우리는 국립 자연 과학 중국 펀드 (31770968)와 천진 연구 프로그램의 응용 프로그램 기초 및 고급 기술 (17JCZDJC33400)의 재정 지원에 대 한 감사.

1. 헤 파 린 통합 Starpeg Nanocoating의 제조
<ol><li>
헤 파 린 succinimidyl 호박 (헤 파 린-보 건국)의 합성
	<ol>
<li>얼음 처럼 차가운 이온된 수의 2.0 mL에 용 해 및 헤 파 린의 0.69 g 밖으로 무게.</li>
		<li>둥근 바닥 플라스 크에 얼음 처럼 차가운 이온된 수의 0.5 mL에 용 해 및 보 건국의 0.23 g으로 무게.</li>
		<li>0.5 ml 둥근 바닥 플라스 크에 얼음 처럼 차가운 이온된 수의 분해 및 EDC의 0.77 g을 무게.</li>
		<li>둥근 바닥 플라스 크에 NHS 및 EDC 솔루션을 믹스. 실 온에서 30 분 동안 실 온에서 벤치에 혼합된 솔루션을 떠나.</li>
		<li>10 분 초과 EDC와 보 건국 제거 5,031 x g 에 EDC NHS 혼합물 원심</li>
		<li>혼합 솔루션을 10 분 동안 5,031 x g 에서 원심 분리기의 냉 에탄올 30 mL를 추가 합니다.<ol>
<li>두 번 반복 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
StarPEG-헤 파 린 nanocoating의 준비
	<ol>
<li>둥근 바닥 플라스 크에 10% (w/v) starPEG-(NH2)8 의 1.0 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>같은 둥근 바닥 플라스 크에 10% (w/v) 헤 파 린-NHS의 0.67 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>점도와 명확한 솔루션을 얻기 위해 20 분에 25 ° C에서 인큐베이터에 starPEG-(NH2)8 및 헤 파 린-보 건국의 혼합된 솔루션을 배치 합니다. 참고: 실험 붙일 레이블된 덤플링을 (FAM-헤 파 린) 필요 했다, 제작 절차는 같은 스타-말뚝-(NH2)8 은 물속에에서 녹아 있는 이온 5(6)-보충 carboxyfluorescein N-succinimidyl 에스테 르 0.1% (어 금 니 비율) starPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
푸리에 변환 적외선 분광학 (IR FT)에 의해 헤 파 린 못 nanocoating의 특성
	<ol>
<li>시작 하기 전에, 아세톤 및 이온된 수 옥수 박격포와 유 봉 산 장치 (작은 디스크 직경 13 m m)를 씻어. 사용 하기 전에 오븐에서 유리를 건조.</li>
		<li>좋은 KBr 분말의 200-250 mg와 혼합 약 0.1-1% 덤플링을 못 샘플.</li>
		<li>옥수 박격포에는 헤 파 린-고 케이시 혼합물을 배치 하 고 2 µ m의 직경을 가진 작은 알 약으로 정밀 하 게 격파.</li>
		<li>Pelleting 장치에 혼합물을 전송 합니다. 투명 한 펠 릿을 형성 하기 위하여 1-2 분 동안 진공에서 높은 압축 힘 (8 T/c m2)를 적용 합니다.</li>
		<li>부드럽게 당겨 pelleting 장치에서 샘플 펠 릿. 균열 발생을 하지 너무 하드 하지를 주의 해야 합니다.</li>
		<li>매우 신중 하 게는 푸리에 변환 적외선 분 광 기 샘플 화학 구조를 결정 하는 샘플 펠 릿 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
스캔 한 전자 현미경 (SEM) 의해 덤플링을 못 nanocoating의 내부 다공성 구조 시험
	<ol>
<li>다음 절차에 대 한 표준 48-잘 셀 문화 접시와 펫을 준비 합니다.</li>
		<li>48-잘 문화 접시의 우물에 헤 파 린 못 코 폴리머 솔루션을 플라스틱.</li>
