이 작품 가능한 덕분에 의해 지원 되었다: 파 비아 대학 FRG 2016; 파 르 마 대학 FIL 2014, 2016; 그리고이 연구를 수행 하는 데 필요한 plasticware 공급에 대 한 자세. 닥터 쉐 인 윈저 (공학 부, 브리스톨 대학, 영국)는 Cell_PIV 소프트웨어를 제공 하는 감사 합니다.

동물 관련 된 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 및 파 비아 대학에서 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 동물 22 ° C, 60% 공기 습도와 명암 주기 12:12 h의 조건 하에서 유지 되었다.
1. 난소 격리
<ol><li>Intraperitoneally 2 4-11 주 된 CD1 여성 쥐 10 U 여 포 호르몬을 자극 하는 살 균 1 mL 인슐린 주사기의 주사.</li>
	<li>46-48 h를 기다립니다.</li>
	<li>Zoletil (Tiletamina, Zolazepan cloridrate)의 50 mg/kg의 근육 주사와 anesthetize 및 마우스 무게. 자 궁 경부 전위에 의해 안락사.</li>
	<li>피부 절 개 집게의 쌍을 사용 하 여 복 벽을 덮고 파악. 피부를 잘라 하 고 한 쌍의가 위와 풀으로 체 벽 집게와 절 개를 엽니다.</li>
	<li>핀셋의 쌍을 사용 하 여, 배 짱, 자 궁 뿔을 정확 하 고 그들의 말단에 난소를 지역화 이동 합니다.</li>
	<li>부드럽게 시계 집게를 사용 하 여 난소를 누른 자 궁에 그것의 인 대를 잘라가 위를 사용 합니다. 다른 난소와 반복.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2 공기에서에서 미리 예 열 하는 M2 절연 매체의 1 mL를 포함 하는 35 mm 셀 문화 페 트리 접시에 수집 된 난소를 전송 합니다.</li>
	<li>지방과 stereomicroscope에서 좋은 위를 사용 하 여 수 란 관을 제거 합니다.</li>
</ol>2입니다. 격리 적 운 Oocyte 단지의
<ol><li>찔린 antral 적 운 oocyte 단지 (COCs)는 수 동적으로 해제 될 때까지 멸 균 핀셋 및 1 G 메 마른 인슐린 바늘을 사용 하 여 난소 표면 합니다.</li>
	<li>적 운 세포는 입 제어 손을 뽑아 파스퇴르 micropipette (직경에서 200 µ m)를 사용 하 여 3 개 이상의 레이어 COCs를 수집 하 고 신선한 M2 매체의 300 µ L 방울으로 그들을 전송.</li>
	<li>부드럽게 몇 초 동안 밖으로 pipetting으로 oocytes 손으로 뽑아 파스퇴르 micropipette (직경에서 80 µ m)를 사용 하 여 주변 적 운 세포를 제거</li>
	<li>반복 해 서 전송 oocytes M2 매체의 20 µ L 드롭에서 또 하나, 적 운 세포는 완전히 제거 될 때까지.</li>
</ol>3. chromatin Oocyte 조직 기반 분류
<ol><li>5 mg/mL 1 x PBS에 희석의 어머니 솔루션에서 M2 중간 시작에 0.05 µ g/mL의 최종 농도에 Hoechst 33342 얼룩 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>3.5 µ L 마이크로 방울 Hoechst 얼룩 솔루션 35 mm 페 트리 접시의 뚜껑의 하단에 배치 합니다.</li>
	<li>각 단일 oocyte Hoechst 얼룩 드롭으로 전송 하 고 미리 따뜻하게 (37 ° C) 난방 접시에 접시를 놓고 조명 박람회를 피하기 위해 어두운 뚜껑으로 커버.</li>
	<li>보육 실 온에서 10 분, 후 더 이상 1-2 s는 oocytes UV 빛 (330-385 nm), 아래에서 10 배 확대에 형광 현미경으로 관찰 합니다.</li>
	<li>그들은 핵소체를 둘러싼 Hoechst 긍정적인 chromatin의 반지를 선물 하는 경우 oocytes 둘러싸여 핵소체 (SN) (그림 1A)로 분류 합니다.</li>
	<li>그들의 핵소체 Hoechst 긍정적인 chromatin 둘러싸이 지 고 쇼 분산 (그림 1B) 핵 내의 heterochromatic 명소 oocytes 하지 둘러싸여 핵소체 (NSN)으로 분류 합니다.</li>
</ol>4. 신경 네트워크 기반 Oocyte 분류
<ol><li>4 준비와 5% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청, 2 mM L-글루타민, 5mm 황소자리, 100 U/mL 페니실린, 75 µ g/mL 스 35 m m 유리로 23.5 µ µ g/L 나트륨 pyruvate 보충 하는 α-MEM 매체의 2 µ L 방울 페 트리 접시 바닥 및 함께 그들을 커버 미리 데워 진된 (37 ° C) 그리고 중간 증발을 피하기 위해 미리 equilibrated 미네랄 오일. 참고: 라이브 셀 검 진 시스템을 사용 하는 경우 유지를 특정 거리에서 지침으로 7 x 7 mm의 그려진된 격자를 사용 하 여.</li>
	<li>각 드롭 전송 3-4 oocytes입니다.</li>
	<li>시간 경과 기록 소프트웨어를 갖춘 라이브 셀-심사 시스템으로 유리 하단 페 트리 접시를 놓습니다 (참조 테이블의 자료), 안정적인 온도 (37 ° C)와 CO2 환경에서 oocyte 성숙의 관측을 허용 하 농도 (5%).</li>
	<li>시간 경과 기록 소프트웨어를 엽니다. 화면에서 창 왼쪽에 oocyte 라이브 샷 모든 설정 버튼 오른쪽에 나타납니다.</li>
	<li>화면의 중앙에 배치 하려면 oocyte의 중심을 선택 합니다. 필요 하다 면 초점을 조정 합니다.</li>
	<li>전화 버튼을 선택 하 고 192; 디 아 램프 를 설정합니다 노출 시간 을 1/125 s; 이득 1.99; 그리고 해상도 를 1600 x 1200.</li>
	<li>FL2 선택한 5; 디 아 램프 를 설정합니다 노출 시간 을 3 s; 이득 에 2.37; 그리고 해상도 를 1600 x 1200.</li>
	<li>문화 드롭 내 oocyte 위치를 기록 하기 위해 새 포인트 버튼을 선택 합니다. 문화 드롭 내 각 oocyte에 대해 동일한 루틴을 반복 합니다.</li>
	<li>시간 을 선택 하 고 8 분 및 15h 총 시간 에 수집 주기 를 설정 합니다.</li>
	<li>녹화 주기를 시작할 시작 시간 을 선택 합니다.</li>
	<li>MATLAB 소프트웨어를 열고 쓰기 >>cell_piv; 고 PIV 도구를 선택 합니다.</li>
	<li>기록된 영화를 포함 하는 폴더를 선택 하 고 전체 이미지 시퀀스를 로드 하려면.jpeg 파일을 선택 합니다. 각 oocyte 관심 (ROI) 영역 선택 영역 도구를 클릭 하 여 선택 합니다.</li>
	<li>파일 메뉴에서 프로세스 PIV 를 선택 합니다. 뷰어 도구 단추를 선택 합니다. 참고: 프로그램 투자 수익 내 속도 벡터를 계산 하 고.mat 파일으로 저장 된 데이터 파일을 자동으로 생성.</li>
	<li>열려는.mat 파일을 선택 합니다. 버튼 선택 ROI 도구 를 선택 하 고 개요는 oocyte의 원을 그립니다. 파일 메뉴에서 저장을 클릭 합니다. 참고:이 지역에서 벡터 표시 됩니다 하 고 평균 크기 데이터가 그래프 창에서이 새로운 투자 수익에 대 한 업데이트.</li>
	<li>오픈 전체 시간 경과 프레임의 수집된 평균 크기 데이터 기록, 행, 프레임 시퀀스에와, 열에는 스프레드시트에 각 단일 oocyte 분석.</li>
	<li>10 하위 그룹으로 NSN와 SN oocytes의 데이터를 구성 합니다.</li>
	<li>9 하위 그룹을 사용 하 여 반복적으로 피드 포워드 인공 신경 네트워크 훈련 (FANN) 및 블라인드 테스트 1 하위 그룹.<ol>
<li>다른 반복 9 번 변경 블라인드 테스트 샘플 (10 교차 유효성 검사).</li>
	</ol>
</li>
	<li>MATLAB, 맞춤 스크립트 주요 실행 열고, 요청 시, 학습 데이터 (train.txt), NSN과 SN oocytes 사용 교육 및 시간 경과 간격 (일반적으로,에서 분석할 수 있는 파일의 이름을 삽입합니다 프레임 # 1-2 프레임 # 112-113).</li>
	<li>훈련을 수행 하기 위해 입력 을 누릅니다.</li>
	<li>테스트 데이터 (test.txt) 파일의 이름을 삽입 합니다.</li>
	<li>MATLAB 작업 공간에서 벡터 test_outputs_cyt 를 엽니다. 참고: 창이 나타납니다, 첫 번째 행, NSN과 SN oocytes에 대 한 진실한 확실성 (TP 또는 진정한 NSN)와 틀린 확실성 (FP 또는 False NSN)를 각각; 얻을 확률을 보여주는 화면에 대신, 두 번째 행에 각각 False 네거티브 (FN 또는 False SN)과 NSN과 SN oocytes에 대 한 진정한 원판 (테네시 또는 진정한 SN)을 확률에서.</li>
