Name: enrichment of bacterial lipoproteins and preparation of n-terminal lipopeptides for structural determination by mass spectrometry
Uploaded: 2018-05-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
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메러디스 랩에서 연구 비 과학 대학 (펜실베니아 주립 대학)에서 제공 하는 시작 기금에 의해 지원 되었다. 우리는 전문적인 기술 조언과 펜 스테이트 Proteomics와 질량 분석 핵심 시설, 대학 공원, PA, 대량 spectrometric 분석 수행 된 장비에 대 한 액세스에 대 한 박사 타 Laremore 감사 합니다.

1. 세포 성장 및 세포
<ol><li>후반 지 수 단계 (OD600 1.0-1.5의) 15 mL tryptic 간장 국물 (TSB) 또는 유사한 리치 미디어에 박테리아를 성장. 원심 분리에 의해 세포를 수확, Tris 버퍼 식 염 수/EDTA (: TBSE)로 한 번 씻어 프로토콜을 계속 하거나 사용까지 동결. 참고:: TBSE: 20 mM Tris-염 산 (HCl), pH 8.0, 130 m m 염화 나트륨 (NaCl), 그리고 5 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)). 단백 식 수정 성장 조건 (예: 산도, 염 분, 성장 매체) 및 성장 단계15에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 원하는대로, 하지만 15 mL 세포 성장 조절 수 셀은 권장 단백질의 단일 준비에 대 한 초과 바이오 매스 단백 생산량을 줄일 수 있습니다. 한 15 mL 준비는 일반적으로 2 ~ 4의 최적의 로드에 대 한 충분 한 샘플 생성 표준 SDS 페이지 미니 젤에 차선.</li>
	<li>1mm phenylmethyl sulfonyl 불 소 (PMSF)와 0.5 mg/mL lysozyme 800 μ: TBSE 셀 resuspend 솔루션 2.0 mL 스레드 microcentrifuge 튜브 스크류 캡 및 o-링을 전송 하 고 37 ° c.에 20 분 동안 품 어 참고: 특정 종 lysozyme에 의해 세포에 감염 되지 않습니다. 적절 한 용균성 효소 세포에 도움을 대체 한다.</li>
	<li>튜브 ~ 800 μ 0.1 m m 지 르 코니 아/실리 카 구슬을 추가 하 고 30의 5 사이클는 균질 화기에 최대 속도 (7000 rpm)에서 떨고 하 여 셀을 방해 s 각 사이클 사이 얼음에 각각, 2 분 휴식.</li>
	<li>(작은 구슬 및 손상 되지 않은 세포)에 4 ° C에서 5 분 동안 3000 x g에서 원심 분리기 샘플. 새로운 2.0 mL microcentrifuge 튜브에는 상쾌한 전송 및 얼음에 계속.</li>
	<li>200 μ: TBSE 나머지 펠 릿을 추가 하 고 추가 주기에 균질 화기 돌아갑니다. (위와) 원심을 상쾌한 이전 상쾌한 (800-1000 μ 총 볼륨 되어야 함)와 결합 합니다.</li>
</ol>2. 텍사스-114 단계 분할 하 여 단백질의 농축
<ol><li>TX-114 2% (vol/vol)의 최종 농도에 계면 활성 제와 함께 상쾌한은 동일한 양의 4% (vol/vol) 얼음 처럼 차가운: TBSE에 계면 활성 제를 추가 하 여 보충 하 고 1 시간 반전에 의해 모든 ~ 15 분을 혼합에 대 한 얼음에 품 어. 참고: 냉장, 계면 활성 제와 상쾌한 됩니다 혼합할 수 있는.</li>
	<li>37 ° C 물 목욕 튜브를 전송 및 상 분리를 유도 하기 위해 10 분 동안 품 어. 샘플 bi phasic 분리를 유지 하기 위해 실내 온도 에서 10 분 동안 10000 x g에서 원심</li>
	<li>부드럽게 위 수성 단계에서 플라스틱 그리고 삭제. 그것의 원래 볼륨을 튜브 리필 낮은 계면 활성 단계로 얼음: TBSE를 추가 하 고 혼합에 반전. 10 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>37 ° C 물 목욕 튜브 전송 단계 분리를 유도 하기 위해 10 분 동안 품 어 다음 실 온에서 10 분 동안 10000 x g에서 원심.</li>
	<li>3 별거의 총 단계 2.3-2.4를 한 번 더 반복 합니다. 위 수성 단계를 제거 하 고 삭제.</li>
	<li>계면 활성 제 단계에 차가운: TBSE의 1 볼륨을 추가 하 여 기사 (튜브의 하단에 표시)의 과정에서 형성 된 침전 된 단백질의 펠 릿을 제거 합니다. 불용 성 단백질을 작은 2 분 16000 x g에서 4 ° C에서 원심. 참고: 샘플은 단일 단계를 유지 한다. 단계 분리 발생 하면, 다시 샘플을 진정 하 고 다시 원심. 펠 릿 일반적으로 단백이 아닌 오염 물질의 구성 이지만 추가 분석을 위해 유지 될 수 있습니다.</li>
	<li>즉시 신선한 2.0 mL microcentrifuge 튜브 100% 아세톤의 1250 μ를 포함 하는 상쾌한 전송. 점도 있을 것 이다 팁에서 샘플을 씻어 철저 하 게 위쪽 및 아래쪽 플라스틱. 반전 하 여 혼합 하 고 단백질을 침전에-20 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>샘플 튜브의 방향에 주의와 단백질 pellet을 실 온에서 20 분 16000 x g에서 원심 지 단백질 튜브의 외부 벽을 따라 얇고, 백색 필름을 형성 합니다.</li>
	<li>100% 아세톤과 두 번 펠 릿을 세척. 아세톤을 가만히 따르다 고 공기 샘플을 건조 수 있습니다.</li>
	<li>10 mM Tris HCl, pH 8.0 또는 표준 Laemmli SDS 페이지 샘플 버퍼16 의 20-40 μ를 추가 하 고 철저 하 게 아래로 침전 된 지 단백질으로 벽에 pipetting으로 resuspend. 지 단백질을 꺼내 려 피 펫 팁 튜브의 측면을 다쳤어요. 참고: 단백질 Tris 버퍼에서 분해 되지 않습니다 하지만 오히려 한 현 탁 액을 형성.<ol>
<li>-20 ° C에서 단백질 사용까지 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. SDS 페이지, Electroblotting, Ponceau s 얼룩
<ol><li>SDS 페이지 표준 방법16를 사용 하 여 별도 단백질. 참고: 적절 한 젤 아크릴 비율의 용도 단백질의 크기에 따라 달라 집니다. 여기, E. faecalis 단백질 분리 되었다 10% 이상, 트리 스-글리신 젤 16.5% 트리 스 tricine 젤 작은 대장균 단백 Lpp17사용 되었다.</li>
