이 발생할 / 팀, 24 h 분자 진동1,,34 년경의 세대를 보장 . 이러한 분자 시계 폼을 포함 하는 약 150 신경 성인 circadian 동작을 제어 하는 회로5를이동 합니다. 훨씬 더 간단한 아직 완전 하 게 작동 circadian 회로-5 복 부 측면 뉴런 (LNvs; 4 PDF 확실성 LNvs 및 하나의 PDF 음수가 LNv, 아래 참조), 2 등 쪽 신경 1 (DN1s)과 2 등 쪽 신경 2s (DN2s)-시계 뉴런의 3 그룹의 구성 된는 애벌레에 존재 하는 뇌6,7.
간단한 애벌레 circadian 회로 간 신경 통신 및 분자 시계 사이의 상호 작용을 공부 하는 우수한 모델을 제공 합니다. 우리의 새로 개발된 된 형광 기자 당-TDT를 단백질의 subcellular 위치 당의 수준, 모방을 사용 하 여 우리 하고자 했다 애벌레 circadian 회로 에 다른 시계 신경 하위 그룹에 분자 시계의 역학 특성 8. 또한, 4 LNvs 신경 레벨9,,1011circadian 리듬을 조절에 의해 생산 하는 neuropeptide 안료 분산 요소 (PDF)의 핵심적인 역할을 알고, 우리가 하 고 싶 었 직접 검사 분자 시계에 PDF의 효과입니다. 이 위해, 우리는 애벌레 뇌에서 리듬 시간 경과 confocal 현미경 검사 법에 의해 여러 일 동안 explant circadian 유전자 발현을 모니터링 하는 방법을 개발 했다. 프로토콜 당 TDT의 수준에 PDF 또는 다른 화합물의 효과 테스트 하는 약리 분석 실험에 대 한 적응도 했다. 따라서, 적응 뇌 explant 문화 약물 응용 프로그램에 액세스할 수 만들기, 시간적 해상도 증가 하 고 짧은 기간에 대 한 이미징 구성 되어 있습니다.
다른 발달 단계에의 초파리 두뇌의 비보 전 문화 이전 설립된12,13,,1415,16,17 되었습니다. ,18. 반면 이러한 프로토콜 이미징 다양 한 생물학 현상에 대 한 사용 되었습니다, 그들 중 일부는 단일 셀 해상도 이미지와 호환 되지 않는 또는 몇 시간에 대 한 문화를 지원 하지 않습니다. 초파리 에서 circadian 뉴런의 장기 라이브 영상을 수행 하는 대체 방법을 분자 리듬19,,2021 의 생물 발광 영상 등의 형광 이미징 칼슘 표시기 빛 시트 현미경22,23. 생물 발광 영상 더 높은 시간 해상도 얻을 수 있지만 가벼운 시트 현미경 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 적응 하실 수 있습니다 그들은 공간 해상도에 제한 되 고 특수 현미경 시스템 필요.
여기 설명 하는 방법은 여러 일 동안 단일 셀 해상도에서 전체 뇌 문화에 형광 신호를 시각화 하기 위해 지어진 다. 이 손쉬운 방법과 다양 한 교양 이미지 성인 비행 두뇌와 초파리 신경 생물학에 있는 많은 다른 문제를 연구 하는 약리 실험에 대 한 적응 될 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose &#34;suitable for insect cell culture&#34; whenever available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+) Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Ketoglutaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened</td>
			<td>BioConcept Ltd. Amimed</td>
			<td>2-01F30-I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH, pH 7.4</td>
			<td>E&#38;K Scientific Products</td>
			<td>EK-654011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from bovine plasma</td>
			<td>Calbiochem (Merck)</td>
			<td>341573-1GM</td>
			<td>CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9549</td>
			<td>CAUTION: Health Hazard, use gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH</td>
			<td>Chi Scientific</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes</td>
			<td>fisherscientific</td>
			<td>08-772A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) film</td>
			<td>Dupont</td>
			<td>200A Teflon FEP Film</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-well glass dissection dish</td>
			<td>Any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps, size 5, Dumont</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors</td>
			<td>Leica microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature control chamber</td>
			<td>Life Imaging Services</td>
			<td>The CUBE &#38; BOX temperature control system, custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top humidity controller</td>
			<td>Life Imaging Services</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software</td>
			<td>Leica microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUM-stack creation and 3D correction drift plugin</td>
			<td>ImageJ software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x iterative deconvolution</td>
			<td>AutoQuant and Imaris software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell resolution fluorescence live imaging of drosophila circadian clocks in larval brain culture

