Name: 3d mitochondrial ultrastructure of drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography
Uploaded: 2017-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
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연구는 세포 연구소와 Organismic 생물학에서 EM 코어와 학계 Sinica, 타이 페이, 대만의 곳을 알아내는-엠 코어에서 수행 했다. 작품은 학계 Sinica 및 대부분에 의해 지원 되었다.

1. 섹션 초파리 조직을 진동 블레이드 톰을 사용 하 여
<ol>
	<li>얼음에 초파리 를 anesthetize 하 고 인산 염 버퍼에 4% 낮은 녹는 agarose의 1 mL에 각 하나의 비행을 담가. 얼음에 공고히 agarose를 허용 합니다. 일반적으로, 4-6 파리 처리 되었습니다.</li>
	<li>진동 블레이드 톰을 사용 하 여 섹션 agarose 젤에 포함 된 초파리 조각 100 µ m 두께 2.5%도 0.1 M 인산 염 버퍼에 포함 된 통 솔루션에 몰두. 참고: 조직 아키텍처 다른 방법에 비해 더 그대로 남아 있기 때문에 선호는 Vibratome 단면입니다. 또는, 핀셋을 해 부 2.5%도 0.1 M 인산 염 버퍼에 포함 된 통 솔루션으로 IFM을 해 부를 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>
2. 준비는 고압 및 동결 대체 (HPF/FS) 방법으로 EM 표본
<ol>
	<li>인산 염 버퍼, 2 방울 (~ 100 µ L) 20 %BSA 인산 염 버퍼의 다음의 3 방울 (~ 150 µ L)에서 조직 단면도 씻어. 다음 HPF 버퍼 및 20 %BSA 가득에 대 한 금 사업자에 섹션을 배치 합니다.</li>
	<li>사용자 설명서에 따라 고압 냉동 고에 운반대를 포함 하는 샘플을 로드 합니다.</li>
	<li>동결, 후 액체 질소 아래 홀더 사업자 놓고-140 ° c 냉각 동결 대체 장치에 전송</li>
	<li>표 1, 2%도, 2% 오스뮴 tetroxide 그리고 아세톤에 0.1 %uranyl 아세테이트 칵테일 fs와 같이 동결 대체 프로토콜을 수행 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 바늘으로는 표본 캐리어에서 제거 하 고 실 온에서 수 지에 견본을 포함. 16 h 65 ° C에서 수 지 유해 참고: FS 프로토콜 샘플의 준비를 수정 해야 합니다. HPF/FS는 열 대권 외의를 유지 하 고 세포 내용의 손실을 최소화를 선호 된다.<ol>
		<li>양자 택일로, 화학 기정 프로토콜을 적용 됩니다. 표본 2.5%도 함께 하룻밤, 버퍼와 세척 고 1% 오스뮴 tetroxide 2 h. 세척에 대 한 해결 및 에탄올의 농도 오름차순으로 탈수와 다음 침투 고치고 16 65 ° C에서 polymerizing 전에 Spurr의 수 지에 견본을 포함 h입니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 전자 단층 촬영에 대 한 직렬-섹션은 견본의 준비
<ol>
	<li>조직에 있는 원하는 블록 얼굴 노출 견본 블록을 잘라.</li>
	<li>금 입자를 pretreat (10 nm 직경에서) 30 분 세척에 대 한 1 %BSA PBS 버퍼에 금 입자를 일시 중단 하 고. 표준 마커를 만드는 탄소 필름으로 코팅 된 구리 슬롯 격자에 금 입자를 오버레이 합니다.</li>
	<li>단층 촬영 수집의 보기의 필드에 충분 한 표준 마커 (마커 적어도 5-10)를 가장 아래에서 확인.</li>
	<li>두께 ultramicrotome를 사용 하 여 200-250 nm 직렬 섹션을 잘라.</li>
	<li>슬롯 격자 얇은 섹션에 대 한 완벽 한 루프를 사용 하 여에 직렬 섹션을 수집 합니다.</li>
	<li>10 분 동안 Reynold의 리드 시트르산과 섹션 얼룩.</li>
	<li>섹션 상단 표준 금 입자의 두 번째 레이어를 오버레이 합니다.</li>
</ol>
4. 수집 이중 기울기 전자 단층 촬영
<ol>
	<li>이중 축 단층 촬영 홀더에 그리드를 로드 하 고 200에서 전송 전자 현미경에 삽입 kV.</li>
	<li>Eucentric 초점에 현미경을 맞춥니다.</li>
	<li>자동 데이터 수집 소프트웨어를 설정 합니다. 조정 하 고 다중 스케일 영상 설정에서 전자 빔 정렬. 작업 세부10 (그림 2)에 대 한 사용자 설명서를 참조 하십시오.</li>
	<li>단층 촬영 컬렉션 설정에서 탄소 필름 없이 빈 영역에 카메라 어둡고 밝은 참조를 취득 합니다.</li>
	<li>낮은 확대율에서 격자 아틀라스를 수집 합니다. 단층 촬영 컬렉션의 대상으로 직렬 섹션에 미토 콘 드리 아를 선택 합니다.</li>
	<li>에 2 ° 증가와 60 °-60 °에서 기울기 시리즈를 취득 축-A 각 대상에 대 한. 참고: 기울기 각도 기계적으로 제한 될 견본 홀더 디자인. 홀더는 높은 기울기 각도에서 빔을 차단 됩니다.</li>
	<li>두 번째 기울기 시리즈를 수집 하려면 견본 홀더 90 ° 회전 합니다. 새로운 지도 획득 합니다. 해당 위치를 선택 하 고 각 대상에 대 한 축-B에 기울기 시리즈를 취득. 참고: 다른 소프트웨어 패키지, SerialEM 및 Xplore3D, 자동 데이터 수집을 위해 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>
5. 3D Tomograms 재구성 및 세그먼트 하위 볼륨 소프트웨어를 사용 하 여
<ol>
	<li>아이 모드 소프트웨어11를 사용 하 여 이중 축 기울기 이미지의 tomograms를 재구성 합니다.
	<ol>
		<li>작업 세부 사항에 대 한 사용자 설명서를 참조 하십시오.</li>
