이 작품은 Fondo de Apoyo Investigación, 병원 Infantil 드 멕시코 페데리코 고메스 (프로젝트 번호 그-2014-053) 라와 CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE 프로젝트 번호 233061 Ezequiel M. 푸 엔 테 스-Pananá에 의해 지원 되었다. 프란 산체스 나 프로그램이 드 Doctorado en Ciencias Biomédicas, 대학 나시오날 Autónoma 드 멕시코 (UNAM)과 수신된 친목 231663 CONACYT에서에서 박사 학생입니다. E-S 나, 사회 보장 (IMSS)의 멕시코 연구소에서 제공 하는 금융 지원 인정.

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저자는 그들이 하지 않아도 어떤 상충 선언 합니다.

3D 공간 구조에서 상피 세포 성장 그리고 ECM 단백질의 상호 작용은 조직 항상성에 대 한. Monolayers (2D)에서 성장 하는 세포에 많은 암 연구 기반으로 되어, 비록 그들은 종양 형성 및 진행의 여러 측면을 이해 하는 데 중요 한 되어, monolayers ECM에 대 한 셀에 부과 하는 특징을 정리 하지 않습니다. 인스턴스: 확산, 접착 종속 세포 생존, 꼭대기 basolateral 극성, 개장 하는 ECM, 세포 분화, 등 제한 중요 한 것은, 뿐만 아니라 종양 세포와 ECM 사이 상호 작용은 암의 진행을 위한 필수 하지만 종양 및 비 종양 세포, 면역 세포 등 사이 통신 설립. 제공 하는 ECM에 의해 염증 반응을 이러한 상호 작용에 의해 추진 하 고이 염증 성 조건 만드는 방법 여기에 제공 된 프로토콜 환경 내에서 암 세포와 면역 세포 사이 상호 작용의 이해를 촉진 한 긍정적인 루프 monocytes의 chemoattraction과 암 세포의 더 많은 침략을 육성.
ECME를 사용 하 여의 큰 장점은 생물 비 계 실험 3D의 다양 한 수행 적합 모델22제공 이다. 그것은 ECM 등 laminin, 콜라겐 IV, entactin, heparan 황산 proteoglycan, 성장 인자, 상피 세포 상호 작용 수는 vivo에서 단백질 농축입니다. 불리는 murine sarcomas lysates에서 온다, 때문에 그들의 구성 요소의 농도 사이 변화 한다 다른 많은 것 이다. 그래서, 그것은 종종 더 균질 데이터를 얻기 위해 여러 많은 특성화 하는 데 필요한입니다. 각 새로운 많은 두 가지 방법으로 테스트 실험실에서: 1)의 MCF 10A 셀의 올바른 acini 형성 평가 하 여 고 2) BrC의 침입을 평가 하 여 셀 라인 잘 설립 침략 적 능력의. 또 다른 옵션은 히드로, 합성 nanofiber 펩 티 드 비 계는 다른 비 계 제품을 사용. 하이드로 겔23,24의 농도 조정 하 여 3D 문화의 강성을 제어할 수 있습니다. 중요 한 것은,이 시스템 연구 및 조 혈 종양 약 셀의 어떤 종류 또는 비 조 혈 세포 사이 상호 작용에 적용할 수 있습니다. 그것은 두 개 이상의 다른 세포 계보를 사용 하 여 더 복잡 한 시스템 설계 수 수 있습니다. 3D 모델의 중요 한 장점 중 하나입니다 그들은 셀 형태학 및 세포 조직 종양 변환 하는 동안 변경 되는 ECM 상호 작용에 의해 형성의 연구 허용. 마찬가지로, 하나 분해 저하 등의 종양 기능을 공부할 수 있는 셀 처음 직접 상호 작용/통신 홍보 서로 문화 신호의 다른 층에 배치 여부. 또한, 다른 세포 계보 그들은 주소를 사용 하 여, 예를 들어 RNA 또는 단백질 표정 분석13각 개별 셀 형식으로 특정 질문에 실험 후 격리 될 수 있도록 다른 형광으로 표시 될 수 있습니다. 여기, 기본 BrC 셀/오후 공동 문화에 중간에 IL 1β 분 비 표시 됩니다, 종양 세포, monocytes는 악성 진행 사이 간접 통신에이 cytokine의 가능한 중추적인 역할을 지원.
실험실에서 다른 필수적인 실험 프로토콜 비 변형 MCF 10A 셀의 3 차원 문화에서 acini 형성의 분석 이다. 이 분석 결과 바이러스 및 세포질 oncogene 활동에 대 한 테스트 하 고 종양 microenvironment 공격적인 암에 관련 된 기능에 영향을 어떻게 테스트 사용 되었다. 예를 들어,는 acini의 정상적인 발전 동안 luminal 중앙 셀 손실 접촉 기저 막 단백질 (ECME에서 제공)와 anoikis로 알려진 세포 죽음의 메커니즘을 트리거링. 기본 BrC 셀 또는 재조합 IL 1β는 모두 supernatants MCF 10A 셀 저항 anoikis 홍보 관찰 되었다. IL 1β의 높은 농도 BrC 셀 monocyte 상호 작용에 따라 승진은, 때문에이 관측 종양 기질 매우 공격적 단계 종양 진행의 필수적인 구성 요소는 지원 합니다.
여기에 설명 된 마이그레이션 및 침략 프로토콜 구성 마이그레이션하거나 종양 기질에서 파생 된 자극에 대 한 응답에서 침략 세포의 기능을 지원할 수 있습니다 우리 유용한 3D 무료 분석 실험. 그것은 발산 (GM-CSF 및 MCP-1) 기본 BrC 셀의 3 차원 문화에 높은 농도에서 발견, U937의 마이그레이션 홍보할 수 표시 했다 THP-1, 그리고 PMs, 프로-염증 성 microenvironment를 홍보 하는 공격적인 종양 세포의 기능을 지 원하는. 또한, IL-8 BrC 셀/monocytes의 공동 문화에서 supernatants에 증가 농도에서 또한 있는 상업 적극적인 BrC 셀 (HS578T MDA-MB-231)와 기본 BrC 세포의 증가 침략 승진.
셀의 상태에 대하여 그들의 확산 피크의 활용 및 잠재적인 후 격리 유전과 후 성적인 변화에 체 외에서 발생 하지 않도록 10 구절을 도달 하기 전에 기본 BrC 셀을 사용 하는 것이 중요 하다 문화입니다. 또 다른 필수 측면 1 차 셀을 작업할 때 격리 후 자신의 정체성을 확인 하는 것입니다. 우리는 확인할 수 그들의 상피 혈통, PanCK, Muc-1, EpCAM (2.5 단계에서 지정 된)를 포함 하 biomarkers의 패널을 사용 합니다. 마찬가지로,이는 각 일괄 처리는 차별화의 동일한 단계에서 다는 것을 보장 테스트는 신선한 PMs를 사용 하 여 좋습니다. 각 새 일괄 처리를 사용 하는 표현 형 CD34neg CD11bpos CD14pos CD64pos CD68neg CD16neg, 대응 미 숙 monocytes 비 활성화 하는 제시. 중요 한 것은, 우리가 monocyte 활성화에 결과 혼합으로 다른 기증자 로부터 monocytes을 혼합 하지 마십시오. 대신, 우리가 독립적으로 테스트 BrC 공동 사용 하 여 두 개 이상의 다른 기증자 로부터 monocytes 문화.
3D 문화 시스템은 여전히 제한 종양 생물학의 몇 가지 요소만 안정적으로 모델링 될 수 있다. 새로운 대안은 이다 organoids, 확장 및 줄기 세포의 분화에 근거 하는의 더 복잡 한 3D 모델 생체 외에서. Organoids는 또한 고도로 조직된 상피 구조를 개발합니다. 예로 위 25,26, 간 27및 신장 organoids28있습니다. 그러나, organoid 모델 모든 인간 장기에 대 한 남아 달성 될; 또한, 그들은 훨씬 더 복잡 하 고 비싼 실험 조건 필요합니다.
끝으로, 여기 우리가 자세하게에서 설명 분석 실험의 워크플로: BrC 환자, ECME 기반 3D 문화 모델, 그들의 선 동적인 용량을 테스트 테스트 그 염증 성 microenvironment을 그들을 제공 하는 방법에서 종양 세포의 격리에서 시작 추가 염증 세포, monocytes, 마지막으로, 세포의 종류와 어떻게 그 통신을 더 육성 공격적인 암 단계에 진행을 촉진 하는 염증 성 microenvironment 간의 통신을 분석을 등. 또한, 우리는 형태학과 기본 BrC 세포의 표현 형을 설명합니다. 미래에 연구, 그것은 다른 염증 세포를 테스트 하거나 심지어 BrC 세포 및 종양 기질에서 자주 발견 하는 여러 셀 간의 통신을 테스트 재미 있을 것입니다. 이러한 다중 셀 3D 문화 중에 일어나 생물학적으로 생체 내에서 암 진행의 큰 그림을 제공 합니다. 생체 외에서 데이터와 환자 임상 결과 비교 암 적극성에 높은 영향을 미칠 잠재적인 메커니즘을 식별 합니다.

