이 프로토콜은 NRF-2015R1A2A1A01003410 사역의 과학, 정보 통신, 미래 계획, 한국에서 교부 금에 의해 지원 됩니다.

모든 실험 동물 관련 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 아주 대학의과 대학에 의해 승인 되었다.
1. 문화 준비 해리 성인 DRG 신경의
<ol><li>문화를 설정 하기 전에 미리 폴 리-D-리와 laminin 6 잘 플레이트 코트. 밤새 0.01% 폴 리-D-리 또는 2 h 동안 37 ° C에서 4 ° C에서 6 잘 플레이트를 품 어. 다음, 증류수로 두 번 접시 세척.</li>
	<li>실 온에서 2 h 3 µ g/mL의 농도에서 laminin 솔루션 접시를 품 어 그리고 증류수와 두 번 접시를 세척. 1 시간 이상 실 온에서 접시를 건조.</li>
	<li>압축된 CO2 가스 실린더에 연결 된 투명 한 공동2 챔버에 마우스 안락사 Incise 수술 칼 날 척추 열을 overlying 피부와 척추 뼈를 양측 paravertebral 근육 해 부. 척추 뼈는 Drg 완전히 노출 될 때까지 꼼꼼하게 좁은 밀고 수술 rongeur를 사용 하 여 제거 합니다. 참고: 성인 Drg 신경 성인 C57BL6 남성 쥐 8 주 12 주 오래 된 사이에서 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>Iridectomy 위와 뾰족한 집게 해 현미경을 사용 하 여 c 1 수준까지 s 1에서 양자는 Drg를 제거 합니다. Schwann 세포 또는 섬유 아 세포의 오염을 최소화 하기 위해 Drg에서 완전히 뿌리를 잘라 하려고 합니다.</li>
	<li>60 mm 페 트리 접시까지 모두는 Drg 수집 5 mL의 찬 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 얼음에를 포함 하는 해 부 Drg를 저장 합니다. 참고: 그것은 중요 최대한 빨리는 Drg를 해 부하입니다. 한 마우스에서 모든 Drg의 컬렉션은는 안락사 후 30 분 30 분 보다 더 오래 걸릴 한다는 Drg 수집 중지 하 고 고 단계를 진행 하는 경우에 여전히 Drg 나머지는 수 없습니다.</li>
	<li>1.5 mL Eppendorf 관 푸른 피 펫 팁 (1000 µ L)을 사용 하 여 잘라 끝에 Drg를 전송. 미니 원심 분리기를 사용 하 여 몇 초 동안 빠른 스핀 후는 DMEM을 제거 합니다. DMEM 125 U/mL 유형 사이 콜라 포함의 1 mL을 추가 하 고 37 ° C 배양 기에서 트위스터 셰이 커를 사용 하 여 부드러운 회전 (35-40 rpm) 90 분에 대 한 튜브를 품 어. 테이프를 사용 하 여 통 바닥에 튜브를 고정 하 고</li>
	<li>콜라-포함 된 DMEM 버립니다 하 고 신선한 DMEM 1 mL를 추가 합니다. 부동 Drg 완전히 바닥에 가라앉 고 조직 파편과 DMEM 제거 될 때까지 기다립니다. 이 세척 단계 6 번 이상 반복 합니다. 참고:는 상쾌한을 완전히 삭제 하지 마십시오. 수 표면에 뜨는 DMEM와 어떤 Drg를 제거 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>잘라 끝을 가진 파란 피 펫 팁 (1000 µ L)을 사용 하 여 15 mL 원뿔 튜브에는 Drg를 전송. 그런 다음 아래로 부드럽게 플라스틱 적어도 15 번 블루 팁 (1000 µ L)를 사용 하 여 균질 세포 현 탁 액을 만들기 위해. 거품을 만드는 것을 방지 하 고 피 펫 팁 원뿔 튜브의 바닥을 터치 하지 않으려고.</li>
	<li>239 x g 3 분에 튜브 원심 하 고 신중 하 게 떠 있는 잔해와 함께 상쾌한 삭제. Neurobasal 매체 B27 보충의 1 mL을 추가 (2.0 %v / v) 5 10 배를 위아래로 부드럽게 pipetting으로 셀 펠 릿을 resuspend 하 고.</li>
	<li>세포 현 탁 액 50 mL 원뿔 튜브 위에 겹쳐 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 전달 합니다. 2 분 동안 기다립니다 그리고 Neurobasal/B-27 매체 피 펫 컨트롤러를 사용 하 여 여과기에 붓는 다.</li>
	<li>모든 수집된 DRG 뉴런 (한 마우스에서 대략 2 x 106 DRG 신경 총) 6 잘 플레이트의 2 개의 우물에 접시 한 성인 마우스에서 DRG 신경 6 잘 플레이트에서 두 개의 우물을 커버. 다음 37 ° C에서 CO2 인큐베이터에 접시를 두고는 대 식 세포 공동 문화 때까지.</li>
</ol>2. 공동 문화 P rimary 복 막 대 식 세포의 A 셀 문화 삽입에
참고: 해리 DRG 뉴런의 초기 도금 후 4 h 공동 문화 확립
<ol><li>기본 복 막 대 식 세포는 성인 C57BL6 남성 쥐 8 주 12 주 오래 된 사이에서 준비 된다. CO2 챔버에 동물 안락사 복 부 피부를 섬세 하 게 incise 하 고, 복 막 게 액체의 누설을 방지 하기 위해 복을 절단 하지 않도록.</li>
	<li>펑크 22 G 바늘과 주사기를 사용 하 여 복 막 및 복 막 구멍에 얼음 처럼 차가운 인산 염 버퍼 사린 (PBS)의 10 mL를 주입. 부드럽게 마사지 1-2 분 복. 다음, 바늘을 꺼내 바늘 찔린 사이트 통해 PBS에 밖으로 짜 내 고 50 mL 원뿔 튜브에 게 액체를 수집. 참고: 사용 하기 전에 PBS의 추위를 유지 하기 위해 얼음에 주사기를 넣어.</li>