		<li>골드 표준 마커의 위치에 의해 개별 기울기 시리즈를 맞춥니다. 모두 축 A에 다시 투영 메서드 또는 동시 반복적 재구성 기법 (SIRT) 메서드에서 tomograms를 재구성 및 축-B, 각각 (그림 3).</li>
		<li>축-A의 tomograms 결합 축-b 감소 누락 쐐기 유물와 이중 기울기 tomogram 생성 하.</li>
		<li>전체 mitochondrion 볼륨을 취재 하는 개조를 직렬 섹션의 더블-틸트 tomograms 함께 가입. 모델 아이 모드 프로그램에 의해 직렬 섹션 사이의 간격.</li>
		<li>결합 된 tomograms 및 빈 볼륨 세분화에 대 한 원하는 크기 트림.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>조인 된 직렬 tomograms 3D 소프트웨어를 사용 하 여 분석 합니다.
	<ol>
		<li>작업 세부 사항에 대 한 사용자 설명서를 참조 하십시오.</li>
		<li>필터링 기능 대비 개선 하 고 배경 밀도 줄일 가우스 필터 (또는 다른 방법) tomograms.</li>
		<li>수동 또는 자동으로 미토 콘 드리 아의 열 대권 외 세그먼트.</li>
		<li>3d에서 검사 수 있도록 세분화 모델을 표시 합니다.</li>
		<li>3D에서 사용할 수 있는 도구를 사용 하 여 영화를 생성 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dahl, R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-pressure+freezing+for+the+preservation+of+biological+structure:+theory+and+practice.">High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice.</a> J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).</li><li>Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemistry+and+electron+microscopy.+The+preservation+of+cellular+ultrastructure+and+enzymatic+activity+by+aldehyde+fixation.">Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation.</a> J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).</li><li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography.">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).</li><li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+studies+by+electron+tomography:+from+cells+to+molecules.">Structural studies by electron tomography: from cells to molecules.</a> Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).</li><li>Soto, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+electron+tomography:+a+method+for+three-dimensional+reconstruction+of+large+structures.">Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures.</a> Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).</li><li>Jiang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomographic+analysis+reveals+ultrastructural+features+of+mitochondrial+cristae+architecture+which+reflect+energetic+state+and+aging.">Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging.</a> SciRep. 7, 45474 (2017).</li><li>Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Cristae:+Where+Beauty+Meets+Functionality.">Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality.</a> TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).</li><li>Friedman, J. R., Nunnari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+form+and+function.">Mitochondrial form and function.</a> Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).</li><li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated,+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon.">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).</li><li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD.">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

이 프로토콜에서 우리는 직렬 섹션 전자 단층 촬영 3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 초파리 간접 비행 근육의 연구에 적용 하기 위한 최적화 된 워크플로 설명 합니다. 샘플에서 열 대권 외의 보존은 분석의이 유형에 대 한 기본 기술 도전 이다. 위해 최고의 열 대권 외의 두 방법론 단계 포함 되었습니다. 첫째, 조직 조직 아키텍처를 가능한 한 많이 유지 블레이드 톰을 진동으로 단면에 의해 샘플링 되었다. 둘째, HPF/FS 프로토콜 포함된 견본 블록의 준비 하는 동안 세포 기관이 열 대권 외의를 유지 하기 위해 최적화 되었다. 표본 높은 압력, 물의 어는 점을 손상 열 대권 외1얼음 결정의 형성을 감소 시킨다는 동결 했다. 표본으로 0.1 m m 두께 즉시 vitrified 고 EM 분석을 위한 견본 블록을 생성 하는 대체 동결 대상이 될 수 있습니다. HPF/FS로 열 대권 외의 향상 된 보존, 화학 고정 방법에 비해 지적 했다. 이 일련의 단계를 사용 하 여 샘플 준비, 미토 콘 드 리아 이중 막과 cristae 막의 보존 극적으로 개선 되었다.
시료의 직렬 섹션을 얻는 방법의 가장 어려운 단계입니다. 으로 전자 빔 침투 전력 제한, 섹션의 두께 어느 250 또는 500 nm 200에서 가장을 사용 하 여 k v 또는 300 kV, 각각. mitochondrion의 두께 이상의 2 µ m 일 수 있으므로 직렬 섹션 전체 볼륨 복원을 얻기 위해 필요 합니다. 그러나, 전체 세포 기관이 되도록 직렬 섹션의 충분 한 수를 복구 하는 것은 기술 도전 이다. 트리밍는 사다리꼴의 기초 사이 가능한 평면 수 블록 얼굴 슬롯 눈금 더 많은 부분을 수용 하 고 따라서 더 큰 볼륨을 커버 수 있습니다. 또한, 얇은 섹션에 대 한 완벽 한 루프를 사용 하 여 직렬 섹션 그리드 전송 성공률을 증가 합니다.
표준 안에 핵심 장비와 직렬 섹션 전자 단층 촬영을 수행할 수 있습니다. 그러나, 메서드는 기술적 제한에서 발생 하는 몇 가지 피할 수 없는 제한이 있습니다. 하나는 자료 직렬 섹션, 조인된 재건에 격차를 떠나 사이 필연적으로 손실입니다. 두 번째 달성 제한 기울기 각도 때문에 발생 하는 누락 된 쐐기 유물이 이다. 이 제한에는 견본 홀더 전자 빔 차단 하지 않고 전체 회전에 설정할 수 없습니다 때문에 발생 합니다. 이러한 제한에도 불구 하 고 직렬 섹션 전자 단층 세포와 세포 기관이 열 대권 외의 차원에서 공개를 충분 한 확인을 합니다.
작은 규모 이미징, cryo 전자 단층 촬영은 고분자 복합물 및 어셈블리에 현장에서 함께 하위 단층 또는 하위 angstrom 해상도 구조를 사용할 수 있는 신흥 기술 재건축3. 이 응용 프로그램에서 셀 단면 또는 집중 된 이온 빔 액체 질소에서 밀링 thinned 있다. tomograms 분자 구조는 화학 고정, 탈수, 또는 포함 하지 않고 기본 상태에 가까운 유지 하는 곳을 알아내는-조건 하에서 수집 됩니다. 규모의 다른 쪽 끝에 해상도, 비용 큰 조직의 볼륨을 분석 하 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사 법은 매력적인 적임 비록 특정 악기4필요 합니다.

전자 현미경 subcellular 어셈블리 및 세포질 과정을 수행 하는 세포의 구조적 맥락을 연구 하는 귀중 한 도구입니다. 방법은 알데하이드와 화학 기정에 의해 조직이 나 세포의 열 대권 외를 보존 하기 위해 개발 되었습니다 또는 높은 압력에 의해 대체 (FS)1,2동결 동결 (HPF) 다음. 포함 된 견본 블록 있습니다 수 sectioned, 스테인드, 그리고 전송 전자 현미경 (TEM)으로 관찰 합니다. HPF 표본 수 또한 처리 cryo-조건 같은 곳을 알아내는 단면 또는 집중 된 이온 빔 (FIB) 밀링, 및 곳을 알아내는-EM3,4에 의해 관찰.
얇은-섹션 안에 유익한 형태학 통찰력 제공, 하지만 결과 2D 이미지만 특정 횡단면의 열 대권 외를 밝힐 수 있다. 3D 볼륨에서 열 대권 외의를 구성 하는 방법을 가려진 남아 있습니다. 세포 열 대권 외의 3 차원에서 시각화를 위해서는 전자 단층 촬영 방법 틸트 이미지의 시리즈 인수 하 고 다시 단층 촬영 개조5 (그림 1)을 생성 하 예상 했다 개발 되었다. 이중 기울기 시리즈 샘플 90 °를 회전 하 고 두 번째 기울기 시리즈를 취득 하 여 수집할 수 있습니다. 이 제한 된 샘플링 각도에서 발생 하는 tomogram의 해상도 개선 누락 쐐기 아티팩트 최소화 됩니다.
여기, 우리는 초파리 간접 비행 근육 (IFM)6,7,,89 의 열 대권 외의 미토 콘 드리 아 연구 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램 설명 . 3D 복원 전체 미토 콘 드리 아 (약 2.5 µ m 두께) 취재를 얻으려면 직렬 섹션 초파리 IFM 조직 블록에서 얻은 했다. 각 섹션의 Tomograms 자동 데이터 수집 소프트웨어를 사용 하 여 개별적으로 수집 했다. 단층 촬영 개조 했다 생성 하 고 직렬 tomograms를 전체 mitochondrion의 재건된 볼륨 아이 모드 패키지와 함께 합류 했다. 결합 된 tomograms는 3D 소프트웨어에 의해 분석 되었다. Cristae 미토 콘 드리 아의 밀도 3 차원에서 조직 공개 세분화 모델을 생성 하 세그먼트 했다.

<table><tbody><tr><td>vibrating blade microtome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>Tissue sectioning</td></tr><tr><td>high-pressure freezer</td><td>Leica</td><td>EM HPM100</td><td>Specimen preparation</td></tr><tr><td>freeze-substitution device</td><td>Leica</td><td>EM AFS2</td><td>Specimen preparation</td></tr><tr><td>ultramicrotome</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td>Ultra-thin sectioning</td></tr><tr><td>dual-axis tomography holder</td><td>Fischione</td><td>Model 2040</td><td>tomography collection</td></tr><tr><td>transmission electron microscope</td><td>FEI</td><td>Tecnai F20</td><td>tomography collection</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Gatan</td><td>UltraScan 1000</td><td>tomography collection</td></tr><tr><td>Leginon</td><td>NRAMM/AMI</td><td>tomography collection</td><td></td></tr><tr><td>IMOD</td><td>Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells</td><td>Tomography reconstruction&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Avizo 3D</td><td>FEI</td><td></td><td>Tomography analysis</td></tr></tbody></table>

3d mitochondrial ultrastructure of drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography

미토 콘 드리 아 ATP, 지질, 및 대사 산물, 뿐만 아니라 칼슘 항상성 및 세포 죽음 통제 세포 강국은. 이 세포 기관이의 독특한 cristae 풍부한 이중 막 열 대권 외 우아하게 생체를 분할 하 여 여러 기능을 수행 하기 위해 배열 된다. 열 대권 외의 미토 콘 드 리아는 연결 되어 속속들이 다양 한 기능; 그러나, 이러한 구조-기능 관계의 좋은 정보는 설명에 시작 됩니다. 여기, 우리가 초파리 간접 비행 근육의 미토 콘 드리 아 구조를 명료 하 게 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램을 보여 줍니다. 직렬 섹션 전자 단층 촬영 3 차원에서 어떤 세포질 구조 연구에 적용할 수 있습니다.

우리는 직렬 섹션 전자 단층 촬영 cristae 미토 콘 드리 아의 구조 기능 분석에 그것의 에너지 상태와 노화 반영 하 적용. 우리 초파리 IFM의 미토 콘 드리 아 통합 형성 했다 cristae 및 매트릭스 3D (그림 4)7네트워크. 또한, 미토 콘 드리 아 DNA 복제 결함 및 가속된 노화 형 돌연변이 파리 양파 모양의 소용돌이 코어 (그림 5)7의 하위 섹션을 포함 하는 미토 콘 드리 아를 축적.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig1.jpg"> 
그림 1: 전자 단층 촬영 개조 기울기 시리즈에서의 일러스트. 실험에서 전자 빔은 개체를 다양 한도로 기울이면 3D 개체를 통해 전달 됩니다. 각 기울기 조건에 대 한 2D 투영은 생성 하 고 카메라와 함께 캡처. 2D 계획은 다시 중앙 조각 정리에 따라 3D 개체를 재구성 하 예상 됩니다. 그림에서 같은 프로세스는 다양 한 기울기 각도에서 단일 차원에 투영 하는 원래 2D 이미지 표시 됩니다. 1 D 계획 다음 2D 이미지를 재구성 하는 데 사용 됩니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56567/56567fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig2.jpg"> 
그림 2: 자동 데이터 수집. 직렬 섹션을 포함 하는 슬롯 격자의 아틀라스를 보여주는 소프트웨어의 이미지 뷰어 디스플레이, 미토 콘 드리 아의 대상으로 하 고 취득 다중 스케일 이미지 기울기. 눈금 막대 = 500 µ m (왼쪽된 상단 패널), 100 µ m (왼쪽된 하단 패널), 1 µ m (오른쪽 패널). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56567/56567fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig3.jpg"> 
그림 3: 직렬 섹션 전자 초파리 간접 비행 근육에 단일 mitochondrion의 단층 촬영. 2D 현미경 (A) 및 (B) 3D tomograms는 mitochondrion의 전체 볼륨을 덮고 직렬 섹션에서. (C) 조인 된 직렬 섹션 tomograms 섹션을 만드는 한 경도, 수직으로 표시 하는 z 축으로 투영 됩니다. 특히, 조직 단면 소재, 조인된 tomograms 사이의 격차를 떠나의 손실에 지도. 눈금 막대 = 500 nm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56567/56567fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig4.jpg"> 
그림 4: 내부-미토 콘 드리 아 cristae 및 매트릭스 네트워크 차원에서 통합. (A) 조각 z 축을 통해 플레이트 막 사이 스위치를 보여주는 미토 콘 드리 아 전자 단층 촬영 개조. (B) 스위칭 오른쪽 손으로 및/또는 왼손잡이 나선 패턴 관찰된 cristae의 삽화. (C) 단층 세분화 보여주는 3 차원 (D) Cristae 스위칭 패턴에에서 왼손잡이 나선 분석 하 고 세분화 모델 (E, F)에 색상 렌더링 했다. Cristae 막 (흰색 밀도)에 걸쳐 측면 매트릭스 confluency (어두운 밀도, 빨간색으로 표시)를 보여주는 단층 쪼 갠 다. (G) 세분화 보여줍니다 측면 매트릭스 confluency (레드) (E)에 tomogram의 모델 및 대표 cristae (회색)에서. 눈금 막대 = 50 nm (A), 200 nm (C), 그리고 300 nm (D, E, F, G). 그림은 장 외 에서 무단 전재 7 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56567/56567fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig5.jpg"> 
그림 5: 양파 모양의 소용돌이 코어와 미토 콘 드리 아 노화 중 미토 콘 드리 아 DNA 복제 결함을 가진 파리에 축적. 대표적인 단층 조각 고 보여주는 횡단면 뷰 (위)와 소용돌이 코어의 경도 섹션 보기 (아래) 해당 세분화 (오른쪽 패널). 볼륨 세분화는 소용돌이 코어를 강조 하기 위해 임의의 색상 렌더링으로 표시 됩니다. 눈금 막대: 200 nm. 그림은 장 외 에서 무단 전재 7 <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56567/56567fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>단계</td>
			<td colspan="2">온도</td>
			<td colspan="2">시간</td>
			<td colspan="2">솔루션</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">--9 0 ° C 140 ° C</td>
			<td colspan="2">30 분</td>
			<td colspan="2">액체 질소</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="2">-90 ° C</td>
			<td colspan="2">96 시간</td>
			<td colspan="2">FS 칵테일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">-90 ° C ~-60 ° C</td>
			<td colspan="2">6 시간 (5 ° C/hr)</td>
			<td colspan="2">FS 칵테일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">-60 ° C</td>
			<td colspan="2">12 시간</td>
			<td colspan="2">FS 칵테일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="2">-60 ° C ~-25 ° C</td>
			<td colspan="2">7 시간 (5 ° C/hr)</td>
			<td colspan="2">FS 칵테일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">-25 ° C</td>
			<td colspan="2">12 시간</td>
			<td colspan="2">FS 칵테일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td colspan="2">-25 ° C에 0 ° C</td>
			<td colspan="2">5 시간 (5 ° C/hr)</td>
			<td colspan="2">FS 칵테일</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td colspan="2">0 ° C</td>
			<td colspan="2">1 시간 x 3 회</td>
			<td colspan="2">아세톤</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td colspan="2">방 온도</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">수 지 침투</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: 동결 대체 프로토콜입니다.

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3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 직렬 섹션 전자 단층 촬영에 의해 밝혀 초파리 간접 비행 근육의

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Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

8.5K 조회수.  National Taiwan University. 이 프로토콜, 초파리 간접 비행 근육의 미토 콘 드리 아 구조를 명료 하 게 직렬 섹션 전자 단층 촬영의 응용 프로그램 보여 줍니다.

비디오: 3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

오믹스 접근법에 대한 드로소필라 멜라노가스터 비행 근육의 해부

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

연구

유전학

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

Vivo에서 근육-힘 줄 Morphogenesis 초파리 번데기에의 이미징

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

발생학

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

마이크로 컴퓨팅 단층 촬영을 사용하여 드로소필라 멜라노가스터의 전체 동물 이미징

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

생물학

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at the Drosophila NMJ enables researchers to acquire synaptic information, encompassing both quantitative data on synapse abundance and detailed insights into their morphology. However, the diffuse distribution and limited visual range of the TEM present challenges for the ultrastructural analysis. This study introduces an innovative and efficient sample preparation method that surpasses the conventional approach. The procedure begins by placing a metal mesh at the base of a flat-bottomed bottle or test tube, followed by positioning fixed larvae samples onto the mesh. An additional mesh is placed over the samples, ensuring that they are positioned between the two meshes. The fixed samples are thoroughly dehydrated and infiltrated before proceeding with the embedding procedure. Then embedding of the samples in epoxy resin is performed in a flat sheet manner, which allows for the preparation of muscles for positioning and sectioning. Benefiting from these steps, all the muscles of Drosophila larvae can be visualized under light microscopy, therey facilitating subsequent positioning and sectioning. Excess resin is removed after locating the 6th and 7th muscles of body segments A2 and A3. Serial ultra-thin sectioning of the 6th or 7th muscle is performed.

Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae

This report provides a new sample preparation procedure for visualizing neuromuscular junctions in Drosophila Larvae. This method is more effective in preventing the curling of the samples compared to the traditional method and is particularly useful for Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

Drosophila 유충의 신경근 접합부의 투과 전자 현미경을 위한 시료 전처리 공정 최적화

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) has emerged as a valuable model system in the field of neuroscience. The application of confocal microscopy at ...

신경과학

Observation Microtubule networks in Drosophila Neuromuscular junctions and muscle cells(초파리 신경근 접합부 및 근육 세포의 미세소관 네트워크 관찰)

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

저자 스포트라이트: Understanding Microtubule Network in Drosophila Neuromuscular Junctions 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구<em&gt; 초파리</em&gt; 난소

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

3D 미토 콘 드 리아 열 대권 외의 직렬 섹션 전자 단층 촬영에 의해 밝혀 초파리 간접 비행 근육의

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오믹스 접근법에 대한 드로소필라 멜라노가스터 비행 근육의 해부

Vivo에서 근육-힘 줄 Morphogenesis 초파리 번데기에의 이미징

마이크로 컴퓨팅 단층 촬영을 사용하여 드로소필라 멜라노가스터의 전체 동물 이미징

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

Drosophila 유충의 신경근 접합부의 투과 전자 현미경을 위한 시료 전처리 공정 최적화

초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화

초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화

초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화

에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구