Circadian 맥 박 조정기 회로 리듬 행동과 생리 적인 출력 일 또는 밤 주기 등 환경 신호 조정 총괄. 각 맥 박 조정기 뉴런 내에서 분자 시계 유전자 발현, 기초 회로의 작동에 필수적인 리듬 신경 기능에에서 circadian 리듬을 생성 합니다. 맥 박 조정기의 다른 서브 클래스에서 개별 분자 발진기와 신경 신호와 상호 작용의 속성의 조사 circadian 맥 박 조정기 회로의 더 나은 이해를 생성 합니다. 여기, 우리 제시 시간 경과 형광 현미경 접근 시계 교양된 초파리 애벌레 두뇌의 신경에 있는 분자 시계를 모니터링 하기 위해 개발. 이 메서드는 단일 셀 해상도 유전자 인코딩된 형광 circadian 기자의 리듬의 여러 날 녹음을 수 있습니다. 이 설치 밀접 하 게 다양 한 화합물의 분자 시계 실시간 응답을 분석 하는 약리 조작 결합 될 수 있다. Circadian 리듬, 넘어 강력한 초파리 유전자 기술 함께에서이 다목적 방법 라이브 뇌 조직에서 다양 한 신경 분자 과정을 공부 하는 가능성을 제공 합니다.