	<li>239 x g 작은 세포질 분 대에 4 ° C에서 10 분에 게 액체 원심 실 온에서 3 분에 대 한 적혈구 (RBC) 세포의 용 해 버퍼의 3 mL와 펠 릿을 resuspend. 그런 다음 다시 4 ° c.에서 10 분 동안 239 x g에 세포 현 탁 액을 원심 PBS의 3 mL와 펠 릿을 resuspend 하 고 모든 나머지 RBC 세포의 용 해 버퍼를 제거 하는 다시 세포 현 탁 액을 원심. 참고: RBC 세포의 용 해 버퍼 완전히 제거 되었는지 확인 합니다. 그렇지 않으면 나머지 RBC 세포의 용 해 버퍼 배양된 세포에 독성이 있을 수 있습니다.</li>
	<li>Neurobasal/B-27 매체의 1 mL에 수송과 셀 resuspend 플레이트 모든 수집 된 대 식 세포 (3 × 106 6 x 106 세포의 총) 세포 배양에의 절반 4.2 cm2, 해리 DRG의 우물 위에 배치의 효과적인 지역으로 삽입. 참고: 공동 문화 기간 동안 세포 Neurobasal/B-27 신경 문화 매체에서 성장 된다. 이 조건 하에서 세포의 적절 한 생존 확인 됐다.</li>
</ol>3. Db-캠프 및 Macrophage CM의 컬렉션의 치료
참고: 시작 신경 macrophage 공동 문화 후 db 캠프 치료 4 h.
<ol><li>신경 대 식 세포 공동 문화를 100 µ M db 캠프 솔루션의 2 µ L를 추가 합니다. 제어 실험에 대 한 PBS의 동일한 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>24 시간 후 빈 잘 동일한 6 잘 플레이트에 대 식 세포 배양의 1ml 채워 놓습니다. 대 식 세포 배양 매체와 빈 잘 신경 macrophage 공동 문화에 셀 문화 삽입 전송. 매체를 변경 하지 않고 72 h에 대 한 동일한 조건 하에서 세포를 유지. 참고: 우리는 수 있도록 CM 컬렉션 중 대 식 세포 배양의 1ml만 집중 CM 추가 합니다. CM 수집 하는 동안 필요한 경우, 우리는 추가 삽입 내 대 식 세포를 표지에 더 많은 것.</li>
	<li>72 h 후 macrophage CM 세포 구성 요소를 제거 하려면 5 분 동안 239 x g에서 원심. 어떤 나머지 세포질 파편 든 지 제거 하는 0.2 µ m 필터에는 상쾌한 통과. 사용까지-70 ° C에서 수집 된 CM을 저장 합니다.</li>
</ol>4. Neurite 결과 분석 결과 수집 cm
<ol><li>별도 성인 DRG 신경 문화를 설정 하기 전에 미리 1.1 및 1.2에 설명 된 동일한 절차에 따라 8-잘 챔버 슬라이드 코트.</li>
	<li>Neurobasal 매체 B27 보충에 천연된 성인 DRG 뉴런을 얻을 1.10 1.3에서 설명한 동일한 방법을 사용 하 여. 미리 코팅된 8 잘 챔버 슬라이드에 잘 당 5 x 104 의 세포를 플레이트.</li>
	<li>셀 아래에 연결할 수 있도록 2 h 37 ° C 배양 기에서 챔버 슬라이드를 놓습니다. 그런 다음 37 ° c.에 preheated 해 동된 CM 문화 매체를 바꿉니다 참고: 문화 매체를 제거 하는 때 8 잘 챔버 슬라이드의 하단을 터치 하지 않도록 주의 하 고 수집 된 CM을 추가.</li>
	<li>초기 도금 후 15 h 매체를 제거 하 고 PBS 가진 셀을 한 번 씻어. 다음, 웰 스, 얼음 4 %paraformaldehyde 솔루션의 200 µ L을 추가 하 고 셀 paraformaldehyde 솔루션 4 ° C에서 20 분을 품 어 참고: neurite 결과 분석 결과 대 한 DRG 신경 문화 15 h를 정확 하 게 제한 해야 합니다. 이 조건 하에서 거기 아무 감지할 neurite 결과가입니다.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 PBS로 세 번 세척 하 고 10% 차단 수행 정상 염소 혈 청 (NGS) 0.1% 트리톤-X 30 분에 대 한 1 차적인 항 체 (안티-Tuj-1) 솔루션 10% 희석 고정된 셀을 품 어 룸에서 4 h (1 µ g/mL의 농도)에서 NGS 온도 또는 4 ° c.에서 하룻밤</li>
	<li>PBS로 세 번 세척 하 고 실 온에서 2 h에 대 한 2 차 항 체 (염소-안티 마우스) 솔루션 셀을 품 어. 다음, PBS로 두번 세척 하 고 장착 솔루션을 사용 하는 coverslip (24 × 50 m m)와 문화 슬라이드를 탑재.</li>
	<li>Neurite 결과 시각화 하는 형광 현미경을 사용 하 여 이미지를 가져가 라.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Donnelly, D. J., Popovich, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+its+role+in+neuroprotection,+axonal+regeneration+and+functional+recovery+after+spinal+cord+injury.">Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).</li><li>Festoff, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+neuroprotects,+reduces+microgliosis,+and+inhibits+caspase+protease+expression+early+after+spinal+cord+injury.">Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury.</a> J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).