		<li>24 h-80 ° C에서 플레이트를 고정 합니다.</li>
		<li>Lypophilize 진공 환경에서-50 ° C에서 샘플 (0.1 Pa) 24 h에 대 한.</li>
		<li>샘플 한 알루미늄 스텁의 스티커 표면에 걸쳐 확산.</li>
		<li>골드 샘플 코트 그리고 스캔 한 전자 현미경 내부 다공성 구조를 관찰 하 라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
원자 힘 현미경 (AFM)에 의해 헤 파 린 못 nanocoating 표면 검사
	<ol>
<li>실리 카 유리 슬라이드 피 솔루션을 청소 (70% H2이렇게4, 30% H2O2) 40 분 동안 80 ° C에서.</li>
		<li>10 분 동안 메탄올 그리고 10 분 동안 톨루엔에 슬라이드 sonicate</li>
		<li>진공 건조 하 여 슬라이드를 건조.</li>
		<li>3-aminopropyl-triethoxysilane 솔루션 (톨루엔에 2%), 부드럽게 흔들어 많은 슬라이드를 씻어.</li>
		<li>메탄올 톨루엔 10 분에서 10 분 동안에 슬라이드 sonicate</li>
		<li>표준 피 펫을 사용 하 여 슬라이드의 표면에 걸쳐 3% 덤플링을 못 솔루션의 장소 100 µ L.</li>
		<li>헤 파 린-못 된 원자 힘 현미경의 표면 검사 (50-80 kHz의 공 진 주파수 강제 0.350 N m 21, 600의 팁 반경 일정 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 마우스 섬 표면 공학 덤플링을 못 Nanocoating
<ol><li>
헤 파 린 못 nanocoating와 마우스 섬 표면 코팅
	<ol>
<li>콜라 소화와 histopaque 그라데이션 정화 이전 정돈19에 보고에 의해 마우스 독도 추출 합니다.</li>
		<li>1.5 mL 튜브에 해 부 현미경 200 독도 따</li>
		<li>독도를 1 분 동안 503 x g 에서 원심 분리기 PBS의 500 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>상쾌한 떨어져가지고 가십시오 덤플링을 못 솔루션의 250 µ L을 추가 하 고 10 분 아래로 덤플링을 못 솔루션와 잘 섞어 독도 수 있도록 피 펫에 대 한 얼음에 혼합물을 유지.</li>
		<li>1 분 동안 503 x g 에서 원심 분리기.</li>
		<li>제거는 상쾌한 고 PBS의 500 µ L를 추가 합니다. 여기저기 잘 혼합 플라스틱.</li>
		<li>1 분 동안 503 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 하 고 추가 사용 하기 위해 독도 유지. 마우스 독도 덤플링을 말뚝 코팅의 시험, FAM-헤 파 린-못 섬 코팅 다음 단계에 사용 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
마우스 독도 식구 들-헤 파 린-말뚝 nanocoating 코팅의 시험
	<ol>
<li>보충 코팅된 독도 10% 태아 둔감 한 혈 청 RPMI 1640의 1-2 mL을 추가 하 고 이러한 독도 청구 비 살 균 세균성 문화 접시에 전송.</li>
		<li>거꾸로 형광 현미경 nanocoating 코팅 독도 식구 들-헤 파 린-못의 형태 및 형광 신호를 관찰 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 헤 파 린-말뚝의 기능 코팅 비 코팅 독도에 비해 마우스 독도
<ol><li>
헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도의 생존
	<ol>
<li>헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도의 20를 따 고 그들 셀 96 잘 문화 접시의 한 잘 합니다.</li>
