이 작품은 국립 과학 재단 (NSF)에 의해 지원 되었다 no를 부여. IOS 1354956입니다. 우리 닥터 앤드류 D. 워렌 (나비목 및 생물 다양성, 플로리다 자연사 박물관의, 프로 리 다의 대학에 대 한 맥과 어 센터) 나비 이미지를 사용 하는 허가 대 한 감사 합니다.

1. 곤충 종, 솔루션 및 먹이 역 설치의 준비
참고: 양배추 나비 (배 rapae L., 흰나비과) 선택 됩니다 대표 나비목의 종족으로 그들은 액체 이해 능력과 놓이고 형태학22,23의 이전 연구에서 사용 된 때문에. 집 파리 (파리 자리 부채 L., Muscidae)과 파란색 병 파리 (Calliphora vomitoria L., Calliphoridae) 때문에 그들은 종종 다공성 표면13에 먹이 관찰 하는 데 사용 됩니다.
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	<li>23 ° C와 18 L: 6D photoperiod 순서 P. rapae pupate 환경 챔버를 성인으로 등장 하기 전 까지는 인공에 그들 ( 재료의 표참조) 다이어트는 곤충 공급 업체 및 후방에서 애벌레로 설정 합니다. M주문입니다. 부채 및 pupae로 C. vomitoria 및 P. rapae으로 같은 환경 조건에서 후면. 그들은 먹이 실험 전에 번데기에서 등장 하는 후 성인 나비와 파리를 먹이 하지 마십시오.</li>
	<li>20% 자당 해결책 (제어) 및 유체 통풍 관에 대 한 테스트 20% 자당 나노 솔루션을 준비 합니다. 형광 자기 나노 입자를 추가 하 여 나노 솔루션을 준비 (철 산화물 polyacrylic 산 코팅, 약 20 nm 직경에서) 20% 자당 솔루션 (1 mg/mL의 dH2O 나노 20% 자당과24 솔루션, 1:1)입니다. 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 1 배 솔루션 준비 (10 x 1 x dH2O, pH 7.4에에서 희석), 해 사용 되는.</li>
	<li>클램프와 별도 먹이 단계 (플랫 플랫폼) 수동 조작으로 구성 된 먹이 스테이션을 설정 (그림 1). 먹이 무대에 오목 슬라이드를 놓고 숨 구멍 크기 직경 1, 5, 8, 11, 20, 30, 41, 또는 60 µ m 및 멤브레인 필터의 기 공 크기 직경 나일론 그물 필터 또는 먹이 실험에 대 한 인근 10 µ m.</li>
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2. 먹이 프로토콜
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	<li>곤충의 몸, 다리, 및 날개 접힌된 휴지로 바꿈. 머리와 mouthparts 노출 되도록 곤충을 놓습니다. 곤충 먹이 단계 (그림 1) 위에 중단 되도록 조작자에 클램프에 의해 함께 개최 됩니다 두 현미경 슬라이드 사이 곤충의 날개를 놓습니다.</li>
	<li>오목 슬라이드의 중심에 20% 자당 해결책 또는 20% 자당 나노 솔루션은 micropipette 30 µ L 물방울을 관리 합니다. 되도록 필터 종이의 중심 나노 솔루션의 물방울과 오목 슬라이드에 특정 기 공 크기의 단일 필터 종이 놓습니다. 드롭릿에 필터 종이 사이의 접촉 확산 따라 필터, 숨 구멍 (그림 1)를 작성 하는 솔루션에 발생 합니다. 참고: 필터 종이 곤충 피드 필터 종이 위에 나노 입자의 잠재적인 존재를 최소화 하기 위해, 다른 방법 보다는 오히려 작은 물방울, 위에 배치 됩니다.</li>
	<li>mouthparts의 원심 영역 으로만 먹이 단계 (그림 1)에 젖은 필터 종이 연락할 수 있도록 조작자와 곤충을 놓습니다. 곤충 핀을 사용 하 여 확장 필터 종이에 mouthparts 45에 대 한 피드에 곤충을 허용을 s.</li>
	<li>필터 종이의 표면에 있을 수 있는 액체 영화에 먹이 곤충의 기회를 최소화 하기 위해 위치는 mouthparts를 (즉슬라이드의 평평한 부분에 닿아 필터 종이의 부분 접촉. 슬라이드의 오목한 부분 위에 직접). 곤충 먹이에 대 한 관심을 표현 하지 않습니다, 경우는 mouthparts 먹이 시간 동안 곤충 핀 필터 종이에 개최 수 있습니다.</li>