</li><li>Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditioning+injury-induced+spinal+axon+regeneration+fails+in+interleukin-6+knock-out+mice.">Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice.</a> J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).</li><li>Cai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cyclic+AMP+controls+the+developmental+loss+in+ability+of+axons+to+regenerate.">Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate.</a> J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).</li><li>Neumann, S., Woolf, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+dorsal+column+fibers+into+and+beyond+the+lesion+site+following+adult+spinal+cord+injury.">Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury.</a> Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 공동 문화 시스템의 생성에 대 한 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 그것은 마우스 DRG 신경 및 복 막 대 식 세포가 신선한 준비는 되었는지 확인 하는 것이 중요 하 고 건강 한입니다. 우리 모든 Drg의 해 부 했다 30 분 이상 CM의 저하 neurite 결과 활동을 경험 했다. 또한, 복 막 대 식 세포 구성 요소 혈액의 오염 또한 CM에 neurite 결과 활동의 감소에 지도 했다. Db-캠프로 강력한 신경-대 식 세포 상호 작용을 유도 하기 위해 철저 한 세척 것도 조직 파편의 완전 한 제거 및 잠재적으로 남아 있는 세포 독성의 제거를 보장 하기 위해 중요 한 단계 콜라 또는 RBC 세포의 용 해 버퍼 등의 구성 요소. 또 다른 지점을 강조 되는 Drg에 연결 된 뿌리 제거 되어야 가능한 이다. 남은 뿌리의 스텁을 DRG 신경 문화에 Schwann 세포의 오염을 증가 했다. Schwann 세포는 결과 혼동할 지도 모른 문화에 neurotrophic 요인의 높은 금액을 생성할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 천연된 세포에 잘 접시의 하단에 도금 하는 DRG 뉴런에서 분리 된 셀 문화 삽입 도금 했다. 우리의 이전 연구 (2 개의 세포 유형 사이 신체 접촉 허용) 직접 공동 문화에서 수집 된 CMs 사이의 neurite 결과 활동의 정도에 큰 차이 보여주지 않았다 두 셀 형식으로 공동 문화 구분을 세포 배양11을삽입 합니다. 이 결과 신경 세포와 대 식 세포는 서로 의사 소통 아닌 직접적인 물리적 접촉에 의해 어느 셀 형식에서 발표 용 해 분자를 통해 표시 됩니다. 그것은 CCL2, DRG 뉴런에서 분 비 되는이 공동 문화 모델14프로 재생 형으로 대 식 세포 활성화에 대 한 책임을 표시 했다. 따라서, 우리의 공동 문화 시스템 프로 재생 세포의 활성화를 중재 하는 자세한 세포 신호 설명을 수 있습니다.
문화가이 프로토콜에 neurite 결과 분석 결과 중 정확 하 게 15 h로 제한 했다. 파일럿 실험에서 우리는 여러 다른 문화 시간을 검사 하 고 제어 조건 (15h)에 neurite 결과의 최소 범위와 매우 강력한 neurite 결과 db 캠프로 치료 하는 CM으로 달성 했다 발견. 마우스 DRG 신경 하지 preconditioned 경우이 기간 내 어떤 중요 한 neurites는 성장 하지 않습니다. 그러나 DRG 뉴런 15 h 이상 교양 하는 경우, 그들은 제어, neurite 결과에 db 캠프 취급 CM의 영향 애매 한 것이 아니라 preconditioned 상태 에서도 어느 정도의 neurite 결과 표시 시작. 유사한 결과 쥐 DRG 뉴런을 사용 하 여 이전 연구16에 neurite 결과 분석 결과에서 보고 되었다.
일부 이전 연구 프로 재생 형7,9대 식 세포를 활성화 하 zymosan, 효 모 세포 벽 준비를 사용. 그러나, 대 식 세포 자극된 zymosan 프로 재생 분자 뿐만 아니라 세포 독성 요인 발표. CM zymosan 치료 젤 여과 크로마토그래피에 의해 분리 되었다 대 식 세포에서 단백질 구성 요소 macrophage 파생 요소 ≥ 30 kDa 했다 세포 독성 요인 ≤ 30 kDa 승진 축 삭 재생7. 또한, 신경 세포와 axons9의 명백한 죽음 zymosan 척수에 주입 될 수 있습니다. 비교에서는, 프로 재생 세포를 생성 하기 위해 우리의 프로토콜은 표시 이전 보다 더 생리 zymosan를 사용 하 여. 사실, DRG 뉴런에 db 캠프 주입 성장 축 삭 세포 손상17,18에 부상 보고서 없이 중앙 지점 다음에 자신의 능력 향상. 우리의 실험의 시리즈를 통해 우리는 결코 db 캠프 취급 CM의 응용 프로그램을 다음과 같은 문화에서 DRG 신경 밀도의 어떤 중요 한 감소를 관찰 했습니다. 우리는 우리의 프로토콜 동시 neurotoxicity 없이 전적으로 프로 재생 세포를 생산 하기 위해 우리 수 있습니다 추측 하고있다. 따라서, 프로토콜 및 실험 모델 여기 유용한 프로 재생 세포의 분자 서명을 식별 하 고 프로 재생 표현 형 진화는 어떤 메커니즘에 의해 이해 될 것 이라고 보도 했다.