		<li>10 웰 스의 총 각 잘 20 헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도 채우십시오.</li>
		<li>Noncoated 제어 독도의 20를 따 고 그들 같은 셀 96 잘 문화 접시의 한 잘 합니다.</li>
		<li>10 웰 스의 총 각 잘 20 noncoated 제어 독도 채우십시오.</li>
		<li>독도 포함 하는 96 잘 접시의 각 음에 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충 RPMI 1640의 200 µ L를 넣어 고 14 일에 대 한 문화에서 유지 합니다.</li>
		<li>섬 문화 미디어 2 일 마다 교체 합니다.</li>
		<li>라이브/죽은 문화에서 14 일의 끝에 키트를 얼룩이 지 고 거꾸로 형광 현미경 관찰로 독도 취급 합니다.</li>
		<li>거꾸로 형광 현미경 각 섬 내의 PI+ (적색) 셀을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
헤 파 린-말뚝의 revascularization 코팅 마우스 독도 체 외
	<ol>
<li>전 문화 접시를 포함 하 여 모든 실험 플라스틱을 냉각 하 고 피 펫 팁 사용 하기 전에 적어도 12 h.</li>
		<li>냉각 패드에 24-잘 장소를 놓습니다. 추가 250 µ L 얼음의 차가운 증가율 감소 Matrigel 24 잘 셀 문화 접시의 각 음에. 적어도 30 분 동안 4 ° C에서 코팅된 24-잘 접시를 놓습니다.</li>
		<li>냉장고에서 매트릭스 솔루션을 설정 하는 동안 마우스 췌 장 섬 내 피 마일 스벤 1 (MS1) 세포 trypsinize.<ol>
<li>조직 배양 플라스 크에서 모든 문화 매체를 제거 합니다. PBS의 5 mL로 플라스 크를 씻어.</li>
			<li>PBS를 제거 하 고 트립 신-EDTA의 3 mL를 추가 합니다. 표준 인큐베이터에서 3 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
			<li>가볍게 셀을 분리 하 여 혈 청 보충 미디어의 5 mL을 추가 플라스 크의 아래쪽을 누릅니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>15 mL 원심 분리기 튜브를 5 분 동안 1000 x g 에서 원심 분리기로 세포를 수집 합니다.</li>
		<li>오프는 상쾌한 고 PBS의 5 mL을 추가. 여기저기 잘 혼합 플라스틱.</li>
		<li>5 분 동안 1000 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 이륙.</li>
		<li>튜브에 혈 청 보충 DMEM 미디어를 추가 하 고 행렬 솔루션 코팅 24-잘 접시의 각 음에 50000 셀 씨.</li>
		<li>각 우물에 5 헤 파 린-나무 못 코팅 독도 또는 noncoated 제어 독도 추가 합니다.</li>
		<li>잘 당 500 µ L의 총 각 잘에 혈 청 보충 DMEM 미디어를 추가 합니다.</li>
		<li>가벼운 현미경 4 h 및 24 시간 보육 후 관 형성을 관찰 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
헤 파 린-나무 못 코팅 독도의 포도 당 자극 인슐린 분 비 참고:을 nanocoating 마우스 독도의 기능에 영향을 미칠 것 이라고, 헤 파 린-코팅 고 noncoated 독도의 포도 당 자극 인슐린 분 비는 평가 됩니다.<ol>
<li>한 1.5 mL 튜브에 30 헤 파 린-나무 못 코팅 독도 또는 noncoated 제어 독도 따. 10 튜브 코팅된 독도 대 한 총 및 noncoated 독도 준비 합니다.</li>
		<li>생리 적 소금물 2 mmol/L 포도 당20 보충의 1 mL을 추가 하 고 2 시간 동안 37 ° C에서 품 어. 참고: 생리 적 소금물 제조 법에 대 한 참조 하십시오 표1. 느슨한 인큐베이터에서 부 화 하는 동안 튜브의 뚜껑을 유지.</li>