	<li>수식을 사용 하 여: (TP+TN)/(TP+FP+FN+TN), 백분율로 표시 FANN 정확도 계산 하.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Patrizio, P., Fragouli, E., Bianchi, V., Borini, A., Wells, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+methods+for+selection+of+the+ideal+oocyte.">Molecular methods for selection of the ideal oocyte.</a> Reprod. Biomed. Online. 15 (3), 346-353 (2007).</li><li>Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+value+of+oocyte+morphology+in+human+IVF:+a+systematic+review+of+the+literature.">Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature.</a> Human. Reprod. Update. 17 (1), 34-35 (2011).</li><li>Tan, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+configurations+in+the+germinal+vesicle+of+mammalian+oocytes.">Chromatin configurations in the germinal vesicle of mammalian oocytes.</a> Mol. Hum. Reprod. 15 (1), 1-9 (2009).</li><li>Vigone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+based+identification+of+mouse+cumulus+cell+markers+that+predict+the+developmental+competence+of+their+enclosed+antral+oocytes.">Transcriptome based identification of mouse cumulus cell markers that predict the developmental competence of their enclosed antral oocytes.</a> BMC Genomics. 14, 380 (2013).</li><li>Bui, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+movement+profiles+of+mouse+surrounding+nucleolus+and+not-surrounding+nucleolus+antral+oocytes+during+meiotic+resumption.">Cytoplasmic movement profiles of mouse surrounding nucleolus and not-surrounding nucleolus antral oocytes during meiotic resumption.</a> Mol. Reprod. Dev. 84 (5), 356-362 (2017).</li><li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+during+mouse+oocyte+growth.">Chromatin organization during mouse oocyte growth.</a> Mol. Reprod. Dev. 41 (4), 479-485 (1995).</li><li>Zuccotti, M., Garagna, S., Merico, V., Monti, M., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organisation+and+nuclear+architecture+in+growing+mouse+oocytes.">Chromatin organisation and nuclear architecture in growing mouse oocytes.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 234 (1-2), 11-17 (2005).</li><li>Zuccotti, M., Merico, V., Cecconi, S., Redi, C. A., Garagna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+it+take+to+make+a+developmentally+competent+mammalian+egg?.">What does it take to make a developmentally competent mammalian egg?.</a> Hum. Reprod. Update. 17 (4), 525-540 (2011).</li><li>Inoue, A., Nakajima, R., Nagata, M., Aoki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+oocyte+nucleus+and+cytoplasm+to+the+determination+of+meiotic+and+developmental+competence+in+mice.">Contribution of the oocyte nucleus and cytoplasm to the determination of meiotic and developmental competence in mice.</a> Hum. Reprod. 23 (6), 1377-1384 (2008).</li><li>Ajduk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythmic+actomyosin-driven+contractions+induced+by+sperm+entry+predict+mammalian+embryo+viability.">Rhythmic actomyosin-driven contractions induced by sperm entry predict mammalian embryo viability.</a> Nat. Commun. 2, 417 (2011).</li><li>Swann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-&#950;-induced+Ca2++oscillations+cause+coincident+cytoplasmic+movements+in+human+oocytes+that+failed+to+fertilize+after+intracytoplasmic+sperm+injection.">Phospholipase C-&#950;-induced Ca2+ oscillations cause coincident cytoplasmic movements in human oocytes that failed to fertilize after intracytoplasmic sperm injection.</a> Fertil. Steril. 97 (3), 742-747 (2012).</li><li>Thakur, A., Mishra, V., Jain, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feed+forward+artificial+neural+network:+tool+for+early+detection+of+ovarian+cancer.">Feed forward artificial neural network: tool for early detection of ovarian cancer.</a> Sci. Pharm. 79 (3), 493-505 (2011).</li><li>Laudani, A., Lozito, G. M., Riganti Fulginei, F., Salvini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+Training+Efficiency+and+Computational+Costs+of+a+Feed+Forward+Neural+Network:+A+Review.">On Training Efficiency and Computational Costs of a Feed Forward Neural Network: A Review.</a> Comput. Intell. Neurosci. 2015, 818243 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