다양 한 연구는 척수 또는 뇌의 부상 후 CNS 축 삭 재생을 강화 하고자 했다. 염증 성 반응, 신 경계에 상해를 필연적으로 동반 해로운 결과1,2에 지도 하는 보조 병 적인 프로세스에 참여 하도록 전통적으로 생각 된다. 실제로, 염증 반응 억제 수 있습니다 methylprednisolone 급성 척수 부상3에 대 한 유일한 승인 된 치료입니다. 그러나, 최근 연구 제공 증거 대 식 세포, 대표적인 염증 성 세포 유형, 재생 또는 부상된 신 경계4,,56의 수리에 참여할 수 있습니다. 예를 들어 다음과 같은 렌즈 부상 생산 프로 재생 분자 망막 신경 절 신경7,8의 재생을 촉진 하는 대 식 세포 침투. 또한, 이식된 DRG 신경 축 삭 성장 세포 zymosan9에 의해 활성화 된 지역까지 증가. 또한, 병 변 사이트에서 대 식 세포는 부상된 주변 신경10성장 허용 환경을 만들 수 있습니다.
우리의 일은 또한 대 식 세포는 인접 한 뉴런의 축 삭 재생의 용량에 기여할 수 있는 강력한 증거 제공. 우리 느 루트 신경 절 (DRG)에서 대 식 세포의 활성화 했다 나타났습니다 DRG의 향상 된 재생 능력에 필수적인 감각 신경을 따라 늘어진 주변 신경 상해11. 비슷한 연구 독립적으로 다른 실험실12에서 보고 되었다. 우리는 또한 dibutyryl 축 삭 재생13의 용량을 강화 하는 잘 알려진 분자 인 순환 앰프 (db-캠프)의 intraganglionic 주입 대 식 세포의 활성화를 유발을 보여주었다. 대 식 세포의 비활성화 폐지 neurite 결과 활동에 db 캠프의 효과. 후속 작품 부상 유도 식 CCL2의 뉴런에 프로 재생 형14,15대 식 세포를 자극 하는 신호를 확인.
위의 실험 결과 바탕으로, 우리는 체 외에서 모델 닮은 Drg preconditioning 부상 모델11,14다음에 발생 하는 분자 이벤트를 설립 했다. 이 모델에서는 db-캠프 프로 재생 형으로 대 식 세포의 활성화에 이르게 신호 세포 도출 신경 macrophage 공동 문화에 적용 됩니다. 여기, 우리는 우리가 분자 요인 홍보 neurite 결과 (그림 1)을 분 비 하는 세포를 생성할 수 있습니다 자세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 실험적인 모델 세포 자극 하 하거나 신 경계에 상해 다음 축 삭 재생을 지원 하기 위해 유도 수 개념을 보여 줍니다. 우리의 모델 프로 재생 세포의 활성화에 지도 하는 세포 신호 메커니즘을 공부에 유용할 것 이다.