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3입니다. 해
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	<li>곤충의 몸을 커버 하는 충분 한 솔루션 되도록 PBS 솔루션을 50 m m 시계 유리에 놓습니다. 장소는 stereoscope 옆 장비 (봄 마이크로 위, 곤충 핀, 괜 찮 포인트 집게를 해 부 해 부)을 해 부 위치와 stereoscope 곤충 아래 시계 유리.</li>
	<li>수 유, 후 티슈 페이퍼에서 곤충을 제거 하 고 날개 폐쇄와 그것을 잡고. 봄 마이크로 해가 위로 머리, 다리, 및 곤충의 날개를 제거 하 고 시계 유리 (그림 2)에서 PBS 솔루션에 곤충을 놓습니다.</li>
	<li>필요한 경우, anesthetize 해 전에 곤충. 집게를 사용 하 여 복 부의 원심 영역 근처 표 피에 의해 곤충을 잡아. 지배적인 손을 가진 봄 마이크로 해 부가 위를 사용 하 여 복 부, 흉부에이 때까지 후부 끝에서 시작의 측면을 따라 앞쪽으로 표 피를 잘라. 표 피만 잘라 고 (그림 2) 손상 곤충 내부 영양 운하는 특별 한 주의 분리 했습니다.</li>
	<li>복 부 (그림 2) 내부 영양 운하를 공개 하 여 해가 위 표 피의 추가 컷을 확인 합니다. 곤충 핀의 도움으로 복 부 표 피, 뚱뚱한 몸, 및 다른 구조를 제거 하 고 후속 처리, 시계 유리에는 흉부 및 영양 운하를 떠나 시계 유리 밖에 서 그들을 재배치. 주: 해 부는 흉부와 복 부의 시점 근처 골목 같은 구조 (영양 운하 확장) 자르기, 발표할 예정 이다.</li>
	<li>자르기는 노출 되지 않습니다 경우 작물은 계시 될 때까지 위와 흉부에 추가 incisions 확인 합니다. 일단 자르기 표시, 시계 유리 (그림 2)에서 작물 영양 운하만 떠나는 곤충의 나머지 부분을 버려야 됩니다. 참고: lepidopteran 작물은 거의 투명 하 고 셀로판 같은 경우 하지 체액으로 가득 이며 확장을 인식 하기 어려울 수 있습니다 자연, 또는 경우 그것은 해 부 동안에.</li>
	<li>Coverslip (24 x 24 mm)에 자르기를 좋은 포인트 집게 해 부를 사용 하 여 후속 이미징 (그림 2).</li>
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4입니다. 섭취 한 나노 입자의 결정
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	<li>위치 좋은 포인트 해 집게를 사용 하 여에서 coverslip에 자르기 자르기 파열을 방지 하기 위해 신경. 20 배 확대에 이미징 거꾸로 confocal 현미경에 CY3 채널 (또는 단계 대조)를 사용 합니다. 밖으로 건조에서 그것을 방지 하기 위해 절 개 후 즉시 자르기 이미지.</li>
	<li>현미경의 운영 단계의 제어에 손에 바 (41.3 m m 길이 직경에서 8 m m) 자석 저 어를 개최.</li></ol>파 자르기 (자르기에서 약 10 m m 거리) 근처 앞 뒤로 자석 볶음 바 각각 앞뒤로 모션 발생 약 1 초 (그림 2).
	<li>마그네틱 볶음 바 흔들었다는 나노 입자에 대 한 자르기 있는지 검사 합니다. 천천히 앞뒤로 거의 투명 한 작물 안에 나노 입자 운동에 대 한 현미경의 눈 렌즈를 통해 찾고 있는 동안 운영 단계를 이동 합니다. 나노 입자는 작물에, 긍정적인 수 유를 나타내는 그들은 응답 합니다 (그림 2) 바 저 어는 자기와 함께 한 마음으로 파.</li>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+morphology+of+the+feeding+apparatus+and+evolution+of+proboscis+length+in+metalmark+butterflies+(Lepidoptera:+Riodinidae).">Functional morphology of the feeding apparatus and evolution of proboscis length in metalmark butterflies (Lepidoptera: Riodinidae).</a> Biol J Linn Soc. 110, 291-304 (2013).</li></ol>

저자는 공개 없다.