하나 마우스 oocytes 뿐만 아니라 다른 종족 들이 프로토콜을 수행 하는 동안 알아서 해야 합니다 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 일단 그들의 여 포에서 격리, oocytes 한다 즉시 전송 기록 방울에 동반자 적 운에서 분리 트리거 세포로 GV MII 전환 시작. 현재 프로토콜을 가능한 수정 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)의 추가 M2 매체 COCs 절연을 위해 사용 될 수 있습니다. IBMX GV MII 전환의 즉각적인 발생을 방지 하 고 oocytes의 전체 실험 그룹의 동기화 수 있습니다.
라이브 셀 심사 시스템 ( 재료의 표참조) 우리의 실험에 사용 된 4 방울, 따라서 실험 당 16 oocytes의 총 당 4 oocytes 성숙 상품의 수를 제한 합니다. 시스템 사용 하 여 다른 시간 경과 라이브 셀-상영, 상업적으로 사용 가능 하 고 여러 문화 챔버에 장착이 한계를 극복할 수 수 있습니다.
우리의 경험을 바탕으로, 기록 간격 프레임 및 다음 중요 한 포인트입니다. 다양 한 예비 실험 후 우리 이미지 모든 8 분 때문에 했다 이것은 새싹 vescicle 고장 등 돌출 GV MII 전환 하는 동안 발생 하는 주요 이벤트의 명확한 관측을 허용 하는 최소 시간 창 첫 번째 극 몸. 이 시간 창 수 재평가 때 다른 종의 oocytes를 관찰 해야 합니다.
이 방법의 단점은 후자 더 GV MII 전환 개선 알려져 있습니다 그들의 주변 적 운 세포의 부재에 oocytes의 문화 이다. 이 관계를 우리 연구소는 지금 테스트 보고 프로토콜에 약간의 수정 적 운 세포 지류 층에 적 운 무료 oocytes의 문화를 포함 하 여.
자연, FANN는 고정된 된 수의 입력 (분석된 CMV 모듈 수) 및 출력 (중 발달 능력 또는 무능 한 oocyte) 신경, 하지만 숨겨진된 뉴런 수 재판을 보정을 통해 조사에 의해 선택 된다 최고의 예측 성능을에 접근입니다. 우리의 경우, 우리는 숨겨진된 뉴런의 서로 다른 숫자와 함께 실험을 하 고 3 최상의 결과 준 발견. 또한, FANN 분석 강력한 통계를 얻기 위해 입력된 데이터 (우리의 실험 112 CMV 모듈)의 많은 수를 요구 한다. 필요한 입력된 데이터의 수를 줄일 수 있는 가능한 개선 지원 벡터 기계, 등 대체 분류 도구를 사용 하는 트리-가방, 또는 KNN 분류자. FANN 분석의 견고성을 보여줍니다 때 1 단계 절차에서 제거 될 수 있습니다.
이 프로토콜, 마우스에 대 한 설정 인간을 포함 한 다른 종의 oocytes에 테스트 수 있습니다. 또한, 시간 경과의 조합 PIV 및 신경망 분석 zygotes10,11 와 그들의 추가의 평가 위한 preimplantation 배아 CMVs의 관측을 위해 악용 될 수 있습니다 기록 개발 잠재력입니다.