여기, 우리가 애벌레 뇌 문화 비보 전 기자 식에 PDF 목욕 응용 프로그램의 라이브 이미징 결과에 circadian 형광 기자의 장기 기록의 대표적인 결과 보여줍니다.
비 방황 L3 유 충 분자 시계 기자 당 TDT와 UAS-mCD8::YFP Clk (856)-gal4 (그림 1C) LD. 두뇌에서 개입 했다 시계 신경 드라이버에 의해 구동 해 부 되었고 마지막 동안 장기 문화에 대 한 설정 그냥 사전 LD 주기의 단계 빛 어두운 단계 (그림 1A 와 2B). 시간 경과 영상 DD에서 수행 하 고 뇌 explants 64 h에 대 한 모든 2 h 몇 군데 있었다. 관심의 뉴런을 포함 하는 합계 스택 창조 되 고 배경 빼기8후 신경에 해당 하는 영역의 평균 형광 강도 측정 했다. 기자 표현의 rhythmicity를 결정 하려면 최대 엔트로피 스펙트럼 분석 (메사) 및 수동 검사 사용된8했다. Circadian 리듬의 기간을 표시 하는 두 개의 DN2s ~ (그림 2A, 2c, 및 영화 1) 26 h 당 TDT 수준에 여기에 표시 됩니다.
본질적으로 같은 문화 설치 (그림 1B)를 사용 하 여, 당 TDT의 표현에 neuropeptide PDF의 효과 연구 했다. 동일한 유전자 형의 방황 아닌 애벌레의 머리 위에서 설명한 대로 했다 해 부 ZT1에서 (Zeitgeiber 시간 1, 빛에 LD에서 후 1 시간) 또는 ZT13 (조명에서 후 1 시간). 애벌레를 포함 하는 튜브 즉시 얼음 인큐베이터에서가지고 간 후에 차게 했다. ZT13에서 튜브도 블루 빛에 노출을 피하기 위해 알루미늄 호 일에 포장 했다. 뇌 해 부 얼음에서 수행 하 고 해 부 두뇌 얼음에 보관 했다. ZT13에서 찍은 두뇌 가능한 알루미늄 호 일로 덮여 있었다. 따라서,이 절차는 자연 채광으로 조명 연구실에서 수행 되었다, 하지만 고분자 합성 및 대사에 빛 노출의 효과 최소 이었다. 두뇌는 초기 계획 데이터를 1 시간 간격으로 두 번 검사 되었다. PDF 또는 차량 (DMSO) 문화 매체에 추가 되었습니다 하 고 시간 경과 이미지 후속 6 헤 당 TDT에 대 한 모든 1 시간을 인수 했다 식 프로필 높아졌습니다 하루 종속의 시간 LNvs와 DN1s, 그리고 ZT13에서 PDF 추가 시 형광 강도 낮은 범위는 DN2s에 (그림 3)8.
이 결과 이미징 기술과 문화 방법을 여기에 설명 된 사용 당 TDT 리듬에서 눈에 띄는 phototoxicity, photobleaching 또는 초점 드리프트 없이 단일 셀 해상도의 녹화를 나타냅니다.
참고: 이미지 분석 했다 고 피지28를 사용 하 여 처리. 10 X 반복 deconvolution AutoQuant와 Imaris 수행 되었다. 시간 경과 이미지에 사소한 드리프트 ImageJ의 정확한 3D 드리프트 플러그인 수정 했다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57015/57015fig1.jpg"> 그림 1: L3 애벌레 두뇌와 두뇌 explant 문화 설치에 시계 뉴런의 해부학. (A 와 B) 뇌 문화 설치 장기 이미징 (A) 및 단기 이미징 (B) 약리 분석 실험의 회로도. (A), 진공 기름 (노란색)는 PTFE 멤브레인 연결할 유리 하단 접시의 플라스틱 부분에 적용 되었다. (C) ZT2에서 LD 최 L3 애벌레 뇌의 대표 이미지. 분자 시계 기자 당 TDT (마젠타) 표현 Clk (856)-gal4에 의해 구동 하는 UAS-mCD8::YFP(green) 이라고 표시 된 시계 뉴런에 표시 됩니다. L3에서 차별화 된 시계 뉴런의 3 그룹이 있다: 5 LNvs (를 포함 하 여 PDF를 표현 하지 않는다 5 LNv), 2 DN1s 및 2 DN2s, 흰색 화살촉으로 표시. 시계 신경 세포의 핵에 당 TDT 표현의 note YFP 부정 당 TDT 양성 세포는 명과 및 아직도 발전 시계 뉴런의 다른 하위 그룹. 눈금 막대 = 25 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57015/57015fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57015/57015fig2.jpg"> 그림 2: 장기의 대표적인 결과 라이브 이미징 애벌레 시계 뉴런의. (A) 교양된 뇌의 장기 시간 경과 영상에서 DN2s의 보기를 확대. 뇌 explants는 ZT11에서 해 부 LD 최 L3 애벌레에서 준비 되었다. 이미지 CT17에서 매 2 시간을 촬영 했다 (Circadian 시간 17, DD에서 벗어나 주관적 빛 후 5 h) dd. 결합 된 64 h에 대 한 당-TDT (마젠타색) 및 UAS-mCD8::YFP Clk (856)-gal4 (녹색)에 의해 구동의 이미지는 각 패널의 왼쪽에는 고 당-TDT 수준으로 표현 블루 그라데이션으로 heatmap 오른쪽에 있습니다. 눈금 막대 = 10 µ m. 만 표현, 이미지 3D 보정 드리프트와 10 X 반복 deconvolution 처리 했다. (B) 실험의 타이밍. (C) 상대 형광 강도 나타내는 그래프 정규화 t = 0의 두 DN2s (파란색과 빨간색). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57015/57015fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57015/57015fig3.jpg"> 그림 3: 약리 실험에 대 한 라이브 이미징의 대표적인 결과. LD 최 애벌레 머리 해 부 되었고 ZT1 또는 ZT13, 및 PDF에서 탑재 (2 µ M) 또는 DMSO는 ZT2 또는 ZT14에 적용 되었다. 두뇌 explants 당 TDT 식 시간 경과 현미경 매 시간 모니터링 했다. (해당 ZT1 또는 ZT13) 이미징의 시작 값으로 정규화 의미 형광 강도 ± SEM 표시 됩니다. 빨간색 화살표는 PDF 또는 차량 응용 프로그램을 (ZT2 또는 ZT14)의 시간을 나타냅니다. * p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001와 * * * p < 0.0001 여러 비교 Sidak의 보정으로 양방향 ANOVA에 의해. 32 LNvs, 18 DN1s 및 16 DN2s 최소 각 데이터 요소에 대 한 분석 했다. 이 그림은 참조8에서 수정 되었습니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57015/57015fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57015/57015movie1.jpg"> 영화 1: 애벌레 DN2 시계 뉴런의 장기 라이브 영상. 시간 경과 영화 교양된 애벌레 두뇌의 ZT11에서 해 부 그리고 dd. 확대 당 TDT와 UAS-mCD8::YFP Clk (856)-gal4에 의해 구동 단일 반구에 DN2s의 표시에 몇 군데. 이미지 64 헤 당 TDT에 대 한 모든 2 h (마젠타)을 인수 했다 및 YFP (녹색) 왼쪽에는 고 당-TDT 레벨 heatmap (블루 그라데이션)로 표시 오른쪽에 있다. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57015/MAX_10_Pos004_S001_stable_D_crop-combined(Converted).mov" target="_blank">하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>시 약</td>