곤충 진드기 기능 역사적으로 심한 형태학의 학문에서 유추 (예., 마시는 밀 짚25,26lepidopteran 코 기능 관련); 그러나, 실험적 증거를 통합 하는 최근 연구 곤충 mouthparts 및 구조-기능 관계2,,1213 의 복잡성에 대 한 우리의 이해에 패러다임의 변화 결과 , 22 , 27.23전자 현미경 검사 법, confocal 현미경 검사 법22, 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT)28및 레이저 절제 단층 (그림 3), 스캔 등 현대적인 이미징 기술을 제공 기회에 대 한 상세한 형태학의 학문, 기능에 대 한 증거 실험으로 동반 되어야 합니다.
여기 설명 하는 방법을 보여 주입구 때 다공성 표면 접촉에서 먹이 곤충에 의해 고용 하는 필수적인 메커니즘을 수 있습니다. 사용 하 여 동작을 먹이 (예.,12,17프로 빙) 혼자 것 하지 밝혀졌다이 먹이 메커니즘으로 일부 개인 들 mouthparts와 표면 탐지 피드, 특히 그 제공 하지 못했습니다 필터 종이와 크기 직경 놓이고 도관의 직경 보다 작은 기 공. 또한, 액체 가득 했는지 확인 하는 작물의 검사도 하지 충분 한 것, 액체의 양을 섭취에 이러한 실험은 너무 작아 시각적 평가, 즉, 일부 곤충의 작물 deflated, 등장 하지만 나노 유체 섭취 했다 나타내는 여전히 존재 했다.
처리 작은 곤충, 곤충 핀 들 mouthparts를 조작 해 나타내는 몇 가지 중요 한 단계 및 기술된 방법론의 한계 주의 수행 하는 능력. 예를 들어 해 시계 유리에 PBS 솔루션 (아마도 나노 솔루션을 포함 하는) 작물의 내용이 혼합 때문에 벌레를 연구에 대 한 사용할 수 없게 렌더링 작물 절단 귀착되 경우가 있었다 그것 만들기 나노 입자의 섭취를 확인 하기가 어렵습니다. 또한, 곤충의 표 피의 자동 형광 나노 입자; 시각화 하 유일한 방법으로 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 방해할 수 있습니다. 그러나, 단계 대조 confocal 이미징이이 문제를 제거와 시각적 평가 (그림 2), 또한 왜 자기 나노 입자를 사용 하 여 형광 나노만 반대로 최적의 하이라이트에 대 한 또 다른 의미를 제공 합니다. 이 프로토콜을 제공 하지만 체액을 섭취 하는 곤충에 대 한 능력을 평가 하는 수단, 한계 중 하나는 그들이 섭취 되 고; 하는 동안은 나노 입자를 시각화 하는 방법을 제공 하지 않습니다. 따라서, 유체 역학을 공부 하 고 이해 과정에 대 한 가능성을 제거 합니다.
여기에 설명 된 기술에는 적은 양의 체액을 섭취 하는 곤충의 능력을 평가 하기 위한 방법을 제공 한다. 액체 먹이 곤충의 거 대 한 다양성을 감안할 때,이 프로토콜 수 수 고용 곤충의 다른 연구에 그들의 mouthparts에 마이크로 및 나노 크기의 도관. 또한, 미래 연구 수를 사용 하 여 비슷한 기법 체액 여행 영양 운하를 통해 예를 들어, 일부 혈액 먹이 곤충에 관측 된 작물을 우회 또는 얼마나 오래 체액 검사 연구 남아 특히 경로 확인 구조, midgut 또는 hindgut, 등으로 수 유, 해, 및 이미징 사이의 시간 고려.

많은 곤충 그룹 있다 mouthparts (proboscises) 액체에 먹이 대 한 적응, 꿀, 과일, 썩 어 등 수액 흐름 (예: Diptera1, 나비목2, Hymenoptera3), xylem (Hemiptera4), 눈물 (나비목 5)과 혈액 (Phthiraptera6, Siphonaptera7, Diptera7, Hemiptera8, 나비목9). 곤충의 체액에 피드 기능은 생태계 건강 (예: 수 분10), 질병 전송4,11, biodiversification2,12및 연구와 관련 수렴 진화13의. 다양 한 음식 소스에 불구 하 고 일부 액체 먹이 곤충 가운데 테마 마이크로 또는 나노 크기의 방울, 액체 필름 또는 다공성 표면에 국한 될 수 있는 액체의 작은 금액을 확보 하는 기능입니다.
액체 먹이 곤충 (20% 이상 모든 동물 종14,15)과 다양 한 음식 소스에 피드를 자신의 능력의 광범위 한 다양성을 감안할 때 그들의 먹이 이해 행동 및 액체 흡수 메커니즘은 많은 분야에서 중요 한. 곤충 진드기 기능, 예를 들어, 생체 모방 기술, 예를 들면, 소량 고용 된 것과 유사한 방법을 사용 하 여 체액의 수집 등의 작업을 수행할 수 있는 미세 소자의 개발에 역할을 담당해 왔습니다. 곤충16 그러나 유체 통풍 관 기계 장치,,의 연구에 근본적인 문제 뿐만 아니라 어떻게 곤충 체액에 피드 결정 이지만 메커니즘을 지 원하는 실험적인 증거를 획득. 전적으로 동작을 사용 하 여 (예: 코12,17프로 빙)로 먹이 대 한 지표로 충분 한 체액의 성공적인 이해를 확인 하지 않습니다 없으며 경로 결정 하는 방법 때문에 그 체액 여행 곤충을 통과. 또한, 소량 액체 더 나은 실험 수행 자연 먹이 시나리오를 어디 체액 제한 리소스2,12나타냅니다.
위상 대비 영상 어떻게 나비 다공성 표면12에서 체액의 작은 금액에 대 한 피드를 평가 하기 위해 바둑의 나비 (별 plexippus L.)와 함께 사용 되었다 엑스레이 모나 크 나비 코 따라 cuticular 계획 (legulae 등) 사이의 공간을 통해 모 세관 작업을 사용 하 여 음식 운하에 작은 구멍에 국한 하는 체액을가지고. 들어오는 액체 음식 운하 벽에 성장 하 고 고원 불안정12,18, 다음 머리에 빠는 펌프의 행동에 의해 나비의 용기에 운송 하 여 액체 다리에 붕괴에 영화를 형성 합니다. 기술은 쉽게 사용할 수 있는 x 선 위상 대비 영상 곤충12,19,,2021내부 유체 흐름을 시각화 하는 최적의 도구 이지만, 더 편리 하 고 메서드는 글귀 체액을 곤충의 능력의 빠른 평가 위해 필요 하 고 그들을 섭취.
D. plexippus 에 대 한 먹이 메커니즘 다른 나비목 및 파리 (Diptera) (다공성 표면에서 액체에 피드 두 그룹), 경우 확인 하려면 Lehnert 외. 13 여기에서 보고 되는 다공성 표면에서 작은 양의 액체에 먹이 곤충의 능력을 평가 하기 위한 기술 적용. 접촉을 사용 하는 연구 및 다공성 표면에 대 한 여기에 설명 된 프로토콜 이지만, 주소 풀 먹이 메커니즘 같은 다른 연구 방법론을 변경할 수 있습니다. 또한, 응용 프로그램 마이크로 및 bioinspired 기술을 포함 하 여 다른 필드를 확장 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>20% sucrose solution</td>
			<td>Domino Sugar</td>
			<td></td>
			<td>Sugar needed to produce the sucrose solution with dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10X concentration diluted to 1X in dH2O for insect dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single depression concave slide</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>BS-C6</td>
			<td>Slide is necessary for feeding stage setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>NY6004700 (60 &#181;m)</td>
			<td>Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>NY4104700 (41 &#181;m)</td>
			<td>Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>NY3004700 (30 &#181;m)</td>
			<td>Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>NY2004700 (20 &#181;m)</td>
			<td>Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>NY1104700 (11 &#181;m)</td>
			<td>Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>TCTP04700 (10 &#181;m)</td>
			<td>Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>TETP04700 (8 &#181;m)</td>
			<td>Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>TMTP04700 (5 &#181;m)</td>
			<td>Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>RTTP04700 (1 &#181;m)</td>
			<td>Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris microdissecting scissors</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>623555</td>
			<td>Scissors used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins (#1)</td>
			<td>Bioquip Products</td>
			<td>1208B1</td>
			<td>Pins used during dissections and feeding trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra-fine point dissecting forceps</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>624684</td>
			<td>Dissecting equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 C Stereoscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>M205 C</td>
			<td>Stereoscope used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX81</td>
			<td>Fluorescent microscope used to detect magnetic nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand PTFE Disposable Stir Bar</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>S68067</td>
			<td>Magnet used to detect nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Science Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>34155</td>
			<td>Tissues used to secure insects during feeding trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>House fly (Musca domestica) pupae</td>
			<td>Mantisplace.com</td>
			<td></td>
			<td>insects for experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue bottle fly (Calliphora vomitoria) pupae</td>
			<td>Mantisplace.com</td>
			<td></td>
			<td>insects for experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabbage butterfly (Pieris rapae) larvae</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>144102</td>
			<td>insects for experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F1&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4641080N</td>
			<td>micropipette for dispensing liquids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finntip 250 pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>9400250</td>
			<td>micropipette tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Glass cover slides (=coverslips) (24 x 24 mm)</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>CS-S24-100</td>
			<td>coverslips for viewing the insect&#39;s crop on confocal microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the ingestion of fluorescent, magnetic nanoparticles for determining fluid-uptake abilities in insects

액체 먹이 곤충 섭취 다양 한 환경에 풀, 필름로 또는 작은 구멍에 액체. 액체 수집의 연구 필요 평가 놓이고 구조와 함수 관계; 그러나, 액체 흡수 메커니즘 구조 건축, 실험적인 증거와 때때로 동반된의 관측에서 역사적으로 유추 됩니다. 여기, 우리 보고 나비 (나비목)와 비행 거리 (Diptera) 액체의 소량을 사용 하 여 액체 이해 능력을 평가 하기 위한 새로운 방법. 곤충은 20% 자당 해결책 특정 기 공 크기의 필터 논문에서 형광, 자성 나노 입자와 혼합으로 먹인 다. 자르기 (유체를 저장 하는 데 사용 되는 내부 구조)는 곤충에서 제거 하 고는 confocal 현미경에 배치. 자석이 곤충 체액을 섭취 수 있습니다 나타내는 나노 입자의 존재를 확인 하는 작물에 의해 손을 흔들었다. 이 방법론은 광범위 한 먹이 하는 메커니즘 (모 세관 작용 및 액체 다리 형성)은 잠재적으로 공유할 나비목과 Diptera 때 다공성 표면에서 먹이 공개 하는 데 사용 됩니다. 또한,이 방법은 먹이 액체 먹이 곤충, 질병 전송 및 biomimetics, 나노 또는 마이크로 크기의 회로 포함 하는 잠재적으로 다른 연구에서 그 중요 한을 포함 하 여 다양 한 가운데 메커니즘의 연구에 대 한 사용할 수 있습니다 어디 액체 수송 필요 확인을 합니다.

액체 먹이 곤충 가운데 액체 이해 능력에 패턴의 연구 먹이 발생 하는 시기의 결정을 필요 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 나비목 및 Diptera13중 제한 기 공 크기 가설을 테스트 하는 데 사용 됩니다. 제한 기 공 크기 가설 기 공 크기 직경12먹이 도관 직경 보다 작으면 액체 채워진 구멍에서 액체 먹이 곤충 먹이 수 없는 상태. 모 공에는 액체를 유지 하는 모 세관 압력을 극복 하 고 액체 표면에 빠는 펌프에 대 한 제공을 다공성 표면에서 들어오는 체액 고원 불안정18를 통해 안정적인 액체 다리를 형성 해야 합니다. 다양 한 크기 (그림 3)의 도관을 먹이 함께 곤충 그들은 먹을 수 있는 작은 숨 구멍 크기에 다 예상 됩니다.
각 종족에 대 한 제한 기 공 크기 필터 종이13의 특정 기 공 크기에 대 한 피드를 테스트 하는 개인의 50%에 대 한 능력에 따라 계산 됩니다. 곤충 먹이 20% 자당 해결책 (제어) 그들의 작물에 나노 입자를 필요 없었다. 곤충 경우 나노 입자 섭취 했다 평가 하는 해 부 했다, 후 그들의 mouthparts 원심 및 인접 지역 (그림 3)에 도관을 측정 하는 confocal 현미경으로 몇 군데 있었다. 그것은 중요 한 위치 어디 체액은 mouthparts, 즉, 진드기 도관 크기 사이의 긴밀 한 관계를 입력 하 고 제공할 수 있는 기 공 크기 제한의 지표로 서 간접 역할 수도 있기 때문에 원심 및 인접 측정 되었다 모 세관 작용을 촉진 하는 진드기 구조에 대 한 증거입니다. P. rapae 의 proboscises에 대 한 음식 채널의 직경 팁 지역 (원심 측정) 근처와 코 길이 (인접 지역)의 30%에서 측정 되었다. 5 pseudotracheae의 평균 직경 원심 측정으로 사용 되었다 고 구두 개통의 직경 각 비행 표본에 대 한 근 위 측정으로 측정 되었다.
이 프로토콜 원심 놓이고 도관 크기와 작은 숨 구멍 크기는 곤충 먹 일 수 있다 (그림 4) 사이의 긴밀 한 관계를 공개 했다. Dipteran 종 구강 (근 위 놓이고 측정)를 여는 대신 pseudotracheae (원심 놓이고 측정)에서 처음 발생에 대 한 증거는 유체 글귀 표시 다공성 표면 (그림 4)에서 공급 하는 경우. 흥미롭게도, 구조 아키텍처는 pseudotracheae의 lepidopteran mouthparts 비슷합니다 이며 모 세관 작용, 수렴 진화13의 예를 통해 유체 통풍 관을 올리기도 하는 cuticular 구조체의 구성 됩니다. 제한 사이의 긴밀 한 관계 기 공 크기와 진드기 도관 크기 나비목와 Diptera 유체 통풍 관에 대 한 중요 한 요소로 모 세관 작용을 지 원하는 증거를 제공 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56619/56619fig1.jpg"> 
그림 1: 실험 설치 및 먹이 역. (A) 설치 구성 휴지 (tp)에 곤충을 배치 하 고 두 슬라이드 (sl), 조정 가능한 손잡이 (ak) 조작 (ma)에 부착 된 클램프 (cl)에 의해 함께 개최 됩니다 사이 곤충의 날개를 배치. 곤충의 코 (홍보) 단계로 먹이 (st), 오목 슬라이드 (cs)를 관리 하는 나노 솔루션의 물방울 (dr)에 배치 된 필터 종이 (fp)는 낮 췄 다. 드롭릿 및 오목 슬라이드에 지의 배치를 보여주는 (B) 회로도 (C)는 나노의 작은 물방울 솔루션 다공성 먹이 표면을 만들 모 세관 작용을 통해 필터 종이 통해 (화살표)를 확산. (D) 형광 현미경 이미지 isopore의 지 보기의 나노 솔루션 (20 배 확대, CY3 채널) 보여주는 숨 구멍 (포) (10 µ m)를 필터링 합니다. 아니 액체 필름 표면에 관찰 되었다. (E) isopore 필터 (10 µ m)의 숨 구멍에서 나노 솔루션 (ns)를 표시 하는 Confocal 현미경 z 스택 이미지. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56619/56619fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56619/56619fig2.jpg"> 
그림 2: 해 부 및 나노 입자 탐지. (A) 겸 자 (fo) 곤충 (M. domestica 그림과, fl)를 확보 하는 데 사용 됩니다. (B)는 곤충의 날개, 머리, 다리 제거 됩니다. (C)가 위 (sc) 자르면 복 부의 측면 측면 하는 데 사용 됩니다. (D) 생식 구조 (예: 계란) 영양 운하의 불필요 한 부분 추가 집게로 제거 됩니다. (E) 추가 구조 자르기 (cr)을 분리 제거 됩니다. (F) 격리 자를 감지 하는 나노 입자의 존재에 대 한 준비. (G) 작물 커버 슬립 (cs)에 배치 되 고 거꾸로 confocal 현미경으로 이동 됩니다. 마그네틱 볶음 바 (ma) 나노 움직임을 자르기 근처 흔들었다. (H) 단계 대조 현미경 검사와 함께 C. vomitoria 의 작물에서 나노 운동 (빨간색 원에 명시). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56619/56619fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56619/56619fig3.jpg"> 
그림 3: Lepidoperan 및 dipteran 놓이고 구조. (A) 레이저 절제 단층 촬영 이미지 lepidopteran 코 (홍보), 푸드 채널 (fc)를 생성 하는 구조 (legulae)를 연결 하 여 함께 서 두 개의 길쭉한 상 악 galeae의 구성 되는 유체 통풍 관을 위해. 삽입 (confocal 현미경 이미지)는 코의 원심 영역 근처 등 legulae (dl)을 보여 줍니다. 지 legulae 사이 공간 음식 채널에 체액을가지고 모 세관 작용을 제공 합니다. (B) 각 C 모양의 galea는 기관지 (tr), 신경, 그리고 내장 근육 (im). 연단 (ro), haustellum, 그리고 작은 도관, pseudotracheae (pt) (삽입에 confocal 이미지에 표시 된), 중앙 구두 오프닝 (op)에서 방출 하는 원심 labellum (파운드) (C) Dipteran mouthparts에 의하여 이루어져 있다.레이저 절제 단층 촬영 이미지는 또한 화합물 눈 (ce)와 상 악 palpi (mp)를 보여 줍니다. 여 구강에 연결 (D) 음식 운하 부분적으로 labrum (라)와 labium (lm)의 구성입니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56619/56619fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56619/56619fig4.jpg"> 
그림 4: 곤충 mouthparts와 기 공 사이의 관계에서 그들이 먹을 수 있는 크기. 제한 기 공 크기는 인접 음식 운하 보다는 원심 놓이고 도관의 직경 (평균 ± SEM) 관련. 파리 자리 부채 아래 C. vomitoria. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56619/56619fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

액체 먹이 곤충 다공성 표면에서 액체의 분 양 취득 하는 기능이 있다. 이 프로토콜에는 직접 먹이 솔루션을 사용 하 여 형광, 자성 나노 입자와 다공성 표면에서 액체를 섭취 하는 곤충에 대 한 능력을 결정 하는 방법을 설명 합니다.

형광, 섭취 곤충에 액체 이해 능력을 결정 하기 위한 자성 나노 입자

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...

the-ingestion-fluorescent-magnetic-nanoparticles-for-determining

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

6.3K 조회수.  Kent State University at Stark. 액체 먹이 곤충 다공성 표면에서 액체의 분 양 취득 하는 기능이 있다. 이 프로토콜에는 직접 먹이 솔루션을 사용 하 여 형광, 자성 나노 입자와 다공성 표면에서 액체를 섭취 하는 곤충에 대 한 능력을 결정 하는 방법을 설명 합니다.

비디오: The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which include many crops such as cabbage, broccoli, Brussel sprouts etc. Rearing of the insects takes place on cabbage plants in the greenhouse. At least two cages are needed for the rearing of Pieris rapae. One for the larvae and the other to contain the adults, the butterflies. In order to investigate the role of plant hormones and toxic plant chemicals in resistance to this insect pest, we demonstrate two experiments. First, determination of the role of jasmonic acid (JA - a plant hormone often indicated in resistance to insects) in resistance to the chewing insect Pieris rapae. Caterpillar growth can be compared on wild-type and mutant plants impaired in production of JA. This experiment is considered "No Choice", because larvae are forced to subsist on a single plant which synthesizes or is deficient in JA. Second, we demonstrate an experiment that investigates the role of glucosinolates, which are used as oviposition (egg-laying) signals. Here, we use WT and mutant Arabidopsis impaired in glucosinolate production in a "Choice" experiment in which female butterflies are allowed to choose to lay their eggs on plants of either genotype. This video demonstrates the experimental setup for both assays as well as representative results.

Plant resistance to chewing insect herbivores can be tested in several ways. Here, we demonstrate how to set-up a choice and a no-choice experiment with the model plant Arabidopsis thaliana to identify resistance against the pest species Pieris rapae.

씹는 곤충에 A.의 thaliana의 저항을 테스트하기 위해 선택과 노 - 선택 Assays

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which ...