	<li>표준 electroblotting 프로시저를 사용 하 여 니트로 전송 막에는 단백질을 전송 합니다. 참고: 세미 드라이 전송 Bjerrum 란-닐슨 버퍼 플러스 0.1 %SDS 사용 하 여 25 V, 1.3에서 수행한 15 분18mA. 그러나 또는 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 사용할 수, 그것은 니트로 보다 더 소수, 그것은 나중 단계에서 막에서 소수 lipopeptides의 효율적인 차입을 줄일 수 있습니다.</li>
	<li>컨테이너와 커버 Ponceau S 솔루션 (0.2% (w/v) Ponceau S 5% 초 산에서)와 니트로 막 전송. 바위 부드럽게 5 분 또는 때까지 빨강 분홍색 밴드를 볼 수 있습니다.</li>
	<li>Ponceau S 솔루션을 부 어와 신중 하 게 씻어2O를 초과 제거 얼룩 지명 타자로 니트로 막. 참고: Ponceau 스테인드 밴드는 급속 하 게 destain 것입니다. 밴드는 사라지고, 착 색 과정을 반복 합니다.</li>
	<li>깨끗 한 면도날으로 원하는 밴드와 microcentrifuge 튜브에 소비 세. DH2O를 완전히 밴드 destain의 1 mL로 세 번 세척. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 저장소 삭제 섹션 사용까지-20 ° C에서 물으로 덮여 있습니다.</li>
	<li>깨끗 한 표면에와 깨끗 한 면도날으로 섹션을 전송, 0.5 mL 낮은 단백질 바인딩 microcentrifuge 튜브로 조각 작은 조각의 약 1 m m x 1 m m. 수집으로 니트로 스트립 주사위.</li>
	<li>씻어 갓 50 m m 염화 중 탄산염 (NH4HCO3) 0.5 mL로 두 번 조각의 pH 7.8-고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 학년 물에.</li>
</ol>4. tryptic 소화, 니트로 막, MALDI 표적, 및 데이터 수집에 증 착에서 Lipopeptide 추출
<ol><li>50mm NH4HCO3, pH 7.8 HPLC 학년 물에서 trypsin의 20 μ g/mL 해결책의 20 μ에 니트로 조각 resuspend. 혼합, 소용돌이 다음 모든 조각을 완전히 trypsin 솔루션에 포함 되도록 짧게 스핀. 파라핀 필름 증발을 방지 하 고 37 ° c.에 하룻밤 다이제스트를 품 어를 사용 하 여 튜브 뚜껑 커버</li>
	<li>스핀에서 16000 x g 30 s 및 제거 pipetting으로 액체에 대 한 샘플. 참고:이 단백질 식별 MALDI TOF MS에 의해 나중에 시험 될 수 있다 trypsinized 친수성 펩 티 드를 제거 합니다.</li>
	<li>HPLC 학년 물에 0.5 %trifluoroacetic 산 (TFA)의 50 μ를 추가 합니다. 혼합, 소용돌이 다음 모든 조각 솔루션 적용 되도록 간단히 샘플을 회전 합니다. 실 온에서 10 분 동안 품 어. Pipetting으로 액체를 제거 합니다. 주의: TFA는 흡입 하는 경우에 유해한. 신중 하 게 처리 하며 화학 증기 두건에서 사용. 피부와 접촉을 하지 마십시오.</li>
	<li>HPLC 학년 물에 10% 이기의 50 μ와 4.3 단계를 반복 합니다. 주의: 이기는 흡입 하는 경우에 유해한. 신중 하 게 처리 하며 화학 증기 두건에서 사용. 피부와 접촉을 하지 마십시오.</li>
	<li>HPLC 학년 물에 20% 이기의 50 μ와 4.3 단계를 반복 합니다. 참고:이 느슨하게는 니트로에 바인딩된 모든 알맞게 소수 성 펩 티 드를 제거 합니다.</li>
	<li>단단히 바인딩된 lipopeptides elute 갓 만든 10 mg/mL α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (CHCA) 매트릭스 클로 프롬-메탄올 (2:1, v/v)에 용 해의 15 μ를 추가 하 고 간헐적으로 vortexing와 실 온에서 10 분 동안 품 어.<ol>
<li>또는 15 μ 클로 프롬-메탄올 elute lipopeptides 나중에 매트릭스와 믹스를 추가 합니다. 2, 5-dihydroxybenzoic 산 (DHB) 등 다른 행렬 특정 lipopeptide 구성에 대 한 불만족 한 결과 가져온 경우 CHCA에 대안으로 시험 되어야 한다. 주의: 클로 프롬 및 메탄올 흡입 하는 경우에 유해 하다입니다. 신중 하 게 처리 하며 화학 증기 두건에서 사용. 피부와 접촉을 하지 마십시오.</li>
		<li>
옵션: 나트륨을 홍보 하기 위해 대형 adduct, 1mm의 최종 농도에 수성 나트륨 탄산염 (NaHCO3)와 클로 프롬-메탄올에 CHCA의 솔루션을 보완.</li>
	</ol>
</li>
	<li>간단히 샘플을 회전 합니다. 피 펫와 신중 하 게 새로운 낮은 단백질 바인딩 microcentrifuge 튜브에 액체를 전송. 이 솔루션은 N 맨끝 lipopeptides의 대량을 포함 됩니다. 참고:는 니트로 수 있습니다 부분적으로 또는 완전히 분해 클로 프롬 메탄올 솔루션. 이 부정적인 MS 결과 영향을 주지 않습니다 그리고 lipopeptide 반환을 증가 하는 대체 방법으로 사용할 수 있습니다. PVDF 막 하지 같은 방식으로 분해 됩니다.</li>
	<li>닦은 강철 MALDI 표적에 CHCA와 eluted lipopeptides의 1 μ를 입금. 참고: 클로 프롬-메탄올 것입니다 증발 신속 하 게, 결정 CHCA와 lipopeptides 뒤에 남겨두고. Aliquot는 선택적 둘째 1 μ 샘플 농도 높이기 위해 같은 자리에 입금 될 수 있습니다. 클로 프롬-메탄올 대상에 증 착 후 크게 확산 될 수 있습니다와 같은 한다 주의 샘플 대상에 혼합 하지 마십시오. 입금 하 고 각 샘플의 여러 관광 명소를 촬영 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>즉시 질량 분석을 진행 합니다. 특히 자리 포함 되어 있는 경우 두 레이어 샘플의 두 번째 레이어 스팟의 바깥쪽 테두리에는 lipopeptides를 밀어 수 있습니다 lipopeptide 신호, 스팟의 모든 영역을 검사 합니다. 참고: 권장된 시작 레이저 강도 25%, 비록 그것은 신호를 수집 하 고 적절 한 신호 대 잡음 비율을 달성 하기 위해 여러 스펙트럼 (20 명 이상 검사)를 합계 하는 강도 증가 하는 데 필요한 있을 수 있습니다. 여기, 스펙트럼 MALDI TOF TOF 악기에 인수 했다 ( 테이블의 자료를 참조) 700-3500 m/z 범위 반사판 긍정적인 이온 검출에 대 한 공장에서 구성 된 악기 방법을 사용 하 여. 악기는 소 혈 청 알 부 민 (BSA) tryptic 펩 티 드 혼합물으로 보정 했다.</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