			<td>농도</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="14">1. 혼합 시 약.</td>
			<td>KH2포4
</td>
			<td>4.18 m m</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>1.05 m m</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>0.7 m m</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>116 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>0.7 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>포도 당</td>
			<td>2 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>트 레 할 로스</td>
			<td>2 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Α-Ketoglutaric 산</td>
			<td>0.35 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fumaric 산 성</td>
			<td>60 μ g/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>금산</td>
			<td>0.6 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>호박 산</td>
			<td>60 μ g/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>효 모 추출 물</td>
			<td>2 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>열 비활성화 FCS</td>
			<td>20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>dH2O, 압력가 마로 소독</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">2. 소독 0.22 μ m 필터.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">3. 72 h. 보육에 대 한 어둠 속에서 25 ° C에서 세포 배양 세균 이나 곰 팡이 오염 없는 것으로 대 한 인큐베이터에서 품 어.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">4. 시 약을 추가 합니다.</td>
			<td>인슐린</td>
			<td>2 μ g/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>두번째-트리 스 pH 6.8, 0.22 μ m 필터와 소독</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>5. pH 6.8 6.9를 조정 합니다.</td>
			<td>NaOH (10 N)</td>
			<td>~ 8 방울</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">6. 0.22 μ m 필터와 소독.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">7. 약 5 ml 플래시를 수-80 ° c.에 LN2 저장소에 고정 Whithin 60 일 사용 하십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
참고: 큰 볼륨에 대 한 진공에 의해 필터 최고 병 소독, 그렇지 않으면 주사기 필터를 사용 하 여. 문화 후드에서 오픈 aliquots입니다. 단일 사용 합니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 샘 매체 (1x)의 초파리 뇌 문화에 대 한 준비. 문화 두뇌 explant에 매체입니다. 모든 단계는 매체의 인큐베이션을 제외한 문화 후드에서 수행 되어야 합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>시 약</td>
			<td>농도</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="8">1. 혼합 시 약.</td>
			<td>HEPES-코, pH 7.4</td>
			<td>99 m m</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>1.37 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>54mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2포4
</td>
			<td>1.7 m m</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2포4
</td>
			<td>2.2 m m</td>
		</tr>
<tr>
<td>포도 당</td>
			<td>33 m m</td>
		</tr>
<tr>
<td>자당</td>
			<td>438 m m</td>
		</tr>
<tr>
<td>압력가 dH2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">2. 0.45 μ m 필터와 소독.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">3. 4 ° C에서까지 저장할 6 개월.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
참고: 실험적인 사용을 위해: 압력가 dH2O와 X 1로 희석 하 고 진공으로 0.45 μ m 필터 최고 병 또는 필터 주사기 소독. 4 ° c.에 계속 오픈 문화 후드, 여러 사용.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: DSS의 준비 (10 배). 염 분 솔루션 초파리 두뇌를 해 부입니다. 문화 후드에서 준비 합니다.