연구

생물학

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

이런 산화물로 hESCs과 hMSCs을 라벨링하는 MR 영상과 생체내 추적 비침습에 대한 Nanoparticles

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

카운팅 및 교양 세포의 생존을 결정

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

의 형광 라벨링 Drosophila 심장 구조

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

의 정화 M. magneticum 스트레인 AMB - 1 Magnetosome 관련 단백질 MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

운동하는 동안 에너지 시스템의 공헌을 결정

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to study the functions and evolution of bacterial symbionts in their host. As most symbionts cannot be cultured in vitro, methods to isolate an adequate quantity of bacteria for genome sequencing are very important. In the whitefly Bemisia tabaci, a number of endosymbionts have been identified and are predicted to be of importance in the development and reproduction of the pests through multiple approaches. However, the mechanism underpinning the associations remains largely unknown. The obstacle partially comes from the fact that the endosymbionts in whitefly, mostly restrained in bacteriocytes, are hard to separate from the host cells. Here we report a step-by-step protocol for the identification, extraction and purification of endosymbionts from the whitefly B. tabaci mainly by dissection and filtration. Endosymbiont samples prepared by this method, although still a mixture of different endosymbiont species, are suitable for subsequent genome sequencing and analysis of the possible roles of endosymbionts in B. tabaci. This method may also be used to isolate endosymbionts from other insects.

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Here, we present a protocol to isolate endosymbionts from the whitefly Bemisia tabaci through dissection and filtration. After amplification, the DNA samples are suitable for subsequent sequencing and study of the mutualism between endosymbionts and whitefly.

Whitefly에서 Endosymbionts의 추출을위한 방법<em&gt; 베미 시아 타바시</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /(T1)Magnetic Resonance Imaging

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible synthetic procedures. In this case, starting from FeCl3 and citrate trisodium salt, iron oxide nanoparticles coated with citric acid are obtained in 10 min in the microwave. These nanoparticles present a small core size of 4.2 &#177; 1.1 nm and a hydrodynamic size of 7.5 &#177; 2.1 nm. Moreover, they have a high longitudinal relaxivity (r1) value of 11.9 mM-1&#183;s-1 and a modest transversal relaxivity value (r2) of 22.9 mM-1&#183;s-1, which results in a low r2/r1 ratio of 1.9. These values enable positive contrast generation in magnetic resonance imaging (MRI) instead of negative contrast, commonly used with iron oxide nanoparticles. In addition, if a 68GaCl3 elution from a 68Ge/68Ga generator is added to the starting materials, a nano-radiotracer doped with 68Ga is obtained. The product is obtained with a high radiolabeling yield (&#62; 90%), regardless of the initial activity used. Furthermore, a single purification step renders the nano-radiomaterial ready to be used in vivo.

Synthesis of 68Ga Core-doped Iron Oxide Nanoparticles for Dual Positron Emission Tomography /T1Magnetic Resonance Imaging

Here, we present a protocol to obtain 68Ga core-doped iron oxide nanoparticles via fast microwave-driven synthesis. The methodology renders PET/(T1)MRI nanoparticles with radiolabeling efficiencies higher than 90% and radiochemical purity of 99% in a 20-min synthesis.

이중 양전자 방출 단층 촬영에 대 한 68가 코어 첨가 산화 철 나노 입자의 합성 / (T1) 자기 공명 이미징

Here, we describe a microwave synthesis to obtain iron oxide nanoparticles core-doped with 68Ga. Microwave technology enables fast and reproducible ...

High-Throughput Assays of Critical Thermal Limits in Insects

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are essential for predicting responses to climate change. This work describes two high-throughput protocols for measuring insect thermal limits: one for assessing critical thermal minima (CTmin), and the other for assessing heat knock down time (KDT) in response to a static heat stressor. In the CTmin assay, individuals are placed in an acrylic-jacketed column, subjected to a decreasing temperature ramp, and counted as they fall from their perches using an infrared sensor. In the heat KDT assay, individuals are contained in a 96 well plate, placed in an incubator set to a stressful, hot temperature, and video recorded to determine the time at which they can no longer remain upright and move. These protocols offer advantages over commonly used techniques. Both assays are low cost and can be completed relatively quickly (~2 h). The CTmin assay reduces experimenter error and can measure a large number of individuals at once. The heat KDT protocol generates a video record of each assay and thus removes experimenter bias and the need to continuously monitor individuals in real time.

Thermal limits can predict the environments organisms tolerate, which is valuable information in the face of rapid climate change. Described here are high-throughput protocols to assess critical thermal minima and heat knockdown time in insects. Both protocols maximize the throughput and minimize the cost of the assays.

곤충의 중요한 열 한계에 대한 높은 처리량 해석

Upper and lower thermal limits of plants and animals are important predictors of their performance, survival, and geographic distributions, and are ...