종양 생물학은 이전에 생각 보다 훨씬 더 복잡 한. 종양 세포는 억제 되지 않는 확산 셀;의 단순한 대량 보다 더 많은 보여주는 증거를 장착 오히려, 다른 종양 약 세포 높은 조직과 종양1내에서 계층 구조를 표시 하는 다른 기능을 수행 같다. 종양 세포는 또한 비 변형 세포와의 친밀 한 커뮤니케이션에서: 대 식 세포, 섬유 아 세포, 림프 톨, adipocytes, 내 피 세포, 다른 셀 들 모두에 몰입 하는 비 계 단백질 및 다 당 류는 ECM을 구성 하는. 수많은 직접 및 간접적인 상호 작용 변환 및 비 변형 세포 사이 및 질병 결과2,3에 강력한 영향을 미치는 ECM으로 설정 됩니다. BrC의 특정 한 경우에 그것은 특히 Tam, 고려는 Tam 발견 되었습니다는 종양의 진화에 중요 한 역할을 증가 하는 전이의 위험과 질병 재발4의 BrC 셀의 통신을 해 부하는 것이 중요 ,5.
내부 종양 상호 작용 및 그들의 가능한 결과 분석, 새로운 3D 생체 외에서 방법을 개발 되었으며, 훨씬 더 복잡 한 microenvironment를 제공 하는 ECM 추출 물의 사용에 따라 종양 생물학, 비교에서의 현실에 가까운 기존의 단층 세포 배양 세포 성장 플라스틱에 첨부. 피터슨와 Bissell6 아의 첫 번째 모델을 제공 하 고 악성 유 방 상피 세포 laminin 풍부한 지하실 멤브레인에 교양 아 인간을 차별 하는 3D organotypic 구조를 설명 하는 첫번째 이었다 그들의 악성에서 유 방 상피 세포입니다. 10 년 뒤, 모델 Debnath, Muthuswamy에 의해 개발 및 브루 게7,,89 선의 acini의 악성 변환 하는 동안 손상 하는 생물 학적 경로 명료 하 게 하는 귀중 한 도구 제공 등 통제 확산, 장애인된 셀 분극의 증거 및 anoikis, 셀 저항 결과로 acini 루멘으로 꽉 접합 단백질의 delocalization 인해 큰 acini 형성으로 프로그램 된 세포 죽음의 종류를 발생 앵커리지-종속 셀 때 그들은 주변 ECM에서 분리. Sameni, Jedeszko, 및 슬론의 모델은 밀접 하 게 침입, 종양 암10,,1112의 또 다른 중요 한 특성에 관련 된 세포에 의해 이미징 분해 활동에 집중 했다. 섞인 다른 형광 침묵 단백질 기질 단백질 행렬에 의존 하는이 모델 (DQ 젤라틴, DQ-콜라겐, 그리고 DQ 콜라겐 IV), 어떤 형광 신호에는 콜라겐의 분해 저하의 지표. 3D 모델 변형 비 둘 다의 줄기 세포 속성과 셀의 집계, spheroids 라고 하는 종양 세포를 공부 하는 데도 사용, ECM 같은 단백질 세포 분화, 비대칭의 메커니즘에 대 한 질문 또는 정지에 경작 될 수 있습니다. 세포 분열, 세포 준수, 및 세포 운동 성13,14. 침공 분석 실험 종양의 본질적인 공격 성과 침략 과정15중 chemoattractants로 봉사 하는 분자의 식별의 테스트 수 있습니다. 전반적으로, 3D 모델의 체 외에서 세포 배양 정상 및 종양 조직 morphogenesis 더 밀접 하 게 반영 하는 저렴 한 다양화를 나타냅니다.
우리 인간의 상업 BrC 셀 라인 알려진된 공격적 잠재력 (luminal 및 트리플-네거티브 형식) 및 기본을 사용 하 여 상기 모델7,,1011에 따라 3D 셀 공동 문화 시스템 설계 셀 explanted BrC 환자에서. 우리가 먼저 적극적인 비 (MCF-7) 또는 공격적 (MDA-MB-231) BrC 셀 U937 monocytes 기질 추출 (ECME)와 공동 경작 했다 모델 개발-직접 셀 상호 작용을 허용 하는 3D 시스템을 기반으로. 이러한 공동 문화 어떻게이 두 세포 계보 간 통신 암 공격적인 행동에 관련 된 유전자의 세트의 녹음 방송에 영향을 결정 하기 위해 사용 되었다. 2 cyclooxygenase (COX-2) 대 본의 상당한 증가 하는 제품 중 하나는, 스타 글란 딘 E2 (PGE2), 암 진행에서 염증의 역할을 강조 하는 발견의 생산 증가와 동시에 관찰 되었다. MMP의 증가 전사 또한 적극적인 MDA-MB-231 셀 U937 monocytes DQ 콜라겐 IV 포함 된 문화에 함께 공동 경작 했다 때 큰 콜라겐 베이스와 상관 하는 관찰 되었다. 메모의, 우리의 공동 문화는 세포 세포 상호 작용 메커니즘 콜라겐 저하에 필요한 가정을 지원 하지 않았다. 그것은 오히려 두 세포 계보 간 통신 분 비 분자에 의해 중재 했다 제안 했다. 또한, 이러한 공동 문화 분석 실험에서 수확 supernatants 선의 acini MCF 10A 세포 변형 비13에 의해 형성 된 무질서 수용 성 요소 포함. 그것은 발견 하는 적극적인 고 기본 BrC 세포 분 비 상승 monocyte 혈 분자 MCP-1 GM-CSF와 RANTES의 수준. 따라서, 우리는 세포 세포 세포 상호 작용을 방지 하기 위해 셀 문화 삽입에서 분리 되었다 3D 문화 설명. 이러한 문화는 BrC 세포, monocytes 사이 간접 통신을 해결 하기 위해 사용 되었다. 이 분석 실험, 비 공격적이 고 적극적인 상업 BrC 셀 라인 및 기본 BrC 셀, 인간 monocytes의 세 가지 유형: 상업 U937 및 THP-1 셀, 그리고 기본 monocytes (PMs) (모두 건강 한 기증자의 주변 혈액에서 분리 monocytes는 활성화 되지 않은 상태에서 사용 했다) 사용 되었다. 염증 성 cytokines 일리노이-1β 및 IL-8의 증가 농도 공동 문화에 농축 될 관찰 되었다. 마찬가지로, MMP-1, MMP-2, 및 MMP 10 BrC 셀 monocyte 공동 문화, 그리고 이렇게 강화 이전 결과14에 증가 또한 했다 발견 했다. 이 원고에서 기본 BrC 세포 격리 및 3D 문화에서 테스트 포인트 워크플로 대표적인 결과 함께 제공 됩니다. 이 작품 구성 종양 생물학의 특정 측면이 3D 셀 시스템 생체 외에서 제공 하는 중대 한 잠재력의 좋은 예.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1108px;" width="1108">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">U937</td>
			<td style="width:260px;">American Type Culture Collection ATCC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">CRL-1593.2</td>
			<td style="width:463px;">Monocytic cell line/histiocytic lymphoma&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">THP-1</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">TIB-202</td>
			<td>Monocytic cell line/acute monocytic leukemia&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MCF-10A</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC&#160;</td>
			<td>CRL-10317</td>
			<td>Non-transformed breast cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MCF-7</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">HTB-22</td>
			<td>Breast Cancer Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">T47D</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">HTB-133</td>
			<td>Breast Cancer Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">HS578T</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">HTB-126</td>
			<td>Breast Cancer Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MDA-MB-231</td>