지 단백질 특성의 2 단계로 여기 프로토콜에 설명 합니다: TX-114에 의해 농축 단계 MALDI TOF MS에 의해 분할 및 구조 결정. TX-114 추출 하는 동안 추가 원심 아세톤 강수량 수익률 높은 농축된 단백질 이어서이 과정 침전 오염 단백질을 제거 합니다. 셀의 15 mL 가치에 각 준비의 규모를 제한 하 여 몇 가지 샘플 수 쉽게 병렬로 처리 되며 원하는 경우, 프로토콜의 끝에 풀링된.
MS 구조 분석용, 니트로 하는 단백질의 양도 트립 신 소화, 세척, 고 막에서 후속 차입을 촉진 한다. 우리의 손에서이 접근은 입증 전통적인 polyacrylamide 젤 플러그에서 세제 중재 추출 하는 것이 좋습니다는 단백질 연관 니트로 막의 표면 그리고 polyacrylamide에 포함 되지. 니트로 표면 단백 협회도 크게 소수 성 펩 티 드에 의해 컨테이너 표면에 일반적인 흡착의 일반적인 문제를 방지할 수 있습니다. 니트로 조각의 stepwise 차입 제거 더 많은 친수성, 내부 tryptic 펩 티 드 MALDI TOF MS 최종 차입 단계 reproducibly 생성 하는 동안 높은 신뢰 단백질 식별 할당을 달성 하 여 분석할 수 있는 크게 간섭 염과 오염 물질을 억제 하는 이온의 무료 작은 볼륨에 집중된 lipopeptides.
단백의 성공적인 MS 분석은 풍요로 움, 그리고 같은, Ponceau S 스테인드 막에서 어두운 밴드는 최상의 결과 줄 것. 그러나, 그것은 여러 단백질 페이지 분리, 결과 스펙트럼을 복잡 하 게 하는 동안 단일 밴드에 마이그레이션할 수 있습니다. 따라서 것이 좋습니다 먼저 단백질 식별 하 지문 (PMF), 펩 티 드 질량을 총 trypsin 분수 또는 어느 이기 세척에 MS 스펙트럼을 수집 하 고 입력으로 결과 봉우리 여 달성 될 수 있다는 마스코트22같은 소프트웨어. 단백질 시퀀스를 확인 선택 MS/MS에 의해 조각 하는 이온에 에이즈 크게 tryptic N 맨끝 lipopeptide의 질량을 계산 합니다.
추가 샘플이 인구와 소스 박테리아6에 따라 모두 그들의 N 맨끝 수정, 지 단백질에 acyl 체인 길이 다양 한에서 발생할 수 있습니다. 부모 스펙트럼, 메 틸 렌 그룹 (-채널2-)에 해당 하는 14 다 증가 의해 특징에 독특한 피크 클러스터 체인 길이에서 변화 하 게 하는 동안 전체 lipopeptide 신호를 분할 하 고 감도 줄일 수 있습니다. Triacylated, diacylated, 및 lyso 형태의 지 단백질 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 성공적으로 확인 했습니다 비록 가능성이 다른 단백 형태의 농축 및 조각화, 영향 이기도 합니다. 마찬가지로, 지 단백질의 다양 한 펩 티 드 moieties 추가 복잡성의 또 다른 수준에 그들의 N 맨끝 구조 분석에 매우 친수성 아미노산 구성 lipopeptide 유기 클로 프롬 단계에 분할 되지 않을 수 있습니다. 다른 추출 방법8을 사용 하 여. 니트로 단백의 이전 것으로 모든 차입 분수가이 방법에서 분석 될 수 있다 같은 lipopeptides, 공부에 도움이 됩니다.
Triacylglycerides 및 인지질23를 포함 하는 이전 문학에서 그리기, 의도적인 나트륨 adduct 형성의 형성을 통해 더 유익한 조각화를 홍보 하는 데 사용 수는 (N-acyl)-dehydroalanyl 펩 티 드 이온. 이러한 특성 이온은 N-말단의 acylation 상태 glyceryl moiety에 acyl 대체 분리 이후 구조를 할당 하는 열쇠. 나트륨 adduct 형성 N촉진을 보여줘 왔다 과산화 수소와 산화 유황을 편리한 대체 옵션을 제공 합니다-acyl-dehydroalanyl 펩 티 드 조각6,8. 비록 나트륨 adducts 저하 부모 이온 강도 대 한 표시 부모 이온 신호, dehydroalanyl 이온으로 조각화에 특정 증가의 전반적인 억제 보상 수 있습니다. 그것은 다른 행렬을 탐구 가치가 있을 수 있습니다 고의 추가 조각화 adducts 가장 유익한 스펙트럼을 유도.
이 프로토콜을 니트로 막에 페이지 구분 지 단백질의 양도 트립 신 소화 및 lipopeptides의 차입을 용이 하 게 하는 동안 단백 농축 방법 분할 전통적인 TX-114 위상 향상. 총 tryptic 또는 세척 분수에 MALDI TOF MS 분석 함께 단일 실험에서 MS/MS에 의해 N-터미널 구조 결정 단백질 식별 수 있습니다. 선택적 나트륨 더 유익한 이온 조각화를 홍보 함으로써 형성 하이라이트 차이 lipopeptide N-말단에 adduct. 정기적으로 단백질 정화 하 고 그들의 N termini 특성화 수 양식을 만들어집니다 어떻게 소설 단백에 대 한 광범위 한 연구, 세균성 세포 봉투 내에서 생리 적 역할 그리고 어떻게 그들은 포유류 면역에서 검색 하면 시스템입니다.