<table><tbody><tr><td>Cell culture insert transparent PET membrane 0.4&amp;mu;m pore size</td><td>Corning,Falcon</td><td>353090</td><td>Transparent PET membrane with 0.4-&amp;mu;m pore size, for 6-well plate</td></tr><tr><td>70-&amp;mu;m nylon cell strainer</td><td>Corning, Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>8-well culture slide</td><td>Biocoat</td><td>354632</td><td>with a uniform application of Poly-D-Lysine</td></tr><tr><td>Red blood cell lysis buffer</td><td>Qiagen</td><td>158904</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from &lt;em&gt;Clostridium histolyticum&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>21103-049</td><td>Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin</td></tr><tr><td>B-27 supplement, serum free</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>17504-044</td><td>extracellular solution</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine Hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 3&#039;, 5&#039;-cyclic monophosphate, N&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;,O2&#039;-dibutyryl-, sodium salt</td><td>Merck Millipore Corporation, Calbiochem</td><td>28745</td><td></td></tr><tr><td>10% Normal Goat Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Daejung Chemical and Metal Co</td><td>8566-4405</td><td></td></tr><tr><td>Anti &amp;beta; III tubulin (Tuj-1)</td><td>Promega Corporation</td><td>G7121</td><td>Mouse monoclonal antibody</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting stereomicroscope</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Twist shaker</td><td>FINEPCR</td><td>Tw3t</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus America Inc</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>VWR International, Hyclone</td><td>SH30919.03</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Pearson Rongeurs</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>16021-14</td><td>Stainless steel, 14cm, curved, single joint action</td></tr><tr><td>Fine Scissors - Tungsten Carbide &amp;amp; ToughCut</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>14558-11</td><td>sharp, serrated</td></tr><tr><td>Dumont #7 Forceps</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>11272-30</td><td>Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved</td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>FST (Fine Science Tools)</td><td>15000-00</td><td>straight, 3mm cutting-edge, sharp</td></tr><tr><td>Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge</td><td>Artisan Technology Group</td><td>DW-41</td><td>Input Voltage: 115VAC</td></tr></tbody></table>