			<td>American Type Culture Collection ATCC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">HTB-26</td>
			<td>Breast Cancer Cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td style="width:260px;">GIBCO BRL Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">DMEM High Glucose&#160;</td>
			<td style="width:260px;">GIBCO BRL Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">11964-092</td>
			<td>4.5 g/L glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:260px;">GIBCO BRL Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">11039-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Antibiotic/Antimycotic</td>
			<td style="width:260px;">GIBCO BRL Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">15240-062</td>
			<td>100 U/mL penicillin, 100 &#181;g/mL streptomycin, and 0.25 &#181;g/mL Fungizone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:260px;">GIBCO BRL Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Horse serum&#160;</td>
			<td style="width:260px;">GIBCO BRL Life Technologies</td>
			<td>16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">0.05% Trypsin-EDTA 1X</td>
			<td style="width:260px;">GIBCO BRL Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS 1X (Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:260px;">GIBCO BRL Life Technologies</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15 (1.00mg)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I1882-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H088-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cholera toxin Vibrio cholerae</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>C8052-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Matrigel&#160;</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td>356237</td>
			<td style="width:463px;">Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20&#176;C until use at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">GM-CSF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">MCP-1</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">RANTES</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>300-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">IL-8</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">IL-1&#946;</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Crystal-violet</td>
			<td>Hycel M&#233;xico</td>
			<td>541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Transwell permeable supports (inserts)</td>
			<td>Corning Inc</td>
			<td style="width:143px;">3422</td>
			<td>6.5 mm diameter, 8 &#181;m pore size/24-well plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Transwell permeable supports (inserts)</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:143px;">140620</td>
			<td>6.5 mm diameter, 0.4 &#181;m pore size/24-well plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Monocyte Isolation Kit II Human&#160;</td>
			<td style="width:260px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:143px;">130-091-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">LS Columns</td>
			<td style="width:260px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:143px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay</td>
			<td style="width:260px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:143px;">HCYTOMAG-60K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation)</td>
			<td style="width:260px;">Luminex Corporation</td>
			<td style="width:143px;">40-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Lab-Tek chamber slide with cover (8 well)</td>
			<td style="width:260px;">Nalge Nunc International</td>
			<td style="width:143px;">177402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Glass bottom microwell 35mm petri&#160; dishes</td>
			<td style="width:260px;">MatTek Corp.</td>
			<td style="width:143px;">P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the communication between monocytes and primary breast cancer cells in an extracellular matrix extract (ecme)-based three-dimensional system

세포 외 기질 (ECM)에 포함 된 정상 및 종양 약 상피 세포 속속들이 조 혈 및 비 조 혈 세포, 따라서 크게 영향을 미치는 정상 조직의 항상성 및 질병 결과와 통신 합니다. 유방암, 종양 관련 된 대 식 세포 (Tam) 역할을 중요 한 질병의 진행과 전이, 재발; 따라서 질병을 제어 하는 것이 중요이 monocyte chemoattraction 종양 microenvironment 및 종양 세포와 그들의 상호 작용의 메커니즘을 이해. 여기, 우리는 인간 유방암 (BrC) 세포 및 인간 monocytes의 3 차원 (3D) 공동 문화 시스템에 대 한 자세한 설명을 제공합니다. BrC 셀 생산 활성화에 규제의 높은 기초 수준, 정상적인 T 세포 표현 (RANTES) 분 비, monocyte chemoattractant 단백질-1 (MCP-1), 그리고 granulocyte macrophage 식민지 자극 인자 (G-CSF), monocytes, 공동 문화에 프로 염증 성 cytokines 인터 루 킨 (IL)-1 베타 (IL 1β) 및 IL-8 매트릭스 metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2, 및 MMP-10 풍성 하 게 했다. 이 종양 기질 microenvironment 승진 anoikis MCF 10A 3D acini 같은 구조, monocytes의 chemoattraction 그리고 적극적인 BrC 셀의 침공에 저항. 여기에 제시 된 프로토콜 내 종양 커뮤니케이션을 공부 하는 저렴 한 대안을 제공 하 고 3D 셀 시스템 생체 외에서 심문 종양 관련 종양 생물학의 특정 기능을 제공 하는 중대 한 잠재력의 예 침략입니다.

BrC 셀 3D 문화에서의 형태소 분석:
낮은 높은 밀도에서 3D 문화에서 성장 하는 기본 BrC 셀의 형태는 5 일 동안 연구 했다. 첫 번째 48 h 동안 세포는 ECME를 준수 하 고 낮은 밀도 유지. 이 시간이 시점에서 그것은 명확 하 게 감상할 수 있습니다 세포는 길쭉한 스핀 들-모양, 명백한 셀 연락처를 표시 하지 않고 두 개 이상의 긴 세포질 예측와 일부 제시. 5 일 후 문화, 세포는 그들의 초기 형태를 유지 하면서 확산. 또한, 그들은 특정 구조 조직 없이 그물을 닮은 구조를 형성 하 고 아무 접촉 금지와 위로 쌓여 나타납니다. MCF 10A 세포 변형 비 비교는 구형 구조 선의 acini 닮은 형성 되었다. 이러한 세포 동종 크기 (약 50 µ m)의 둥근 잘 구분 및 조직 구조의 특성 형태를 표시합니다. 반대로, 기본 BrC 셀 공유할 훨씬 가까이 닮 았 공격적 BrC 셀 MDA-MB-231 (그림 1).
셀에 직접 상호 작용 및 콜라겐 저하의 분석:
우리는 다음을 평가 하기 위해 3 차원 공동 문화 모델을 설계: 세포 형태학, 콜라겐 파괴, 셀 마이그레이션, BrC 셀과 공동 문화에 monocytes 간의 직접적인 상호 작용 여부와. 그러나 5 일 후 두 MCF-7과 MDA-MB-231 상업 BrC 셀 3D 문화에서 무질서 집계를 형성,, 그들은 그들의 형태에 다. 적극적인 셀 MDA-MB-231 양식 길쭉한 형태와 비 공격적 MCF-7 셀 형성 세포는 둥근된 형태를 유지 하 고 그들은 더 조밀 하 게 압축된 (그림 2 표시 집계 하는 동안, 나머지에서 분리 하는 경향이 일부 셀 집계 A, B). DQ 콜라겐 IV 분해 저하 (녹색), 형광 활동 전시 두 BrC 문화와 시각화를 통합 했다. 양적 분해 활동 평가, 녹색 형광 6 50 µ m2 필드의 IOD로 측정 되었다. 비교 개별 3D MDA-MB-231 셀의 문화와 사이의 U937 monocytes 공동 문화 되었다. (그림 2C) 공동 문화에 베이스의 통계적으로 유의 한 증가 관찰 했다. 또한, 직렬 통과의 confocal 현미경 분석 스택 MDA-MB-231의 모든 10 µ m 및 공동 문화는 U937 monocytes 수행 (그림 2D). 이 분석 U937 monocytes 몇 monocytes BrC 셀 계층에 도달로 공격적 셀 MDA-MB-231 쪽으로 마이그레이션 밝혔다. 그러나, 그것은 분명 셀 직접 상호 사이트 높은 분해 활동의 분야와 반드시 동시 하지 했다: 대신, 콜라겐 파괴의 지역 균일 하 게 확산 됐다 추론으로 이어지는 문화에는 콜라겐 저하는 간접 통신 분 비 요인에 의해 중재의 결과 이었다. 따라서, 3D 공동 문화 모델 세포 분 비 요소에 따라 셀 셀 통신을 허용 하는 다공성 막으로 구분 하는 다른 구획에 놓고 셀 라벨 및 문화 후 정렬 하지 않도록 변경 되었습니다.
3D 문화에서 Supernatants에 IL 1β의 분석:
간접적인 상호 작용 3D 문화, 개별 기본 BrC에서 supernatants 작업 문화와 그들의 5 일 오후 공동 문화 수확 했다. 이러한 supernatants 18 cytokines 및 상업 키트 및이 분석을 위해 설계 된 악기를 사용 하 여 5 MMPs의 동시 분석을 복종 되었다. 모든 analytes 테스트, IL 1β, IL-8의 크게 증가 수준 기본 BrC 셀 monocyte 공동 문화, 이전 악성 진행15, 와 연결 된 두 중요 한 염증 성 cytokines에서에서 관찰 되었다 18 , 19 , 20 (그림 3, 일리노이-1β에 대 한 결과). 이 예에서는 3D 문화 모방 모양 종양 microenvironment 통신 네트워크를 허용 하는 분석의 또 다른 유형입니다.
Supernatants Acini 구조의 특성:
MCF 10A 발암 여부의 평가와 관련 된 메커니즘의 모델로 설립 했다 Debnath, Muthuswamy, 그리고 브루 게7을 개발한 3D 실험 시스템 기초 기본 BrC 셀에서 secreted 요소 supernatants는 MCF 10A 3D acini 같은 구조, 유사 바이러스 및 세포질 oncogenes7,21 의 변환 수행한 후 관찰 하는 활동의 형성을 영향을 받습니다. MCF 10A 셀 (anoikis 저항의 조치로) 루멘 형성을 관찰 하 두 기본 BrC 셀 라인에서 두 개의 다른 supernatants 함께 재배 했다. 14 일에는 spheroids 0, 25, 50, 75, 및 100% 깊이에 confocal 현미경 검사 법 횡단 인하 하 여 평가 했다 그리고 두 경우 모두, 그것은 (acini (그림 4에서에서 중앙 (luminal) 셀의 수를 계산 하 여 측정 한 그 MCF 10A 셀 피할된 anoikis 발견 B, C)). 따라서, MCF 10A 셀 acini BrC 셀에서 바른된 미디어와 함께 형성 되는 그것의 표준 문화 매체 (에서 설명한 단계 1.2)(그림 4)와 함께 성장 하는 MCF 10A 달리 올바른된 빈 루멘을 부족 합니다. 3D 공동 문화 시스템에서 IL 1β는 높게 분 비; 따라서, MCF 10A 세포 인간 재조합 형 일 1β18로 재배 했다. 그림 4 D 는 confocal 현미경 검사 법 횡단 acini IL 1β (낮은 패널), 존재의 50% 깊이에서 잘라 보여줍니다 그리고이 cytokine anoikis 저항을 또한 수 여 보여. 따라서, IL 1β, 같은 기본 BrC 세포에 의해 분 비 성 요인 침략 암의 특성 비 변형 MCF 10A 잃을 ECM 상호 작용, 세포의 생존을 촉진 합니다.
3D 공동 문화 홍보 Monocytes의 마이그레이션 및 암 세포의 침입과 관련 된 염증 반응:
우리는 이전 기본 BrC 셀 3D 문화에 monocytes14유치 알려진 프로-염증 성 발산의 상부 기저 분 시연 했다. 따라서, 우리는 응답 발견 발산으로 BrC 셀의 조건된 미디어에 농축 monocytes의 철새 용량 분석. 상업적인 monocytes U937 및 THP-1 신선한 PMs의 철새 용량 3 다른 발산에 평가 되었다: GM-CSF, MCP-1, 그리고 RANTES. U937 및 THP 1 monocytes 두 monocytes RANTES null 응답 했다 GM-CSF와 MCP-1, 대부분의 반응으로 U937 마이그레이션 할 수 있었다. 중요 한 것은, PMs는 높은 기저 철새 활동과 MCP-1 (그림 5)에 대 한 가장 강력한 응답을 보였다. IL-8 기본 BrC 셀 및 monocytes의 3D 공동 문화 후 농축도 했다. 따라서, 우리는 상업 및 기본 BrC 셀 라인의 용량을 수정 하는 IL-8 여부 분석. 상업 적극적인 BrC 셀 라인 (HS578T 및 MDA-MB-231)는 비 공격적 (MCF-7와 T47D) 침공 하지 않았다 하는 동안 IL-8에 대 한 응답에 침공. 놀랍게도, 기본 BrC 세포 응답 IL-8 (그림 6A, 오른쪽 패널)으로 상업 적극적인 BrC 셀 라인 보다 더 많은 침략 했다. 경우에 따라 셀 클러스터로 침략 하 고 따라서 IOD 분석 필요 하다 (그림 6B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56589/56589fig1.jpg"> 그림 1 : 3D 문화에서 BrC 셀의 대표 이미지. 왼쪽에서 오른쪽: 제어와 특성 선의 acini 형성 비 변형 MCF 10A 세포의 형태학, 잘 구분 된 셀 연락처, 둥글게 하 고 동종 크기 (약 50 µ m, 광학 배율에의 구조 조직 200 X). 가운데 패널 기본 BrC 셀 낮은 밀도 (2 일) 및 높은 밀도 (5 일)에서 양식 표시. 세포는 ECME를 준수 하 고 초기 시간 지점에서 낮은 밀도 유지. 그것은 분명 세포는 길쭉한 스핀 들-모양, 일부 두 개 이상의 긴 세포질 예측, 그리고 아무 명백한 세포 세포 접착을 제시. 다른 한편으로, 나중에 지점에서 고밀도 세포 특정 구조 조직 없이 그물을 닮은 구조를 형성. 이러한 세포 등장 쌓여 아무 접촉 저해를 보여주는 최대. 5 일 후에 3D 문화 상업 MDA-MB-231 셀의 컨트롤 표시 됩니다; 이러한 적극적인 BrC 셀 기본 BrC 문화 (100 X의 광학 확대)는 훨씬 더 가까이 닮 았을 공유할 수 있습니다. 대표 50 µ m. 800 셀 바 규모 실험 시작 시드 했다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56589/56589fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56589/56589fig2.jpg"> 그림 2 : ECM 저하의 분석. 노란색 형광 색소 (A)와 적극적인 MDA-MB-231 셀 스테인드 비 공격적 MCF-7 세포는 빨간색 형광 색소 (B) 3 차원 조건;에서 5 일 동안 재배로 얼룩진 0.5%의 녹색 형광 표시 된 콜라겐 IV ECM 저하 시각화를 통합 했다. A 와 B, 위 왼쪽된 사진 콜라겐 저하의 수준을 나타내는, 상단 오른쪽 패널 광 사진 대표, 왼쪽 아래 BrC 셀 나타내고 하단 오른쪽 패널 보기 형광 및 광학의 병합 이미지입니다. A 와 B에 대 한 200 X의 광학 배율, 100 µ m의 눈금 막대 표시 됩니다. (C) 대표 이미지 (녹색) 컨트롤로, 개별 MDA-MB-231 셀의 3 차원 문화에 ECM 베이스의 U937 monocytes MDA-MB-231의 3D 공동 문화의 ECM 베이스와 비교. 스케일 바 10 µ m을 나타냅니다. 각 조건에서 6 50 µ m2 필드의 IOD (통합된 광학 밀도) 측정 했다. 평균 표준 오차는 quantifications에서 평균 (SEM)의 표시 됩니다. 두 개의 별표 p < 0.01 (맨-휘트니 테스트)와 통계적으로 유의 한 차이 나타냅니다. (D) MDA-MB-231 세포의 직접적인 상호 작용 (회색 그늘 대량) 붙일 스테인드 U937 monocytes (오렌지);와 녹색 형광 베이스에 해당합니다. 직렬 조각 생성 된 지역화 및 두 셀 라인 간의 직접적인 상호 작용에 confocal 현미경 검사 법에 의해 모든 10 µ m. 200 X;의 광학 확대 스케일 바 대표 100 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56589/56589fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56589/56589fig3.jpg"> 그림 3: IL 1β 농도 3D 공동 문화에서 증가 된다. IL 1β 수준 (pg/mL) supernatants 8 (p c 1-8) 기본 BrC 셀에서 개별적으로 3d (3 차원), 교양 및 오후 (CC)와 그들의 3 차원 공동 문화에 대 한 비교에 한 대표적인 결과. 개별 3D 문화에 오후의 제어 비교 (오후)에 대 한 포함 되었다. 결과 여러 가지 cytokines 했다 동시에 탐지는 각 샘플에서 상업 키트로 수 있는 immunodetection 기반 기술에 의하여 더 큰 멀티플렉싱 분석에서 추출 되었다. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56589/56589fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56589/56589fig4.jpg"> 그림 4 : 기본 BrC 세포에서 분 비 요인 유도 anoikis MCF 10A 셀 비 변화에 저항. MCF 10A 셀 3D 표준 문화 미디어 (열 A와 D의 상위 패널), 있는 그것은 관찰 될 수 있다는 acini 전형적인 빈 루멘 (25-75% 깊이 빨간색 사각형으로 강조); 현재 조건에서 성장 했다 MCF 10A 셀은 두 개의 기본 BrC 문화 (열 B와 C)에서 두 개의 다른 supernatants로 성장, 루멘 않습니다 빈 하지만 채워진 셀 anoikis에 저항을 나타내는. MCF 10A 셀 3D 조건 추가 인간 재조합 형 일 1β에서에서 경작 했다 때에 유사 하 게, (20 ng/mL), 아니 빈 루멘 acini (D의 낮은 패널)의 50% 깊이 confocal 현미경 검사 법 부분에서 평가 될 수 있다. 바로 타원형 풍자 만화는 acini의 0, 25, 50, 75 및 100% 깊이에서 만들어진 confocal 현미경 검사 법 섹션을 나타냅니다. 이미지는 녹색에서 DAPI (파란색)와 E-cadherin 스테인드 핵을 표시 합니다. 200 X의 광학 확대, 스케일 바 대표 10 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56589/56589fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56589/56589fig5.jpg"> 그림 5 : Monocytes의 철새 용량. U937, THP-1 GM-CSF, MCP-1에 대 한 응답에서 오후의 철새 용량의 대표 이미지와 RANTES. Chemokine 없이 컨트롤 포함 (첫 번째 열 왼쪽에서 오른쪽) 있습니다. 이미지 아래 숫자 표시 각 조건; 철새 셀 수 오후는 철새 고용량 se 당, 그리고 MCP-1 가장 반응 셀을 했다 하는 동안 U937 및 THP 1 monocytes GM-CSF 및 MCP-1, 주로 응답 했다. 100 X;의 광학 확대 스케일 바 나타냅니다 100 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56589/56589fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56589/56589fig6.jpg"> 그림 6 : 공격적이 고 기본 BrC 셀 IL-8 응답에서 침공. A. 침공 2 비 공격적 (MCF-7 T47D), 두 개의 매우 공격적 (HS578T 및 MDA-MB-231) 분석 실험 BrC 셀 라인 그리고 IL-8 chemoattractant로 사용에 대 한 응답에 하나의 기본 BrC 문화. 상위 패널 chemokine 낮은 패널 매우 공격적 BrC 셀 및 셀 문화 삽입의 세포 막을 통해 침입 기본 BrC 셀 IL-8, 반응을 보여 아무 침공을 보여주는 하지 않고 컨트롤에 해당 합니다. B. 클러스터;에 침략 하는 셀의 예 이러한 경우에 침략의 측정 영역 당 IOD (통합된 광학 밀도) 측면에서 침공을 결정 하는 이미지 분석 프로그램을 이루어집니다. 이미지 아래 숫자를 각 조건에 침입 셀의 수를 나타냅니다. 100 X;의 광학 확대 스케일 바 대표 100 µ m. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56589/56589fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

여기, 우리는 기본 유 방 암 세포 뿐만 monocytes 그리고 콜라겐 저하, 면역 세포 모집, 셀 결과 함께 그들의 직접/간접적인 상호 작용 연구로 형태를 분석 하는 3 차원 문화 방법 설명 침공, 그리고 암 관련 된 염증의 승진.

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

analyzing-communication-between-monocytes-primary-breast-cancer-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

10.9K 조회수.  Hospital Infantil de México Federico Gómez. 여기, 우리는 기본 유 방 암 세포 뿐만 monocytes 그리고 콜라겐 저하, 면역 세포 모집, 셀 결과 함께 그들의 직접/간접적인 상호 작용 연구로 형태를 분석 하는 3 차원 문화 방법 설명 침공, 그리고 암 관련 된 염증의 승진.

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Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

연구

암 연구학

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under the influence of specific environmental signals, these adult stem cells can release paracrine mediators leading to accelerated tumor growth and metastasis. Defining the crosstalk between tumor and MSCs is of primary importance to understand the mechanisms underlying cancer progression and identify novel targets for therapeutic intervention. 
Cancer cells produce high amounts of extracellular vesicles (EVs), which can profoundly affect the behavior of target cells in the tumor microenvironment or at distant sites. Tumor EVs enclose functional biomolecules, including inflammatory RNAs and (onco)proteins, that can educate stromal cells to enhance the metastatic behavior of cancer cells or to participate in the pre-metastatic niche formation. In this article, we describe the development of a preclinical cancer mouse model that enables specific evaluation of the EV-mediated crosstalk between tumor and mesenchymal stem cells. First, we describe the purification and characterization of tumor-secreted EVs and the assessment of the EV internalization by MSCs. We then make use of a multiplex bead-based immunoassay to evaluate the alteration of the MSC cytokine expression profile induced by cancer EVs. Finally, we illustrate the generation of a bioluminescent orthotopic xenograft mouse model of osteosarcoma that recapitulates the tumor-MSC interaction, and show the contribution of EV-educated MSCs to tumor growth and metastasis formation. 
Our model provides the opportunity to define how cancer EVs shape a tumor-supporting environment, and to evaluate whether blockade of the EV-mediated communication between tumor and MSCs prevents cancer progression.

Direct injection of cancer-derived extracellular vesicles (EVs) leads to reprogramming of bone marrow supporting tumor progression; however, which cells mediate this effect is unclear. Herein, we describe a step-by-step protocol to investigate EV-mediated tumor-mesenchymal stem cell (MSC) interactions in vivo, revealing a crucial role for EV-educated MSCs in metastasis.

종양 및 중간 엽 줄기 세포 사이의 세포 외 기 중재 통신을 정의 하는 다리의 전 임상 마우스 모델

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce decellularized tongue extracellular matrix (TEM) which provides functional scaffolds for TSCC construction. TEM provides an in vitro niche for cell growth, differentiation, and cell migration. The microstructures of native extracellular matrix (ECM) and biochemical compositions retained in the decellularized matrix provide tissue-specific niches for anchoring cells. The fabrication of TEM can be realized by deoxyribonuclease (DNase) digestion accompanied with a serious of organic or inorganic pretreatment. This protocol is easy to operate and ensures high efficiency for the decellularization. The TEM showed favorable cytocompatibility for TSCC cells under static or stirred culture conditions, which enables the construction of the TSCC model. A self-made bioreactor was also used for the persistent stirred condition for cell culture. Reconstructed TSCC using TEM showed the characteristics and properties resembling clinical TSCC histopathology, suggesting the potential in TSCC research.

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

A method is shown here for the preparation of the tongue extracellular matrix (TEM) with efficient decellularization. The TEM can be used as functional scaffolds for the reconstruction of a tongue squamous cell carcinoma (TSCC) model under static or stirred culture conditions.

혀 기질과 혀 편평 세포 암 종에서 생체 외에서 의 재구성의 제조

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a promising source for adoptive T cell therapy (ACT). However, classical in vitro methods for producing regenerated T cells from iPSC result in either innate-like or terminally differentiated T cells, which are phenotypically and functionally distinct from na&#239;ve T cells. Recently, a novel three-dimensional (3D) thymic culture system was developed to generate a homogenous subset of CD8&#945;&#946;+ antigen-specific T cells with a na&#239;ve T cell-like functional phenotype, including the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression in vivo. This protocol avoids aberrant developmental fates, allowing for the generation of clinically relevant iPSC-derived T cells, designated as iPSC-derived thymic emigrants (iTE), while also providing a potent tool to elucidate the subsequent functions necessary for T cell maturation after thymic selection.

This article describes a novel method to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived thymic emigrants (iTE) by a three-dimensional (3D) thymic culture system. iTE are a homogenous subset of T cells closely related to na&#239;ve T cells with the capacity for proliferation, memory formation, and tumor suppression.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

다리에 대 한 3 차원 뼈 세포 외 매트릭스 모델

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue and its role in local recurrence at the primary tumor site are unknown. Here we present a method for the decellularization, lyophilization, and fabrication of ECM hydrogels derived from murine mammary fat pads. Results are presented on the effectiveness of the decellularization process, and rheological parameters were assessed. GFP- and luciferase-labeled breast cancer cells encapsulated in the hydrogels demonstrated an increase in proliferation in irradiated hydrogels. Finally, phalloidin conjugate staining was employed to visualize cytoskeleton organization of encapsulated tumor cells. Our goal is to present a method for fabricating hydrogels for in vitro study that mimic the in vivo breast tissue environment and its response to radiation in order to study tumor cell behavior.

This protocol presents a method for decellularization and subsequent hydrogel formation of murine mammary fat pads following ex vivo irradiation.

세포외 매트릭스 하이드로겔을 사용하여 정상 조직 방사선 효과 연구

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample types have been analyzed using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) to visualize the distribution of proteins, lipids, and metabolites across the biological sample of interest. We have developed a novel sample preparation method that combines the strengths of the three previous applications to address an underexplored approach for identifying chemical communication in cancer, by seeding mammalian cell cultures into agarose in coculture with healthy tissues followed by desiccation of the sample. Mammalian tissue and cells are cocultured in close proximity allowing chemical communication via diffusion between the tissue and cells. At specific time points, the agarose-based sample is dried in the same manner as microbial colonies prepared for IMS analysis. Our method was developed to model the communication between high grade serous ovarian cancer derived from the fallopian tube as it interacts with the ovary during metastasis. Optimization of the sample preparation resulted in the identification of norepinephrine as a key chemical component in the ovarian microenvironment. This newly developed method can be applied to other biological systems that require an understanding of chemical communication between adjacent cells or tissues.

A novel method of sample preparation was developed to accommodate cell and tissue coculture to detect small molecule exchange using imaging mass spectrometry.

조직 및 질량 분석 이미징 사용 하 여 셀 사이의 작은 분자 통신 캡처

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

3 차원 세 포스 페 로이드 침입 분석에서 완전 한 인간 종양 기반 매트릭스

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction of differentiation of two mouse breast epithelial cell lines, HC11 and EpH4, and their use to study complementary stages of mammary gland development and neoplastic transformation.
The HC11 mouse breast epithelial cell line originated from the mammary gland of a pregnant Balb/c mouse. It differentiates when grown to confluence attached to a plastic Petri dish surface in medium containing fetal calf serum and Hydrocortisone, Insulin and Prolactin (HIP medium). Under these conditions, HC11 cells produce the milk proteins &#946;-casein and whey acidic protein (WAP), similar to lactating mammary epithelial cells, and form rudimentary mammary gland-like structures termed &#34;domes&#34;.
The EpH4 cell line was derived from spontaneously immortalized mouse mammary gland epithelial cells isolated from a pregnant Balb/c mouse. Unlike HC11, EpH4 cells can fully differentiate into spheroids (also called mammospheres) when cultured under three-dimensional (3D) growth conditions in HIP medium. Cells are trypsinized, suspended in a 20% matrix consisting of a mixture of extracellular matrix proteins produced by Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells, plated on top of a layer of concentrated matrix coating a plastic Petri dish or multiwell plate, and covered with a layer of 10% matrix-containing HIP medium. Under these conditions, EpH4 cells form hollow spheroids that exhibit apical-basal polarity, a hollow lumen, and produce &#946;-casein and WAP.
Using these techniques, our results demonstrated that the intensity of the cadherin/Rac signal is critical for the differentiation of HC11 cells. While Rac1 is necessary for differentiation and low levels of activated RacV12 increase differentiation, high RacV12 levels block differentiation while inducing neoplasia. In contrast, EpH4 cells represent an earlier stage in mammary epithelial differentiation, which is inhibited by even low levels of RacV12.

We describe techniques for differentiation induction of two breast epithelial lines, HC11 and EpH4. While both require fetal calf serum, insulin, and prolactin to produce milk proteins, EpH4 cells can fully differentiate into mammospheres in three-dimensional culture. These complementary models are useful for signal transduction studies of differentiation and neoplasia.

마우스 유방 상피 HC11 및 EpH4 세포의 분화

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...