세균성 단백질을 보존된 N 맨끝 지질 수정 시스테인 그 앵커 세포 막 표면에 구형 단백질 도메인 특징입니다. 그들은 보편적으로 박테리아에 일반적인 게놈1내의 모든 세포질 유전자의 2 ~ 5%를 구성 배포 됩니다. 지 단백질 등 양분 통풍 관, 신호 변환 세포질 과정의 광범위 한에 중요 한 역할 단백질 복합물의 및 유지 세포 봉투 구조적 무결성2. 병원 성 박테리아, 단백질 독성 요인3,4로 제공합니다. 감염, 동안 N 맨끝 lipopeptides 수용 체 통행세 같이 (TLR) 2에 의해의 인식 incites 침입 병원 체를 제거 하는 타고 난 면역 반응. N 맨끝 acylation 상태에 따라 단백질 대체 TLR2 heterodimeric 복합물에 의해 일반적으로 인식 된다. TLR2 TLR1 TLR2 TLR6 바인딩 무료 lipopeptide α-아미노 termini 동안 N-acylated lipopeptides를 인식합니다. 한 번 바운드, 신호 경로 proinflammatory cytokines3,4의 분 비를 유도 하기 위해 수렴.
그것은 이전 줄 알았는데 그 그람 양성 박테리아에서 단백질 diacylated 및 그램 음성 박테리아에서 보존된 N 맨끝 시스테인 잔류물에는 아 미드 연결 지방산의 존재 또는 부재에 다른 triacylated를 했다. 이 가정은 Lnt, 형성 하는 triacylated 단백질5그람 음성 N acyl 전이 효소를 그람 양성 게놈에서 순서 orthologs의 부족에 의해 지원 되었다. 그러나, 최근 연구 3 소설 N 맨끝 단백 구조, peptidyl, lyso와 N-아 세 틸 형태6,7 뿐 아니라 단백 triacylation 그람 양성 Firmicutes 그 부족 lnt에 계시 했다 ,8. 이러한 결과 소설 단백질이 어떻게 만들어에 대 한 근본적인 질문 어떤 생리 적 목적이 나 장점은 다양 한 형태의 얻으며 함께 가능한 아직---발견 지 형태에 대 한 질문을 제기. 또한, 그들은 명확 하 게 지 단백질 구조 예측 유전체학의 현재 무 능력을 보여 줍니다. 실제로, 우리는 최근 단백 N acyl transferases, Lit, Enterococcus faecalis 균 cereus 만드는 lyso 형태의 지 단백질9에서 라는의 소설 클래스 식별. 이 매우 소수 성 성격 및 특성을 그들의 분자 구조를 사용할 수 있는 제한 된 방법 때문에 도전적 일 수 있다 지 단백질 구조를 실험적으로 확인 하는 필요를 나타냅니다.
우리 세균 단백질을 순화 하 고 N-터미널 tryptic 준비 몇 가지 이전에 설명한 프로토콜 호스트 면역 반응 뿐만 아니라 N-터미널 구조 결정의 단백 유도 대 한 연구를 촉진 하기 위하여 적응 MALDI TOF MS6,10,,1112에 의해 분석을 위해 lipopeptides. 지 단백질 오염 비 단백질을 제거 하 고 단백 수확량을 증가 하는 최적화 메서드를 분할 설립된 트리톤 X-114 (이제부터 계면 활성 제 또는 TX-114 참조) 단계를 사용 하 여 농축입니다. 이러한 단백질은 SDS 페이지 더 정화 또는 TLR 분석 실험에 직접 사용 하기 위해 적합 합니다. MALDI TOF ms, 니트로 막에는 단백질의 양도 비 계 트립 신 소화 효율적인 현장에 대 한 세척, 하며 매우 인 멤브레인 표면에서 후속 차입 정화 N 맨끝 lipopeptides. 니트로 샘플 처리를 용이 하 게 하 고 완전 한 막 단백질13,14, 지 단백질9,10에서 높은 소수 성 펩 티 드에 대 한 시퀀스 범위를 향상을 보여줘 왔다 . 메서드는 중간 세척 솔루션은 단일 실험에서 N-터미널 구조 결심과 동시에 높은 자신감 단백질 식별을 위해 분석 될 수 있다 그래야 펩 티 드, 극성에 따라 분별의 추가 이점이 있다 . 이 프로토콜 고유 기능 의도적인 나트륨 adduct MS/MS, N-acylation 상태의 구조 지정에 은닉 하는 동안 dehydroalanyl 이온으로 부모 이온 조각화를 홍보 하는 대형. N-말단은 모두 가장 변수 및 주요 기능 단백질의 TLR 인식에 관련 된. 함께 찍은,이 프로토콜 정화 및 TOF MALDI MS 실험의 전반적인 목표에 따라 쉽게 적응 하 여 구조 결정의 각 단계와, 지 단백질에 집중 하 고 재현할 수 연구를 허용 했다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.01 mm Zirconia/silica beads</td><td>BioSpec Products</td><td>110791012</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>EMD</td><td>AX0073-9</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>EMD</td><td>AX0116-6</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>EMD</td><td>AX0142-6</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Fluka Analytical</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>BioTrace NT Nitrocellulose</td><td>PALL Life Sciences</td><td>66485</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA) digest standard</td><td>Protea</td><td>PS-204-1</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>423550025</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Grade water</td><td>EMD</td><td>WX0008-1</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP535-1</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Amresco</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>Pierce trypsin protease</td><td>Thermo Scientific</td><td>90057</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Acros Organics</td><td>161470100</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube 0.5mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431064</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792519</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>7581-06</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537</td><td></td></tr><tr><td>Tris-hydrochloride (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-114</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93422</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic soy broth (TSB)</td><td>BD</td><td>211822</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagNALyser</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF target</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser</td></tr></tbody></table>

enrichment of bacterial lipoproteins and preparation of n-terminal lipopeptides for structural determination by mass spectrometry