		<li>가능한 많은 솔루션을 제거 합니다.</li>
		<li>30 분 동안 37 ° C에서 20 mmol/L 포도 당으로 보충 하는 생리 적 소금물의 600 µ L을 추가 하 여 독도 자극.</li>
		<li>ELISA 정량화 상업 인슐린 ELISA를 사용 하 여 키트 인슐린에 대 한 각 관에서 상쾌한의 200 µ L를 수집 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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이 문서에서 설명 하는 생활을 위한 "쉬운-을 채택" 접근 세포 표면 덤플링을 통합 starPEG nanocoating는 nanocoating의 N-hydroxysuccinimide 그룹 간의 의사 bioorthogonal 화학을 통해 엔지니어링 및 췌 장 섬 표면 막의 아민 그룹입니다. 실제로, 세포 막 내에서 아미노 그룹은 반응성이 매우 높은, 그리고 그 결과, 이전 연구 보고가 생리 조건14에서 활성화 된 N-hydroxysuccinimidyl (NHS) 에스테 르 주 아미노 그룹 사이 상호 작용 ,,1621. 또한, 광범위 한 연구는 섬 캡슐화 동안 덤플링을 매우 sulphated glycosaminoglycan, 세포 외 매트릭스의 중요 한 분 대의 설립 향상 된 후 이식 이어질 수 보고 revascularization 그리고 감소 IBMIR22,23. 말뚝의 생체 적합성 및 헤 파 린의 multivalent 속성을 고려 하면 우리는 nanocoating의 제조 동안 로드 최대한 덤플링을 8 무장 못 사용. 헤 파 린-보 건국, 작은 섬 세포 막에-NH2 그룹과 반응 이후에 수정 되었다. 헤 파 린 통합 말뚝에 의해 공유 결합 형성 (세포 막)의-NH2 -NHS 형 간염-못의 사이 독도 것 쉽게 "코팅"을 함으로써 따라서는 췌장암의 외부 표면에 나노 얇은 레이어 (nanocoating)를 형성 독도입니다.
현재 방식은 다른 섬 미소-보 건국 (nanocoating)의 작은 섬 세포의-NH2 사이 그 의사 bioorthogonal 화학에 대 한 주요 폴리머로 못 선택 이전에 게시 방법 막 사용 되었다. 섬/셀의 그 안정성을 고려 하면 코팅, 플라즈마, 같은 복잡 한 환경에서 특히 중요 포스트 이식 revascularization 이며 생존, 보 건국-와-NH2 사이 형성 될 것 이라고 더 안정적인에 비해 세포 막이 고24, 정전기 상호 작용9,15,,2425,26 또는 생물 학적 연동 biotin 사이의 소수 성 상호 작용 streptavidin14.
또한, 섬 달리 코팅 접근 또한 멀티 레이어 증 착14,,1625, 현재 기술에 대 한 확장된 섬 처리 기간으로 LBL 방식을 사용 하는 필요 최소한의 처리 하 고 매우 짧은 코팅의 고립 된 독도의 기간. 이러한 요소 둘 다 이기 때문에 독도 생존 종종 이미 손상 된 다음 섬 고립 때문에 손상 된 ECM 효소 소화 하는 동안 후 이식 섬 생존을 위해 필수적입니다. 그러나, 현재 접근에의 한 제한, LBL을 통해 외부 코팅의 두께 증가 또는 층 증 착의 수를 감소에 의해 제어 수 달리 형 간염 페그 nanocoating의 두께 수 없습니다 맞출 시간이 되 고 이다.
또한, 보 건국-와-NH2 장소, 현재 접근 사이 화학 반응은 살아있는 세포에 대 한 적용 온화한 조건 때문 표면 하지 엔지니어링 췌 장의 작은 섬, 하지만 대부분 세포 치료 제한. 또한, 헤 파 린에 대 한 다양 한 cytokines 및 생물 학적 활성 분자와 상호 작용 알려져 고려, 형 간염 페그 nanocoating도 선물 잠재력이 무제한 생물 중재자의 설립에 대 한 오픈 플랫폼 뿐만 아니라 더 복잡 한 세포 표면 공학에 대 한 인터페이스입니다.

세포 기반 요법의 치료 효능은 낮은 세포 보존 및 가난한 생존1,2에 의해 제한 됩니다. 세포 치료의 결과 개선, 효소 조작 통해 표면 공학, 주문 펩 티 드 활용, bioorthogonal 화학 및 생체 재료와 물리적 캡슐화 되었습니다 악용된3,4, 5,6,7,8,,910. 현재 프로토콜 표면 공학 ultrathin 덤플링을 통합 starPEG (헤 파 린-PEG) nanocoating 세포 표면에 적용 하 여 "쉬운-을 채택" 방법을 사용 하는 살아있는 세포의 달성을 목표로 한다. 췌 장 독도의 표면 공학 제시 했다 독도 Langerhans과 현재 임상 작은 섬 이식의 비방 결과의 질적 특성으로 인해 예를 들어 여기.
실제로, 임상 작은 섬 이식 현재 격리 된 독도의 간 문맥으로 직접 주입 하 여 수행 되며이 절차만에 사용할 수 선택적 환자 기증자 재료와 낮은 치료 효능의 부족 때문에 11. 통상, alginate 되었습니다 섬 캡슐화 및 표면 수정에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 소재 alginate과 관련 된 염증 성 섬유 증12, 화학 불안정성 때문 이상적 미만 이더라도 13. 또한, 100 ~ 200 µ m 사이 배열 하는 독도의 자연 크기에 비해, alginate 섬 microcapsules는 400와 800 µ m 사이 배열 하는 더 큰 산소의 생리 적 확산 거리를 초과 하는 있는. 등각 섬 캡슐화, 즉., 독도 섬 볼륨의 중요 한 변경 없이 캡슐화, 다음 개발 되었다. 따라서, nanomembranes의 페그, tetrafluoroethylene, 실리콘 막의 구성 또는 다층된 nanocoating (일컬어 "레이어-의해-레이어" [LBL] 기술) 향상 된 생체 외에서 섬 생존14 결과 보고 되었습니다. ,,1516,,1718, 비록는 LBL 자주 접근 필요 합니다 광범위 한 독도 섬 생존을 손상 될 수 있는 여러 층의 증 착에 대 한 기간 전달 . 또한, biomembrane 레이어 또는 nanomembranes 및 섬 표면 사이의 소수 성 상호 작용 사이 정전기 또는 공유 상호 작용에 의존 하는 nanomembranes의 불안정성 또한 우려9,14 제기 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Encumbers intraportal 섬 이식의 치료 결과 또 다른 제한 요소는 즉시 혈액 중재 염증 반응 (IBMIR) 이식된 독도 혈액, 혈소판, 결과와 직접 접촉에 의해 발생 응고 및 면역 부작용 또는 원치 않는 세포 활성화9. 이러한 문제를 해결 하기 위해 별 모양의 폴 리 에틸렌 글리콜 (starPEG)의 구성 하는 울트라 얇은 nanocoating 설립된 생체 적합성과 섬 소재 주택으로 다 준비 되었다. 헤 파 린, 매우 sulphated glycosaminoglycan, 또한 그것의 항 염증 제, 항 응고 제 속성과 vascularization 프로 신생 성장 인자22, 모집 하 여 촉진 수에 대 한 starPEG nanocoating에 통합 되었다 23.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:531px;" width="531">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Reagent</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">PBS</td>
			<td style="width:160px;">Hyclone</td>
			<td style="width:120px;">AAJ207798</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Streptozototin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">S0130</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Histopaque</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">10831</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:131px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">31800022</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:131px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">16000-044</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">15140</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:131px;">Cell Dissociation Solution</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">13150-016</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:131px;">DMEM</td>
			<td style="width:160px;">GIBCO, by Life Technologies</td>
			<td style="width:120px;">12800017</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">D-(+)-Glucose solution</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">G8644</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">488 phalloidin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">A12379</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">CFSE</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">21888-25mg-F</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:131px;">Annexin V/PI apoptosis kit</td>
			<td style="width:160px;">Dojindo</td>
			<td style="width:120px;">AD10</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">DAPI Fluoromount-G</td>
			<td style="width:160px;">SouthernBiotech</td>
			<td style="width:120px;">0100-20</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Collagenase from Clostridium, Type XI</td>
			<td style="width:160px;">Sigma</td>
			<td style="width:120px;">C7657</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Heparin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">H3149</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">NHS</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">56480</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">EDC</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">3449</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">8-armed PEG</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">1685176</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">FAM</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">M041100</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">21888</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">KBr</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">32036</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">3-aminopropyl-triethoxysilane&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">A3648</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">toluene</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">S-15497-20X</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Live/dead staining kit</td>
			<td style="width:160px;">Biovision, US</td>
			<td style="width:120px;">K501</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="79">
			<td height="79" style="height:79px;width:131px;">BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced</td>
			<td style="width:160px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:120px;">354230</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Sodium chloride, 99.5%</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">105864</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Potassium chloride, 99%, extra pure</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">991468</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">988639</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">182158</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:131px;">Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">128839</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">119370</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:131px;">Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2</td>
			<td style="width:160px;">J&#38;K Scientific Ltd</td>
			<td style="width:120px;">21114</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">V900933</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:131px;">Rat/Mouse Insulin ELISA kit</td>
			<td style="width:160px;">Millipore-linco</td>
			<td style="width:120px;">EZRMI-13K</td>
			<td style="width:120px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating

세포 표면 공학 호스트 면역 공격에서 이식된 세포를 보호할 수 있습니다. 그것은 또한 이식 기능을 개선 하기 위해 셀룰러 가로 바꿀 수와 생존 후 이식. 이 프로토콜은 표면 공학 ultrathin 덤플링을 통합 starPEG (형 간염-PEG) nanocoating를 사용 하 여 췌 장 독도의 달성을 목표로 한다. 췌 장 섬 표면 공학에 대 한 형 간염 페그 nanocoating를 생성 하려면 덤플링을 succinimidyl 호박 (헤 파 린-보 건국) 처음 사용 하 여 N-(3-dimethylamino propyl)-그것의 카복실산 그룹의 수정에 의해 합성 되었다N'-에틸 carbodiimide 염 산 염 (EDC) 및 N-hydroxysuccinimide (NHS). 형 간염 페그 혼합물 다음 아미노 끝 기능성된 8-무장 한 starPEG (starPEG-(NH2)8) 및 헤 파 린-보 건국의 가교에 의해 형성 되었다. 섬 표면 코팅, 마우스 독도 콜라 소화 및 Histopaque를 사용 하 여 그라데이션 정화를 통해 격리 했다. 격리 된 독도 다음 NHS와 작은 섬 세포 막의 아민 그룹 사이의 공유 바인딩 수 있도록 10 분 동안 얼음 감기 형 간염 페그 솔루션으로 치료 했다. Nanocoating 형 간염 페그와 부딪히는 섬 크기에 최소한의 변경 하 고 볼륨 및 형 간염 페그와 독도의 heparinization 또한 섬 이식 하는 동안 인스턴트 혈액 중재 염증 반응을 줄일 수 있습니다. "쉬운-을 채택" 이렇게 세포 생존 능력을 타협 하지 않고 충분히 살아있는 세포의 표면 공학에 대 한 가벼운입니다. 형 간염 페그 nanocoating 또한 무제한 기능 생물학 중재자 및 생활에 대 한 다층된 표면 관 수 있도록 개방형 플랫폼 제공 고려 덤플링을 여러 cytokines에 바인딩 선호도 보이고 있다, 세포 표면 생명 공학입니다.

헤 파 린 못 nanocoating starPEG-(NH2)8 , EDC와 보 건국 커플링 에이전트 (그림 1)으로 사용 하는 헤 파 린의 활용에 의해 합성 되었다. 헤 파 린 못 nanocoating의 화학 구조에 의해 FT-적외선 조사 되었다 그리고 그림 2에서 같이, 헤 파 린의 특성 피크 3300-3600 c m-1, 헤 파 린 (그림 2 의 수 산 기 그룹에 해당에서 관찰 될 수 있었다 빨간). (그림 2 블루) 3300-3600 c m-1 에서 피크의 진폭에 있는 감소는 starPEG-(NH2)8 아 미드 그룹 및 헤 파 린 생성 그룹 사이 활용을 나타냅니다. 아 미드에 해당 하는 피크 1650 c m-1 의 carbonyl 진동 스트레칭 또한 succinimidyl 호박으로 덤플링의 카복실산 그룹 및 starPEG-(NH2)의 아민 사이 충분 한 반응을 나타내는 감소 되었다 8. 헤 파 린 못 nanocoating의 표면 구조는 원자 힘 현미경 검사 법에 의해 시험 되었다 루 외에서 표시 하는는 nanocoating 약 30 nm 높이에 이르기까지 작은 다공성 기능 (검 버섯) 폭에서 2 µ m 100 ~ 200 사이 직경10nm. 스캔 한 전자 현미경 검사 법에서 얻은 데이터는 또한 vivo에서 전달 중 세포 생존에 적합 될 수 제안 덤플링을 페그 (그림 3)의 높은 상호 다공성 구조를 확인 합니다.
격리 된 마우스 독도의 표면 코팅 시험 되었다 고 그림 4에 제시 된으로 녹색 형광으로 표시 하는 nanocoating의 얇은 레이어 코팅된 독도의 표면에 걸쳐 섬 볼륨/크기에 분명 변화를 유발 하지 않고 예금은 균등 하 게. 코팅, 동안 그들의 생존을 유지 하기 위해 얼음에 독도 유지 하는 것이 좋습니다. 마찬가지로, 코팅 기간 10 분이 경우에 최적화 되었다 독도 생존 능력의 유지 관리를 허용 하도록. 그것은 그는 nanocoating의 더 나은 관측을 위해 이전에 보고 된9,16 코팅된 독도의 횡단면을 검사 전자 현미경 검사 법 더 적절할 것, 비록 데이터 생성 협조할 문화에서 생활 독도 대신 열 한 고정 및 임베디드 대에서
에 관한 생존 및 코팅된 독도, 섬 revascularization 및 기능의 기능 평가 체 외되었습니다. 헤 파 린의 유익한 속성을 고려 하면 섬 표면 덤플링을 기능화 수 문화에 따라서 생존 섬 revascularization 용이 하 게. 우리는 헤 파 린-나무 못 코팅 마우스 독도 전시 문화 (그림 5)에서 강력한 섬 생존을 관찰 했습니다. 훨씬 더 고급 혈관 형성은 헤 파 린-페그와 공동 경작 했다 섬 내 피 세포 (MS1)에서 또한 분명 코팅 독도, 길쭉한 microvessel 같은 구조와 같은 네트워크 혈관 구조 (그림 6에 표시 된 ).
Nanocoating 프로세스 덤플링을 말뚝 코팅 독도의 효과 포도 당 자극 인슐린 분 비 능력을 발생합니다. 인슐린 분 비의 낮은 수준 때 독도 생리 적 소금물 포도 (2 mmol/L;의 sub-stimulatory 수준으로 보충을 끼얹는다 했다 모든 치료 그룹에서 관찰 되었다 그림 7)입니다. 독도 포도 당 (20 mmol/L 포도 당)의 위에 생리 적 수준으로 자극 했다, 인슐린 분 비의 증가 모든 치료 그룹에서 관찰 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> 그림 1: 형 간염 페그 nanocoating 췌 장 섬 표면 공학의 화학 구조. 섬 코팅 덤플링을 NHS 및 세포 막 및 스타-말뚝-(NH2)8주 아민 사이 화학식 가교에 의해 달성 되었다. 각 헤 파 린 분자는 각 NHS 그룹을 수정 하는 여러 carboxyl 그룹을 소유한 다. NHS 활성화 carboxyl 그룹 폼 아 미드 결합를 통해 nanocoating 형 간염-고 독도의 안정화는 단백질의 1 차 아민과 반응 것 이다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> 그림 2 : 스타-말뚝-(NH2)8, 헤 파 린에 형 간염 페그 nanocoating의 적외선 스펙트럼의 건조 상태. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> 그림 3: 형 간염-못 말린된 상태에서의 전자 현미경 이미지를 스캔. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> 그림 4: 헤 파 린-말뚝의 대표 이미지 코팅 형광 현미경 독도. 헤 파 린 식구 들 (녹색에서 표시)와 함께 사전 이라는 했다. 이미지는 100 독도의 대표. 눈금 막대 = 100 µ m. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> 그림 5: 헤 파 린-나무 못 코팅 독도 전시 강력한 섬 생존. (A) 데이터의 의미, n mean± 표준 오류로 그룹당 50 독도 =. (B) 살아있는 세포는 빨강에서 녹색 및 죽은 세포에 표시 했다. 눈금 막대 = 100 µ m 이미지는 50 독도의 대표. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> 그림 6: 헤 파 린 못 nanocoating 용이 내 섬 revascularisation. MS1 셀 헤 파 린-나무 못 코팅 독도와 noncoated 제어 독도 공동 경작의 Matrigel 튜브 형성. 이미지 4와 24 h. 규모 바에서 찍은 = 100 µ m. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> 그림 7: 헤 파 린 못 nanocoating 섬 인슐린 분 비 기능에 변화를 발생 시킵니다. 헤 파 린-나무 못 코팅된 독도 및 noncoated 제어 독도 (각 30) 2 mmol/L (흰색 막대)에 노출 됐다 또는 30 분 응답 20 mmol/L 포도 당으로 인슐린 분 비에 대 한 20 mmol/L (검은 막대) 포도 코팅 사이 비교 했다 고 독도 제어. 데이터의 의미, n 평균 ± 표준 오차 표시 됩니다 = 10. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Heparinized StarPEG Nanocoating와 췌 장 독도의 표면 공학

이 프로토콜은 nanocoating의 N-hydroxysuccinimide 그룹 및 섬의 아민 그룹 사이의 의사 bioorthogonal 화학을 통해 헤 파 린 통합 starPEG nanocoating를 사용 하 여 췌 장 독도의 표면 공학 달성을 목표로합니다 세포 막입니다.

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

surface-engineering-pancreatic-islets-with-heparinized-starpeg

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K 조회수.  Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College. 이 프로토콜은 nanocoating의 N-hydroxysuccinimide 그룹 및 섬의 아민 그룹 사이의 의사 bioorthogonal 화학을 통해 헤 파 린 통합 starPEG nanocoating를 사용 하 여 췌 장 독도의 표면 공학 달성을 목표로합니다 세포 막입니다.

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Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

룽 공학을위한 절차

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

연구

생체공학

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

암 세포의 침략에 응용 프로그램을 사용하여 종양의 기질 미시의 조직 공학

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

의 생명 공학에 대한 각질 기반의 나노 섬유의 합성

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

에 내장 혈관 신생에 의하여 조직 공학<em&gt; 생체</em&gt; 조직 공학 상공 회의소

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

세포의 표면지도 및 Bioprinting에 대한 자동화 된 로봇 분배 기법

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

본래 마우스 독도에 β 세포 분열 촉진 물질의 지속적인 관리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 생분해 성 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) 마이크로 스피어를 사용하여

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

당뇨병 쥐의 부고환 지방 세포에 이식 된 지지체 지지대 지지대

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, and translation of findings is often poor. Thus, there is ample opportunity for alternative experimental approaches. Here we present an approach in which human cells are isolated from human anterior cruciate ligament tissue remnants, expanded in culture, and used to form engineered ligaments. Exercise alters the biochemical milieu in the blood such that the function of many tissues, organs and bodily processes are improved. In this experiment, ligament construct culture media was supplemented with experimental human serum that has been &#39;conditioned&#39; by exercise. Thus the intervention is more biologically relevant since an experimental tissue is exposed to the full endogenous biochemical milieu, including binding proteins and adjunct compounds that may be altered in tandem with the activity of an unknown agent of interest. After treatment, engineered ligaments can be analyzed for mechanical function, collagen content, morphology, and cellular biochemistry. Overall, there are four major advantages versus traditional monolayer culture and animal models, of the physiological model of ligament tissue that is presented here. First, ligament constructs are three-dimensional, allowing for mechanical properties (i.e., function) such as ultimate tensile stress, maximal tensile load, and modulus, to be quantified. Second, the enthesis, the interface between boney and sinew elements, can be examined in detail and within functional context. Third, preparing media with post-exercise serum allows for the effects of the exercise-induced biochemical milieu, which is responsible for the wide range of health benefits of exercise, to be investigated in an unbiased manner. Finally, this experimental model advances scientific research in a humane and ethical manner by replacing the use of animals, a core mandate of the National Institutes of Health, the Center for Disease Control, and the Food and Drug Administration.

We present a model of ligament tissue in which three-dimensional constructs are treated with the human exercise-conditioned serum and analyzed for collagen content, function, and cellular biochemistry.

운동 조건의 혈청을 이용한 인대 구조의 치료 : Translational Tissue Engineering Model

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

인쇄 3D 세포 -라덴 췌장 조직 구성을 인쇄를위한 췌장 조직 유래 세포 외 매트릭스 바이오 잉크

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...