여성 불 임 여성의 증가 수에 영향을 주는 병 이다. 세계 보건 기구에 따르면 약 20% 커플의 되지 않습니다 비옥한, 여성 불 임 인 40%. 또한, 암 치료를 받고 여자의 1/3 (300000/년 및 30000/년 미국이 나 이탈리아, 각각) 조기 난소 실패를 개발.
암 환자에서 불 임 방지 하는 전략 (GV MII 전환) MII 단계로 GV oocytes 분리와 뒤 에서 체 외 성숙 (IVM) 종양학 치료 전 난소 낭의 cryopreservation입니다. 수정와 개발 프로세스와 전체 임신 성공1,2oocyte 발달 능력의 비-침략 적 마커의 가용성 향상 것 이다.
Supravital 형광 색소 Hoechst 33342와 얼룩 후 관찰 그들의 염색 질 구성에 따라 가득 포유류 oocytes는 포위 핵소체 (SN) 또는 하지 포위 핵소체 (NSN)3로 분류 됩니다. 그들의 다른 chromatin 조직 외에 이러한 두 가지 유형의 oocytes 많은 형태학 상과 기능적인 차이3,,45,6,7,8 표시 ,9, meiotic 및 발달 그들의 능력을 포함 하 여. 난소에서 분리 하 고 생체 외에서성숙 하는 때 모두 oocytes의 MII 무대를 입력 하 고 정자 수정 후 2-셀 단계로 개발 하지만 SN chromatin 조직 들만 기간9를 개발할 수 있습니다. 비록 좋은 유능한 대 무능 한 oocytes를 선택 하기 위한 분류 방법으로, 주요 단점은 자체 형광 색소와 무엇 보다도 자외선의 검색에 사용 되는 셀에 있을 수 있는 돌연변이 효과.
모든 이러한 이유로, 우리는 동일한 높은 분류 정확도 유지 하면서 Hoechst의 사용을 대체할 수 있는 SN 또는 NSN chromatin 구조와 관련 되었던 다른 비-침략 적 표시에 대 한 검색. 세포질 운동 속도 (CMVs)의 경과 관찰 셀 상태의 독특한 기능으로 떠오르고 있다. 예를 들어 최근 학문 CMVs 사이 협회 기록 수정 시간과 완료 preimplantation 및 전체 용어 개발10,11마우스 및 인간의 zygotes의 용량에서 설명 했다.
이러한 이전 연구를 바탕으로, 우리가 여기 발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 oocytes5,6,,78의 인식에 대 한 플랫폼을 설명 합니다. 플랫폼 기반으로 세 가지 주요 단계: 1) Oocytes antral 낭에서 격리는 먼저 둘러싸여 핵소체 (SN) 또는 아닙니다 포위 핵소체 (NSN); 그림 뿐만 아니라 그들의 chromatin 구성 중 하나에 따라 분류 각 단일 oocyte의 GV MII 전환 하는 동안 발생 하는 CMVs의 2) 시간 경과 이미지 촬영 및 분석 입자 이미지 velocimetry (PIV); 그리고 3) PIV와 얻은 데이터 분석으로 피드 포워드 인공 신경 네트워크 (FANN) 맹인 분류12,13. 우리는 그것을 테스트 하 고 다른 포유류 종 (예, 소, 원숭이 및 인간)에 대 한 사용 가능한 준비 하도록 마우스에 대 한 설계 절차의 가장 중요 한 단계의 세부 정보를 준다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1257">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Folligon</td>
			<td style="width:239px;">Intervet</td>
			<td style="width:157px;">A201A02</td>
			<td style="width:499px;">Hormonal treatment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Hoechst 33342&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">B2261</td>
			<td>For oocyte heterochromatin staining</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:363px;">Cell culture Petri-dish 35 mm x 10 mm&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:157px;">430165</td>
			<td>For COCs isolation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:363px;">EmbryoMax M2 Medium (1X), Liquid, with phenol red</td>
			<td style="width:239px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:157px;">MR-015-D</td>
			<td>For COCs isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Alpha medium (1X) + Glutamax&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">M4526</td>
			<td>For oocyte in vitro maturation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture Petri-dish 35 mm glass-bottom&#160;</td>
			<td style="width:239px;">WillCo&#160;</td>
			<td style="width:157px;">GWSt-3522</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">BioStation IM-LM&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Nikon</td>
			<td style="width:157px;">MFA91001</td>
			<td>Live cell screening system&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Pasteur pipette</td>
			<td style="width:239px;">Delchimica Scientific Glassware</td>
			<td>6709230</td>
			<td>For follicles manipulation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">M8410</td>
			<td>To prevent contamination and medium evaporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Penicillin / Streptomycin</td>
			<td style="width:239px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">15070063</td>
			<td>To prevent medium contamination&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">ML16141079</td>
			<td>For making up &#945;MEM medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:157px;">25030</td>
			<td>For making up &#945;MEM medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taurine</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">T0625</td>
			<td>For making up &#945;MEM medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">A3310</td>
			<td>For making up &#945;MEM media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium pyruvate&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">&#160;P4562</td>
			<td>For making up &#945;MEM media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zoletil (Tiletamina and Zolazepan cloridrate)</td>
			<td style="width:239px;">Virbac Srl</td>
			<td style="width:157px;">QN01AX9</td>
			<td>For mice anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:363px;">Cell_PIV sofware&#160;</td>
			<td style="width:239px;">Kindly provided by Dr. Shane Windsor, University of Bristol, UK</td>
			<td style="width:157px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;-</td>
			<td style="width:499px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;-</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MATLAB</td>
			<td style="width:239px;">The MathWorks, Natick, MA&#160;</td>
			<td style="width:157px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; &#160;-</td>
			<td>For multi-paradigm numerical computing</td>
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a neural network-based identification of developmentally competent or incompetent mouse fully-grown oocytes

불 임 클리닉 발달 유능한 대 무능 한 oocytes 전반적인 임신 결과 향상 비-침략 적 절차를 사용 하 여 선택 하는 기능에서 도움이 됩니다. 우리는 최근 그들의 체 외에서 성숙 germinal 소포 (GV)에서 세포질 움직임의 분석 이어서 분열 II 단계 동안 마우스 oocytes의 미세한 라이브 관측에 따라 분류 방법 개발 이 경과 기간 동안 발생 하는. 여기, 우리는이 절차의 상세한 프로토콜을 제시. Oocytes 가득 antral 낭에서 격리 되며 15 h 37 ° C, 5% CO2시간 경과 분석 위해 현미경 내부에 대 한 교양. 사진은 8 분 간격으로 찍힌다. 이미지 각 oocyte 대 한 세포질 이동 속도 (CMVs) 문화 기간에 걸쳐 발생의 프로 파일을 계산 하는 입자 이미지 Velocimetry (PIV) 방법을 사용 하 여 분석 된다. 마지막으로, 각 단일 oocyte의 CMVs는 발달 관할 또는 91.03%의 정확도로 무능 한 배우자의 확률을 예측 수학 분류 도구 (피드 포워드 인공 신경 네트워크, FANN)를 통해 먹인 다. 이 프로토콜, 마우스에 대 한 설정 인간을 포함 한 다른 종의 oocytes에 지금은 테스트 수 있습니다.

그림 2 는 각각 처음 (GV) 및 끝 (MII) IVM 절차의 대표적인 발달 유능 하 고 무능 한 oocyte를 보여준다. IVM 가득 마우스 oocytes의 15 h 문화 발생합니다. 시간 경과 관찰 감수 분열의 진행을 기록 하 고는 GVBD와 첫 번째 극 시체의 돌출을 포함 하 여 주요 meiotic 이벤트 감지.
분석 및 비교 무능 한 oocytes 발달 유능한 대 이상 2 백의 감수 분열의 진행에서 시간 차이 보였다. 특히, NSN oocytes에서 GVBD는 크게 지연 1-2 시간 경과 프레임, PB1 압출 15 프레임 지연으로 발생 하는 반면. 이러한 차이도 불구 하 고 가변성은 단일 oocyte 분류를 허용 하도록 너무 높다. 이 절차는 수학적 분류 도구 구현 되었습니다.
그림 3 의 수학적 분류 도구 사용, 명명 된 피드 포워드 인공 신경 네트워크 (FANN) 보여 줍니다. 각 oocyte 통해 먹이, 대 한 FANN 동시에 확률은 생식 체 발달 능력 및 무능 한 일 가능성을 제공 합니다. 우리의 실험에는 FANN 91.03%의 평균 정확도와 마우스 oocytes를 분류.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56668/56668fig1.jpg"> 그림 1 . 대표 SN과 NSN oocytes Hoechst 33342 물. 고립과 Hoechst 33342 형광 색소와 얼룩, 다음 가득 oocytes 분류로 핵소체 (SN)를 포위 (A) 또는 하지의 링의 핵소체 (NSN) (B), (화살표)의 존재 유무에 따라 각각 포위 Hoechst 긍정적인 섬으로 핵소체를 둘러싼입니다. 눈금 막대: 5 µ m <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56668/56668fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56668/56668fig2.jpg"> 그림 2 . 시간 경과 이미지의 입자 이미지 Velocimetry 분석. PIV 분석의 결과 각 분석 113 시간 프레임에 대 한 밝은 필드 이미지 아래 표시 됩니다. 그림 (GV) 시작과 끝 (MII) 녹음 과정입니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56668/56668fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56668/56668fig3.jpg"> 그림 3 . 피드 포워드 인공 신경 네트워크의 도식 대표. FANN는 발달 능력 또는 무능 한 oocytes를 분류 하는 데 사용 하는 수학적 도구입니다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56668/56668fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

여기, 선물이 oocyte 발달 능력 그들의 체 외에서 성숙 germinal 소포에서 분열 II 단계 동안 수행의 비-침략 적 평가 대 한 프로토콜. 이 방법은 입자 이미지 velocimetry (PIV)와 신경망 분석 시간 경과 영상을 결합합니다.

발달 능력 또는 무능 한 마우스 가득 Oocytes의 신경 네트워크 기반 식별

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

a-neural-network-based-identification-developmentally-competent-or

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K 조회수.  University of Pavia. 여기, 선물이 oocyte 발달 능력 그들의 체 외에서 성숙 germinal 소포에서 분열 II 단계 동안 수행의 비-침략 적 평가 대 한 프로토콜. 이 방법은 입자 이미지 velocimetry (PIV)와 신경망 분석 시간 경과 영상을 결합합니다.

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Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

연구

발생학

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, cell culture has been widely used in developmental biology studies. However, it is important to determine whether in vitro cultured cells truly represent in vivo cell types. Grafting cells into embryos, followed by an assessment of their contribution during development is a useful method to determine the potential of in vitro cultured cells. In this study, we describe a method for grafting cells into a defined site of early postimplantation mouse embryos, followed by ex vivo culture. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing precise localization and adjustment of the number of cells receiving exogenous DNA with both high transfection efficiency and low cell death. These techniques, which do not require any specialized equipment, render experimental manipulations of the gastrulation and early organogenesis-stage mouse embryo possible, allowing analysis of commitment in cultured cell subpopulations and the effect of genetic manipulations in situ on cell differentiation.

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

초기 Postimplantation 마우스 배아로 세포 나 DNA를 정확하게 현지화 전송하는 방법

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Isolation and Characterization of Mouse Antral Oocytes Based on Nucleolar Chromatin Organization

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded Nucleolus) or unable (NSN, Not Surrounded Nucleolus) to develop to the blastocyst stage after in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF). It makes use of Hoeschst33342 (or any other DNA intercalating dye) able to bind to the heterochromatin of the nucleolus showing a ring in the SN oocytes or not, like in the NSN oocytes. This represents the easiest and quickest way to sort both antral oocytes that can be eventually used for IVM or IVF procedures. 
Briefly, the protocol consists of the following steps: hormone injection to stimulate follicular growth; isolation of the oocytes at the GV stage from the antral compartment by puncturing the ovary with a sterile needle; preparation of thin glass pipettes for mouth pipetting of the oocytes; sorting of the oocytes with Hoechst33342 prepared at a supravital concentration; IVM, IVF or any other molecular/cellular analysis.
Unfortunately there are still few evidences to sort SN and NSN oocytes using less invasive techniques. If and once they will be identified, they could be potentially applied to human assisted reproductive technologies, although with several aspects that should be modified. To date, this technique has potential implications to dramatically increase IVM and IVF successful procedures in both endangered and species with economic interest.

Here we present a protocol for the characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar organization.

핵소체 염색질 조직을 바탕으로 마우스 전 정부 난 모세포의 분리 및 특성

This protocol describes a simple and quick method to isolate and characterize mouse antral GV (Germinal Vesicle) oocytes as able (SN, Surrounded ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural intermediacy between the rodent and human hippocampi, is therefore a valuable model in which to study adult neurogenesis. In vitro culture assays are an essential component of characterizing neurogenesis and adult neural precursor cells, allowing for precise control over the cellular environment. To date however, culture protocols for canine cells remain under-represented in the literature. Detailed here are systematic protocols for the isolation and culture of hippocampal neural precursor cells from the adult canine brain. We demonstrate the expansion of canine neural precursor cells as floating neurospheres and as an adherent monolayer culture, producing stable cell lines that are able to differentiation into mature neural cell types in vitro. Adult canine neural precursors are an underused resource that may provide a more faithful analogue for the study of human neural precursors and the cellular mechanisms of adult neurogenesis.

The canine brain is a valuable model in which to study adult neurogenesis. Presented here are protocols for isolating and expanding adult canine hippocampal neural precursor cells from primary brain tissue.

분리 및 성인 개 해마 신경 전구체의 확장

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

마우스에서 초기 임신 특성에 대 한 3 차원 높은-주파수 초음파의 새로운 사용

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ability to study cell movements and differentiation in vivo is still very difficult. Neurocristopathies, or disorders of the neural crest lineage, are particularly challenging to study due to a lack of accessibility of key embryonic stages and the difficulties in separating out the neural crest mesenchyme from adjacent mesodermal mesenchyme. Here, we set out to establish a well-defined, routine protocol for the culture of primary cranial neural crest cells. In our approach we dissect out the mouse neural plate border during the initial neural crest induction stage. The neural plate border region is explanted and cultured. The neural crest cells form in an epithelial sheet surrounding the neural plate border, and by 24 h after explant, begin to delaminate, undergoing an epithelial-mesenchymal transition (EMT) to become fully motile neural crest cells. Due to our two-dimensional culturing approach, the distinct tissue populations (neural plate versus premigratory and migratory neural crest) can be readily distinguished. Using live imaging approaches, we can then identify changes in neural crest induction, EMT and migratory behaviors. The combination of this technique with genetic mutants will be a very powerful approach for understanding normal and pathological neural crest cell biology.

This protocol describes the dissection and culture of cranial neural crest cells from mouse models, primarily for the study of cell migration. We describe the live imaging techniques used and the analysis of speed and cell shape changes.

신경 문장 세포 박리 및 이동의 연구를 위한 마우스에서 1 차적인 두개골 신경 문장 세포의 해부, 문화 및 분석

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Micro-CT 화상 진찰을 위한 성인 및 초기 산후 마우스 폐의 혈관 주조

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

미성숙한 고양이 오키트의 최소 볼륨 바이트화

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...