지 단백질 세균성 세포 봉투의 중요 한 성분 이며 포유류 타고 난 면역 반응의 강력한 활성 제입니다. 세포 생리학과 면역학에 그들의 중요성에도 불구 하 고 많은 소설 지, 어떻게 그들은 합성은, 양식과 호스트 면역에 다양 한 형태의 효과 대 한 발견 되 고 남아 있다. 지 단백질에 대 한 철저 한 연구를 활성화 하려면이 프로토콜 세균 단백 농축 하는 방법에 설명 합니다 및 매트릭스 지원 레이저에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 tryptic lipopeptides의 준비 desorption 이온화 시간의 비행 질량 분석기 (MALDI TOF MS)입니다. 단백 추출 및 세균성 세포 막에서 농축 방법 분할 설립된 트리톤 X-114 단계에 확대, 프로토콜 단백 수확량 증가 비 지 오염 물질을 제거 하기 위한 추가 단계를 포함 하 고 순도입니다. 먼저 MALDI TOF 양 여기에 의해 N-터미널 구조 특성에 중요 한 단백질은 수용 체 통행세 같이 (TLR) 분석 실험 일반적으로 사용 됩니다, 이후, 메서드 N 맨끝에 농축 하는 집중된 소수 성 펩 티 드를 분리 하 여 lipopeptides 나트륨 라우릴 황산 염 폴 리 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 의해 분리 된 TOF MALDI MS/양 지 단백질에 의해 직접 분석에 적합 니트로 막 전송 현장에 와 소화 트립 신, 순차적으로 북극 tryptic 펩 티 드, 제거 하기 위하여 세척 그리고 클로 프롬-메탄올을 가진 마지막으로 eluted. 세척 솔루션에서 더 극 trypsinized 펩 티 드의 MS와 결합,이 메서드는 둘 다 식별 하는 단백 단일 실험에서의 N-말단의 특성 기능을 제공 합니다. 의도적인 나트륨 adduct 형성 더 구조적으로 유익한 조각화 스펙트럼을 홍보 하는 도구로 채택 될 수 있다. 궁극적으로, 단백질의 농축 및 그들의 N 맨끝 구조의 세균성 단백질의이 유비 쿼터 스 클래스에 더 광범위 한 연구 수 있도록 합니다.