neuron-macrophage co-cultures to activate macrophages secreting molecular factors with neurite outgrowth activity

세포 재생 또는 손상 신경 복구에 참여할 수 있는 강력한 증거가 있다. 여기, 우리 세포 생산 조절 매체 (CM) neurite 결과 촉진 유도 된다 프로토콜을 설명 합니다. 성인 지 루트 신경 절 (DRG) 뉴런 심하게 해리 하 고 도금. 뉴런 안정적으로 연결 하 고, 후 복 막 대 식 세포는 잘 동일한 중첩 셀 문화 삽입에 공동 경작. Dibutyryl 순환 앰프 (db-캠프) 후 세포 배양 삽입 대 식 세포를 포함 하는 24 시간에 대 한 공동 문화에 적용 됩니다 다른 잘 CM 72 h에 대 한 수집을 이동 합니다. 별도 성인 DRG 신경 문화에 적용 될 때 db-캠프로 치료 공동 문화에서 CM 강력한 neurite 결과 활동을 전시 한다. 혼자 단일 셀 형식의 구성 된 db 캠프 대우 문화에서 얻은 CM, DRG의 신경 또는 복 막 대 식 세포, neurite 결과 활동을 전시 하지 않았다. 이 신경 세포와 세포 사이의 상호 작용은 CM에 neurite 결과 활동 분자 요소를 은닉 하는 세포의 활성화를 위한 불가결 하지 나타냅니다. 따라서, 우리의 공동 문화 패러다임 프로 재생 형으로 부여를 대 식 세포를 자극 하 신경-대 식 세포의 상호 작용에서 세포 신호 공부 유용할 또한.

우리 세포 neurite 결과 활동 분자 요인 은닉 할 수 생성할 수 있는 프로토콜을 설명 합니다. 대 식 세포 CM db 캠프로 치료 공동 문화에서 얻은 강력한 neurite 결과 별도 DRG 신경 문화 (그림 2A)에 적용 될 때 귀착되는. 비교에서는, PBS 처리 공동 문화에서 얻은 CM는 우리의 15 h 문화 기간 (그림 2B)에 neurite 결과 유도 하지 않았다. Db-캠프는 혼자 대 식 세포와 문화에 처리 됩니다, CM이이 조건에서 얻은 neurite 결과 (그림 2C) 지원에 효과가 되지 않았습니다. 이것은 신경-대 식 세포 상호 작용은 필수 proregenerative 용량으로 부여를 대 식 세포를 자극 하는 제안. 우리는 또한 CM db 캠프 치료 신경 전용 문화에서 얻은 고 아무 neurite 결과 (그림 2D) 테스트.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56920/56920fig1.jpg"> 그림 1: 회로도를 절차를 보여주는 중간 포함 neurite 결과 활동 조절. 성인 DRG 뉴런 (각 음 마다 2 x 106 셀) 4 h에 대 한 교양. 다음, 복 막 대 식 세포 교양, 삽입에는 DRG에 뉴런 경작 했다 잘 위에 있습니다. 4 h 후 도금, PBS 또는 dibutyryl 캠프 처리 됩니다. 24 시간 배양 후 삽입 잘 전송 됩니다 약 1 ml 매체 가득 다른 잘. 다음은 전송 잘 incubated 72 h에 대 한. 그런 다음 incubated 바른된 매체 (CM) 수집 됩니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56920/56920fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56920/56920fig2.jpg"> 그림 2: neurite 결과 분석 결과 사용 하 여의 대표적인 결과 다양 한 조건에서 얻은 매체 조절. (A, B) 성인 DRG 신경 했다 해리 심하게 정확 하 게 15 h. 도금 후 2 시간에 대 한 교양, 문화 매체 신경 macrophage 공동 문화 중 PBS (A)와 치료에서 얻은 조건 매체 (CM)에 대체 되었다 또는 dibutyryl 캠프 (db-캠프) (B). Db-캠프로 치료 CM만 강력한 neurite 결과 활동 전시. (C, D) CM 어느 대 식 세포 (C)으로 구성 된 문화에서 얻은 또는 신경 (D) 혼자 db 캠프로 취급 했다 neurite 결과 지원 하지 않았다. 눈금 막대 표시 200 µ m. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56920/56920fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

신경 대 식 세포 공동 문화 Neurite 결과 활동 분자 요소를 은닉 하는 세포를 활성화 하

현재 프로토콜 neurite 결과 홍보 하는 분자 요인 출시 용량 부여 배양된 세포를 자극 하는 실험 절차를 제공 합니다. 치료 신경 macrophage 공동 문화 캠프의 강한 neurite 결과 활동을가지고 바른된 매체를 생산 하는 세포를 유도 합니다.

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

neuron-macrophage-co-cultures-to-activate-macrophages-secreting

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K 조회수.  Ajou University School of Medicine. 현재 프로토콜 neurite 결과 홍보 하는 분자 요인 출시 용량 부여 배양된 세포를 자극 하는 실험 절차를 제공 합니다. 치료 신경 macrophage 공동 문화 캠프의 강한 neurite 결과 활동을가지고 바른된 매체를 생산 하는 세포를 유도 합니다.

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Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer growth and metastasis. Paracrine signals can involve cell-cell contact between different cell types, such as PD-L1 expressed on the surface of tumors interacting directly with PD-1 on the surface of T cells, or the secretion of ligands by a tumor cell to affect an immune cell. Here we describe a co-culture method to interrogate the effects of tumor-secreted ligands on immune cell (macrophage) activation. This straightforward procedure utilizes commercially available 0.4 &#181;m polycarbonate membrane permeable supports and standard tissue culture plates. In the process described, macrophages are cultured in the upper chamber and tumor cells in the lower chamber. The presence of the 0.4 &#181;m barrier allows for the study of intercellular signaling without the confounding variable of physical contact, because the two cell types share the same medium and exposure to paracrine ligands. This approach can be combined with others, such as genetic alterations of the macrophage (e.g., isolation from genetic knock-out mice) or tumor (e.g., CRISPR-mediated alterations) to study the role of specific secreted factors and receptors. The approach also lends itself to standard molecular biological analyses such as quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) or Western blot analysis, without the need for flow sorting to separate the two cell populations. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) can similarly be utilized to measure secreted ligands to better understand the dynamic interaction of cell signaling in the multiple cell type context. Duration of co-culture can also be varied for the study of temporally regulated events. This co-culture method is a robust tool that facilitates the study of tumor-secreted signals in the immune context.

Here, we present a method using permeable membrane supports to facilitate the study of non-contact paracrine signaling used by tumor cells to suppress the immune response. The system is amenable to studying the role of tumor-secreted factors in dampening macrophage activation.

투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

연구

암 연구학

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

신경과학

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

다중 구획 CNS 뉴런 - glia 공동 문화 Microfluidic 플랫폼

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

생물학

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

치과 펄프 파라크린 신호에 대한 응답으로 노이라이트 의 성장을 연구하는 공동 문화 방법

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

발생학

Co-Culturing Microglia and Cortical Neurons Differentiated from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The ability to generate microglia from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) provides new tools and avenues for investigating the role of microglia in health and disease. Furthermore, iPSC-derived microglia can be maintained in co-culture with iPSC-derived cortical neurons, which enable investigations of microglia-neuron interactions that are hypothesized to be dysregulated in a number of neuropsychiatric disorders. Human iPSCs were differentiated to generate microglia using an adapted version of a protocol developed by the Fossati group, and the iPSC-derived microglia were validated with marker analysis and real-time PCR. Human microglia generated using this protocol were positive for the markers CD11C, IBA1, P2RY12, and TMEM119, and expressed the microglial-related genes AIF1, CX3CR1, ITGAM, ITGAX, P2RY12, and TMEM119. Human iPSC-derived cortical neurons that had been differentiated for 30 days were plated with microglia and maintained in co-culture until day 60, when experiments were undertaken. The density of dendritic spines in cortical neurons in co-culture with microglia was quantified under baseline conditions and in the presence of pro-inflammatory cytokines. In order to examine how microglia modulate neuronal function, calcium imaging experiments of the cortical neurons were undertaken using the calcium indicator Fluo-4 AM. Live calcium activity of cortical neurons was obtained using a confocal microscope, and fluorescence intensity was quantified using ImageJ. This report describes how co-culturing human iPSC-derived microglia and cortical neurons provide new approaches to interrogate the effects of microglia on cortical neurons.

This protocol describes a methodology to differentiate microglia from human iPSCs and maintain them in co-culture with iPSC-derived cortical neurons in order to study mechanistic underpinnings of neuroimmune interactions using human neurons and microglia.

The ability to generate microglia from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) provides new tools and avenues for investigating the role of microglia ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

세포 - 세포 연락이없는 두 세포 유형의 삽입 공동 배양 시스템 개발

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

 CNS 상호작용 연구를 위한 1차 미세아교세포 및 뉴런 공동 배양 프로토콜

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

저자 스포트라이트: 질병 상태에서 미세아교세포-신경 세포 상호 작용을 연구하기 위한 체외 공동 배양 모델

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

<meta charset="utf8"></head><body>정확한 신경돌기 성장을 위한 고급 실시간 이미징 기법

Standardization of a Novel Semi-Automatic Software for Neurite Outgrowth Measurement

Effective live-imaging techniques are crucial to assess neuronal morphology in order to measure neurite outgrowth in real time. The proper measurement of neurite outgrowth has been a long-standing challenge over the years in the neuroscience research field. This parameter serves as a cornerstone in numerous in vitro experimental setups, ranging from dissociated cultures and organotypic cultures to cell lines. By quantifying the neurite length, it is possible to determine if a specific treatment worked or if axonal regeneration is enhanced in different experimental groups. In this study, the aim is to demonstrate the robustness and accuracy of the Incucyte Neurotrack neurite outgrowth analysis software. This semi-automatic software is available in a time-lapse microscopy system which offers several advantages over commonly used methodologies in the quantification of the neurite length in phase contrast images. The algorithm masks and quantifies several parameters in each image and returns neuronal cell metrics, including neurite length, branch points, cell-body clusters, and cell-body cluster areas. Firstly, we validated the robustness and accuracy of the software by correlating its values with those of the manual NeuronJ, a Fiji plug-in. Secondly, we used the algorithm which is able to work both on phase contrast images as well as on immunocytochemistry images. Using specific neuronal markers, we validated the feasibility of the fluorescence-based neurite outgrowth analysis on sensory neurons in vitro cultures. Additionally, this software can measure neurite length across various seeding conditions, ranging from individual cells to complex neuronal nets. In conclusion, the software provides an innovative and time-effective platform for neurite outgrowth assays, paving the way for faster and more reliable quantifications.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 통증 인식과 신경병증성 통증의 분자적 기초 발표

Neurite outgrowth assays provide a quantitative value about regenerative neuronal processes. The advantage of this semi-automatic software is that it segments cell bodies and neurites separately by creating a mask and measures various parameters such as neurite length, number of branch points, cell-body cluster area, and number of cell clusters.

Neurite Outgrowth 측정을 위한 새로운 반자동 소프트웨어의 표준화 

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치과 펄프 파라크린 신호에 대한 응답으로 노이라이트 의 성장을 연구하는 공동 문화 방법

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세포 - 세포 연락이없는 두 세포 유형의 삽입 공동 배양 시스템 개발

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

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