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Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

이 프로토콜의 목표는 ex vivo 초파리 애벌레 뇌 문화를 장기 형광 시간 경과 영상 분자 circadian 리듬을 모니터링 하기 위해 최적화 설정입니다. 이 방법의 약리학 분석 응용 프로그램 또한 토론 된다.

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

single-cell-resolution-fluorescence-live-imaging-drosophila-circadian

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

7.5K 조회수.  University of Geneva. 이 프로토콜의 목표는 ex vivo 초파리 애벌레 뇌 문화를 장기 형광 시간 경과 영상 분자 circadian 리듬을 모니터링 하기 위해 최적화 설정입니다. 이 방법의 약리학 분석 응용 프로그램 또한 토론 된다.

비디오: Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral line-widths and allows high-resolution spectra to be obtained from extracts, intact cells, cell cultures, and more importantly intact tissue to investigate relationships between metabolites and cellular processes. In vivo HRMAS 1H-MRS studies have yet to be reported in the live fruit fly Drosophila melanogaster. Drosophila, as a simpler genetic organism, allows the multiple biological functions and various evolutionarily conserved signaling pathways to be examined at the whole organism level and it is a useful model for investigating genetics and physiology. To this end, we developed and implemented an in vivo HRMAS 1H-MRS method to investigate live Drosophila at 14.1 T. Here, we outline an HRMAS 1H-MRS protocol for the molecular characterization of Drosophila with a conventional MR spectrometer equipped with an HRMAS probe. This technique is a novel, in vivo, non-destructive Drosophila metabolite measurement approach, which enables the identification of disease biomarkers and thus may contribute to novel therapeutic development.

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

This technique enables the use of high-resolution magic angle spinning proton MR spectroscopy (HRMAS 1H-MRS) for molecular characterization of live Drosophila melanogaster with a conventional 14.1 tesla spectrometer equipped with an HRMAS probe.

라이브의 자기 공명 분광학 Drosophila melanogaster 매직 앵글 스피닝를 사용하여

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

연구

신경과학

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

3 애벌레 Segmental 신경의 시각화 차 Instar Drosophila 애벌레 준비

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

의 형태학의 분석 Drosophila</em유전 모자이크 사용하기> 애벌레 주변 감각 신경 세포의 Dendrites 및 Axons

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of existing mouse lines for genetic cell lineage tracing: a tamoxifen-inducible Cre line and a Cre reporter line expressing dsRed upon Cre-mediated recombination. By using a relatively low level of tamoxifen, we were able to induce recombination in a small number of cells, permitting us to follow individual cell divisions. Additionally, we observed the transcriptional response to Sonic Hedgehog (Shh) signaling using an Olig2-eGFP transgenic line 1-3 and we monitored formation of cilia by infecting the cultured slice with virus expressing the cilia marker, Sstr3-GFP 4. In order to image the neuroepithelium, we harvested embryos at E8.5, isolated the neural tube, mounted the neural slice in proper culturing conditions into the imaging chamber and performed time-lapse confocal imaging. Our ex vivo live imaging method enables us to trace single cell divisions to assess the relative timing of primary cilia formation and Shh response in a physiologically relevant manner. This method can be easily adapted using distinct fluorescent markers and provides the field the tools with which to monitor cell behavior in situ and in real time.

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Here we develop the tools necessary for ex vivo live imaging to trace single cell divisions in the mouse E8.5 neuroepithelium

생체 마우스 Neuroepithelium에서 단일 세포 분열의 라이브 영상

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and medical applications. Strengths of fluorescence include its sensitivity, specificity, and compatibility with live imaging. Unfortunately, conventional forms of fluorescence microscopy suffer from one major weakness, diffraction-limited resolution in the imaging plane, which hampers studies of structures with dimensions smaller than ~250 nm. Recently, this limitation has been overcome with the introduction of super-resolution fluorescence microscopy techniques, such as photoactivated localization microscopy (PALM). Unlike its conventional counterparts, PALM can produce images with a lateral resolution of tens of nanometers. It is thus now possible to use fluorescence, with its myriad strengths, to elucidate a spectrum of previously inaccessible attributes of cellular structure and organization.
Unfortunately, PALM is not trivial to implement, and successful strategies often must be tailored to the type of system under study. In this article, we show how to implement single-color PALM studies of vesicular structures in fixed, cultured neurons. PALM is ideally suited to the study of vesicles, which have dimensions that typically range from ~50-250 nm. Key steps in our approach include labeling neurons with photoconvertible (green to red) chimeras of vesicle cargo, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a high-resolution PALM image. We also demonstrate the efficacy of our approach by presenting exceptionally well-resolved images of dense-core vesicles (DCVs) in cultured hippocampal neurons, which refute the hypothesis that extrasynaptic trafficking of DCVs is mediated largely by DCV clusters.

We describe how to implement photoactivated localization microscopy (PALM)-based studies of vesicles in fixed, cultured neurons. Key components of our protocol include labeling vesicles with photoconvertible chimeras, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a super-resolution image.

신경 밀도 코어 소체의 수퍼 - 해상도 이미징

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

단일 셀 해상도 형광 애벌레 뇌 문화에 살고 있는 초파리 Circadian Clock의 이미징

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