프로토콜의 회로도 그림 1에 제공 됩니다. TX-114 Enterococcus faecalis ATCC 19433에서에서 추출한 단백 농축 분수는 그림 2에 표시 됩니다. 비교를 위해 침전 된 단백질 분수의 밴딩 패턴도 표시 됩니다. 이 분수에서 단백질은 MALDI MS는 매우 풍부한 단백질 (표 1) 이외의 단백질 오염 수에 의해 확인 되었다. 그림 3 에 질량 스펙트럼 입증 증가 극성 (피크 할당 에 나열 된의 용 매와 니트로 바인딩된 PnrA의 연속적인 세척으로 나타나는 PnrA E. faecalis 단백의 tryptic 펩 티 드 이온 프로필 표 2). 그림 4 는 N-PnrA MALDI TOF MS/MS에 의해 하 lyso 단백 형태와 진단 N-acylated dehydroalanyl 봉우리를 공개 결정의 터미널 구조 특성. 그림 5 에서는 나트륨의 영향 N-acylated dehydroalanyl 이온에 찬성 하 여 우선적으로 분할 sodiated 부모 이온 조각화에 adduct.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56842/56842fig1.jpg"> 그림 1: 프로토콜의 도식. 지 단백질 TX-114 단계 분할 하 여 농축 TLR 분석 실험에 직접, 가장 일반적으로 사용 하거나 추가 구조 결정에 대 한 SDS 페이지에 의해 순화 될 수 있습니다. 지 단백질은 니트로, 트립 신, stepwise, 세차와 소화 및 구조 분석을 위한 클로 프롬-메탄올과 MALDI MS에 의해 eluted 결과 lipopeptides로 전송 됩니다. 트립 신 및 니트로 세척 솔루션 단백질 식별 및 MS 분석을 위해 저장할 수 있습니다. 승:; TFA: trifluoroacetic 산; ACN: 이기; CHCA: α-cyano-4-hydroxycinnamic 산; 선택: 선택; MALDI: 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화; MS: 질량 분석입니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56842/56842fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56842/56842fig2.jpg"> 그림 2: TX-114의 농축 단백질 E. faecalis에서. 10% 트리 스-글리신 SDS 페이지 젤 물 Coomassie 파란 (A) 과 해당 니트로 막 물 침전 된 단백질 분수 ("PPT")과 정화는 사이 패턴 다른 banding Ponceau S (B) 공개 지 단백질 ("LP")입니다. 표시 된 Coomassie 스테인드 밴드 excised 고 MALDI MS tryptic 펩 티 드 ( 표 1참조)의 비 단백질으로 구분. PnrA 식별 하 고 여기에 설명 된 프로토콜에 의해 분석 되었다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56842/56842fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56842/56842fig3.jpg"> 그림 3: 니트로의 극성 이온 풍요와 프로필 변경 씻어 솔루션. (A) trypsin 부분 여러 내부 펩 티 드 조각 그림 2에 표시 된 PnrA E. faecalis 단백에 해당 표시 됩니다. 10% (B) 20% (C) 이기 씻어 분수 쇼 신호 강도 변화와 개별 봉우리의 전체 수에 있는 감소. (D) 최종 차입 분수에서 N 맨끝 lipopeptide와 풍부한 높은 m /z 997, 별표 (*)로 표시. 각 스펙트럼의 강도 신호 강렬의 비교에 대 한 (A) 로 정규화 됩니다. 봉우리 대중과 할당 된 시퀀스는 표 2에 나열 됩니다. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56842/56842fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>밴드</td>
			<td colspan="2">단백질 ID</td>
			<td>승인 번호</td>
			<td>표준시 분자량</td>
			<td>펩 티 드 수</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="2">신장 인자 Tu</td>
			<td>gb | EOL37301.1 |</td>
			<td>43,387</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="2">NADH 과산화 효소</td>
			<td>gb | EOL34572.1 |</td>
			<td>49,520</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="2">pyruvate 효소 E1component, 알파 소 단위</td>
			<td>gb | EOL34709.1 |</td>
			<td>41,358</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="2">pyruvate 효소 E1 구성 요소, 소 단위 베타</td>
			<td>gb | EOL34710.1 |</td>
			<td>35,373</td>
			<td>19</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="2">30 대 ribosomal 단백질 S2</td>
			<td>gb | EOL33066.1 |</td>
			<td>29,444</td>
			<td>16</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td colspan="2">30 대 ribosomal 단백질 S3</td>
			<td>gb | EOL37312.1 |</td>
			<td>24,355</td>
			<td>14</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 침전 된 단백질은 단백 비 오염. 단백질 tryptic 다이제스트 및 MALDI MS에 의해 확인 되었다에서 젤 소화 프로토콜19 표준을 사용 하 고 위에서 아래로 Coomassie 젤 그림2에서에 표시 하는 동일한 순서로 나열 됩니다. 각 단백질은으로 신뢰 구간 (C.I.) 95% 이상 확인 되었다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>최대 수</td>
			<td>이론적인 질량</td>
			<td>단백질 위치</td>
			<td>롤 놓친된 컷된 사이트의</td>
			<td colspan="2">펩 티 드 순서</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>631.3409</td>
			<td>170-176</td>
			<td>0</td>
			<td colspan="2">GVADAAK</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>675.4035</td>
			<td>316-321</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">TKEAVK</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>826.4093</td>
			<td>163-169</td>
			<td>0</td>
			<td colspan="2">FQAGFEK</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>893.4839</td>
			<td>121-128</td>
			<td>0</td>
			<td colspan="2">NVVSATFR</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>943.5359</td>
			<td>240-247</td>
			<td>0</td>
			<td colspan="2">VWVIGVDR</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>1040.5047</td>
			<td>188-197</td>
			<td>0</td>
			<td colspan="2">YAASFADPAK</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>1200.6331</td>
			<td>273-284</td>
			<td>0</td>
			<td colspan="2">GVGTAVQDIANR</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>1316.6997</td>
			<td>290-301</td>
			<td>0</td>
			<td colspan="2">FPGGEHLVYGLK</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>1385.7827</td>
			<td>83-94</td>
			<td>0</td>
			<td colspan="2">FNTIFGIGYLLK</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>1432.743</td>
			<td>149-162</td>
			<td>0</td>
			<td colspan="2">VGFVGGEEGVVIDR</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>1568.7802</td>
			<td>259-272</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">DGKEDNFTLTSTLK</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>1672.8289</td>
			<td>240-254</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">VWVIGVDRDQDADGK</td>
		</tr>
<tr>
<td>13</td>
			<td>1707.8184</td>
			<td>129-145</td>
			<td>0</td>
			<td colspan="2">DNEAAYLAGVAAANETK</td>
		</tr>
<tr>
<td>14</td>
			<td>1724.8027</td>
			<td>35-49</td>
			<td>0</td>
			<td colspan="2">SFNQSSWEGLQAWGK</td>
		</tr>
<tr>
<td>15</td>
			<td>1797.9228</td>
			<td>257-272</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="2">TKDGKEDNFTLTSTLK</td>
		</tr>
<tr>
<td>16</td>
			<td>1872.9854</td>
			<td>285-301</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">ALEDKFPGGEHLVYGLK</td>
		</tr>
<tr>
<td>17</td>
			<td>1945.9613</td>
			<td>230-247</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">DLNESGSGDKVWVIGVDR</td>
		</tr>
<tr>
<td>18</td>
			<td>2240.1345</td>
			<td>149-169</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">VGFVGGEEGVVIDRFQAGFEK</td>
		</tr>
<tr>
<td>19</td>
			<td>2675.2543</td>
			<td>230-254</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="2">DLNESGSGDKVWVIGVDRDQDADGK</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 대 중 고 해당 tryptic 펩 티 드. E. faecalis PnrA의 트립 신 소화에서 철 (은행: EOL37280.1)은 PeptideMass20,21을 사용 하 여 수행, 사이트 컷 최대 2 개의 보고를 허용. 그림 3 에 스펙트럼에서 관찰 하는 봉우리의 이론적인 대 중 해당 펩 티 드 순서에 따라 나열 됩니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56842/56842fig4.jpg"> 그림 4: E. faecalis 단백 PnrA의 MALDI TOF MS입니다. (A) 의 부모 MS 스펙트럼은 m / E. faecalis PnrA의 N 맨끝 lipopeptide에 해당 하는 z 997 지역. (B) lipopeptide 피크의 MS/MS는 진단 N-acylated dehydroalanyl 펩 티 드 파편 이온 피크와 별표 (*)로 표시 된 lyso 양식 다는 것을 보여준다. 해명된 구조 (C)표시 됩니다. 이 그림은 이전 게시9에서 수정 되었습니다. 제공 RI: 상대 강도 <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56842/56842fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56842/56842fig5.jpg"> 그림 5: 나트륨 adduct 형성 촉진 dehydroalanyl lipopeptide 이온으로 부모 이온 조각화. (청록색 흔적) 없이 대장균 단백 Lpp N 맨끝 펩 티 드의 (A) MALDI TOF 스펙트럼과 (블루 트레이스) 탄산수 소 나트륨의 추가. 최종 eluted 분수 나트륨 중 탄산염의 추가 부모 lipopeptide의 계산 된 질량에서 22 다 증가 발생합니다. 해당 sodiated 이온 (C) 의 MS/MS 스펙트럼 표시 N으로 상당한 특혜 조각화 protonated 이온 (B)의 MS/MS 스펙트럼과 비교 했을 때-acyl-중립 통해 dehydroalanyl 이온 별표 (*)로 표시 된 diacylthioglyceryl moiety 제거 부모 triacylated Lpp N 맨끝 tryptic 펩 티 드의 구조 (D) 와 N-acyl-dehydroalanyl 펩 티 드 파편 이온 (E) 표시 됩니다. 이 그림은 이전 게시9에서 수정 되었습니다. 제공 RI: 상대 강도 <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56842/56842fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

세균성 단백질 질량 분석에 의하여 구조 결심에 대 한 N 맨끝 Lipopeptides의 준비의 농축

비 이온 계면 활성 제 단계 분할 메서드를 사용 하 여 세균성 단백질의 농축 TLR 분석 실험에 직접 사용 또는 다른 응용 프로그램에 대 한 설명 합니다. 추가 단계 구조 특성에 대 한 N 맨끝 tryptic lipopeptides를 준비 하는 질량 분석에 의해 자세히 나와 있습니다.

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.6K 조회수.  Pennsylvania State University. 비 이온 계면 활성 제 단계 분할 메서드를 사용 하 여 세균성 단백질의 농축 TLR 분석 실험에 직접 사용 또는 다른 응용 프로그램에 대 한 설명 합니다. 추가 단계 구조 특성에 대 한 N 맨끝 tryptic lipopeptides를 준비 하는 질량 분석에 의해 자세히 나와 있습니다.

비디오: Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

연구

화학

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. Alternatively, other (phospho)lipases may be physically associated with the producing organism causing a turnover of intrinsic lipids and frequently giving rise to a remodeling of the cellular membranes. Although potential (phospho)lipases can be predicted with a number of algorithms when the gene/protein sequence is available, experimental proof of the enzyme activities, substrate specificities, and potential physiological functions has frequently not been obtained. This manuscript describes the optimization of assay conditions for prospective (phospho)lipases with unknown substrate specificities and how to employ these optimized conditions in the search for the natural substrate of a respective (phospho)lipase. Using artificial chromogenic substrates, such as p-nitrophenyl derivatives, may help to detect a minor enzymatic activity for a predicted (phospho)lipase under standard conditions. Having encountered such a minor enzymatic activity, the distinct parameters of an enzyme assay can be varied in order to obtain a more efficient hydrolysis of the artificial substrate. After having determined the conditions under which an enzyme works well, a variety of potential natural substrates should be assayed for their degradation, a process that can be followed employing distinct chromatographic methods. The definition of substrate specificities for new enzymes, often provides hypotheses for a potential physiological role of these enzymes, which then can be tested experimentally. Following these guidelines, we were able to identify a phospholipase C (SMc00171) that degrades phosphatidylcholine to phosphocholine and diacylglycerol, in a crucial step for the remodeling of membranes in the bacterium Sinorhizobium meliloti upon phosphorus-limiting conditions of growth. For two predicted patatin-like phospholipases (SMc00930 and SMc01003) of the same organism, we could redefine their substrate specificities and clarify that SMc01003 is a diacylglycerol lipase.

Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.

리파제 및 포스 후보자에 대한 기질 특이성을 정의

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

생화학

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

초성능 액체 크로마토그래피에 의한 조성 분석을 위한 세균세포벽의 격리 및 준비

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of virion morphogenesis. Quantitative lipid droplet proteome analysis can be used to identify proteins that localize to or are displaced from lipid droplets under conditions such as virus infections. Here, we describe a protocol that has been successfully used to characterize the changes in the lipid droplet proteome following infection with HCV. We use Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC) and thus label the complete proteome of one population of cells with &#34;heavy&#34; amino acids to quantitate the proteins by mass spectrometry. For lipid droplet isolation, the two cell populations (i.e.&#160;HCV-infected/&#34;light&#34; amino acids and uninfected control/&#34;heavy&#34; amino acids) are mixed 1:1 and lysed mechanically in hypotonic buffer. After removing the nuclei and cell debris by low speed centrifugation, lipid droplet-associated proteins are enriched by two subsequent ultracentrifugation steps followed by three washing steps in isotonic buffer. The purity of the lipid droplet fractions is analyzed by western blotting with antibodies recognizing different subcellular compartments. Lipid droplet-associated proteins are then separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Coomassie staining. After tryptic digest, the peptides are quantified by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Using this method, we identified proteins recruited to lipid droplets upon HCV infection that might represent pro- or antiviral host factors. Our method can be applied to a variety of different cells and culture conditions, such as infection with pathogens, environmental stress, or drug treatment.

Lipid droplets are important organelles for the replication of several pathogens, including the Hepatitis C Virus (HCV). We describe a method to isolate lipid droplets for quantitative mass spectrometry of associated proteins; it can be used under a variety of conditions, such as virus infection, environmental stress, or drug treatment.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the majority of exogenous fatty acids are present within host lipoprotein particles. Uncertainty remains as to the reservoirs of host fatty acids and the mechanisms by which bacteria extract fatty acids from the lipoprotein particles. In this work, we describe protocols for enrichment of low-density lipoprotein (LDL) particles from chicken egg yolk and determining whether LDLs serve as fatty acid reservoirs for S. aureus. This method exploits unbiased lipidomic analysis and chicken LDLs, an effective and economical model for the exploration of interactions between LDLs and bacteria. The analysis of S. aureus integration of exogenous fatty acids from LDLs is performed using high-resolution/accurate mass spectrometry and tandem mass spectrometry, enabling the characterization of the fatty acid composition of the bacterial membrane and unbiased identification of novel combinations of fatty acids that arise in bacterial membrane lipids upon exposure to LDLs. These advanced mass spectrometry techniques offer an unparalleled perspective of fatty acid incorporation by revealing the specific exogenous fatty acids incorporated into the phospholipids. The methods outlined here are adaptable to the study of other bacterial pathogens and alternative sources of complex fatty acids.

This method provides a framework for studying incorporation of exogenous fatty acids from complex host sources into bacterial membranes, particularly Staphylococcus aureus. To achieve this, protocols for the enrichment of lipoprotein particles from chicken egg yolk and subsequent fatty acid profiling of bacterial phospholipids utilizing mass spectrometry are described.

세균성 병원체 지방산 을 막 인지질로 통합하는 연구를 위해 닭 계란 노른자에서 지단백질 입자의 분리

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral membrane enzymes, resulting in triacylated proteins. The first step in the lipoprotein modification pathway involves the transfer of a diacylglyceryl group from phosphatidylglycerol onto the prolipoprotein, resulting in diacylglyceryl prolipoprotein. In the second step, the signal peptide of prolipoprotein is cleaved, forming an apolipoprotein, which in turn is modified by a third fatty acid derived from a phospholipid. This last step is catalyzed by apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). The lipoprotein modification pathway is essential in most &#947;-proteobacteria, making it a potential target for the development of novel antibacterial agents. Described here is a sensitive assay for Lnt that is compatible with high-throughput screening of small inhibitory molecules. The enzyme and substrates are membrane-embedded molecules; therefore, the development of an in vitro test is not straightforward. This includes the purification of the active enzyme in the presence of detergent, the availability of alkyne-phospholipids and diacylglyceryl peptide substrates, and the reaction conditions in mixed micelles. Furthermore, in order to use the activity test in a high-throughput screening (HTS) setup, direct readout of the reaction product is preferred over coupled enzymatic reactions. In this fluorometric enzyme assay, the alkyne-triacylated peptide product is rendered fluorescent through a click-chemistry reaction and detected in a multiwell plate format. This method is applicable to other acyltransferases that use fatty acid-containing substrates, including phospholipids and acyl-CoA.

Presented here is a sensitive fluorescence assay to monitor apolipoprotein N-acyltransferase activity using diacylglyceryl peptide and alkyne-phospholipids as substrates with click-chemistry.

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan structure are fairly conserved across all bacteria, there is also considerable variation between Gram-positives/negatives and between species. In addition, there are numerous known variations, modifications, or adaptations to the peptidoglycan that can occur within a bacterial species in response to growth phase and/or environmental stimuli. These variations produce a highly dynamic structure that is known to participate in many cellular functions, including growth/division, antibiotic resistance, and host defense avoidance. To understand the variation within peptidoglycan, the overall structure must be broken down into its constitutive parts (known as muropeptides) and assessed for overall cellular composition. Peptidoglycomics uses advanced mass spectrometry combined with high-powered bioinformatic data analysis to examine peptidoglycan composition in fine detail. The following protocol describes the purification of peptidoglycan from bacterial cultures, the acquisition of muropeptide intensity data through a liquid chromatograph&#8212;mass spectrometer, and the differential analysis of peptidoglycan composition using bioinformatics.

This protocol covers a detailed analysis of peptidoglycan composition using liquid chromatography mass spectrometry coupled with advanced feature extraction and bioinformatic analysis software.

액체 크로마토그래피, 질량 분석법 및 생물정보학에 의한 펩티도글리칸의 반정량 분석

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug discovery because they are the targets of more than half of all drugs. An obstacle to conducting biochemical, biophysical, and structural studies of membrane proteins as well as antibody development has been the difficulty in producing large amounts of high-quality membrane protein with correct conformation and activity. Here we describe a &#8220;bilayer-dialysis method&#8221; using a wheat germ cell-free system, liposomes, and dialysis cups to efficiently synthesize membrane proteins and prepare purified proteoliposomes in a short time with a high success rate. Membrane proteins can be produced as much as in several milligrams, such as GPCRs, ion channels, transporters, and tetraspanins. This cell-free method contributes to reducing the time, cost and effort for preparing high-quality proteoliposomes, and provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

This protocol describes an efficient cell-free method for production of high-quality proteoliposome by bilayer-dialysis method using wheat cell-free system and liposomes. This method provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

막 단백질을 표적으로 하는 기능 분석 및 항체 개발을 위한 프로테올리포좀의 무세포 생산

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown into highly ordered two-dimensional (2D) crystals under favorable conditions. The quality of the grown 2D crystals is crucial to the resolution of the final reconstruction via 2D image processing. Over the years, lipid monolayers have been used as a supporting layer to foster the 2D crystallization of peripheral membrane proteins as well as soluble proteins. This method can also be applied to 2D crystallization of integral membrane proteins but requires more extensive empirical investigation to determine detergent and dialysis conditions to promote partitioning to the monolayer. A lipid monolayer forms at the air-water interface such that the polar lipid head groups remain hydrated in the aqueous phase and the non-polar, acyl chains, tails partition into the air, breaking the surface tension and flattening the water surface. The charged nature or distinctive chemical moieties of the head groups provide affinity for proteins in solution, promoting binding for 2D array formation. A newly formed monolayer with the 2D array can be readily transfer into an electron microscope (EM) on a carbon-coated copper grid used to lift and support the crystalline array. In this work, we describe a lipid monolayer methodology for cryogenic electron microscopic (cryo-EM) imaging.

Lipid monolayers have been used as a foundation for forming two-dimensional (2D) protein crystals for structural studies for decades. They are stable at the air-water interface and can serve as a thin supporting material for electron imaging. Here we present the proven steps on preparing lipid monolayers for biological studies.

전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

High-Resolution Studies of Proteins in Natural Membranes by Solid-State NMR

Membrane proteins are vital for cell function and thus represent important drug targets. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopy offers a unique access to probe the structure and dynamics of such proteins in biological membranes of increasing complexity. Here, we present modern solid-state NMR spectroscopy as a tool to study structure and dynamics of proteins in natural lipid membranes and at atomic scale. Such spectroscopic studies profit from the use of high-sensitivity ssNMR methods, i.e., proton-(1H)-detected ssNMR and DNP (Dynamic Nuclear Polarization) supported ssNMR. Using bacterial outer membrane beta-barrel protein BamA and the ion channel KcsA, we present methods to prepare isotope-labeled membrane proteins and to derive structural and motional information by ssNMR.

This work details robust basic routines on how to prepare isotope-labeled membrane protein samples and analyze them at high-resolution with modern solid-state NMR spectroscopy methods.

Membrane proteins are vital for cell function and thus represent important drug targets. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopy ...